Wydajna produkcja i oczyszczanie rekombinowanego mysiego Kindlin-3 z komórek owadów do badań biofizycznych

Podsumowanie

Kindliny mają fundamentalne znaczenie dla adhezji komórek poprzez integryny, ale badania nad nimi były utrudnione z powodu trudności napotkanych podczas ich rekombinacyjnej ekspresji u gospodarzy bakteryjnych. Opisujemy tutaj metody ich efektywnej produkcji w komórkach owadów zakażonych bakulowirusem.

Streszczenie

Kindlins są niezbędnymi koaktywatorami, wraz z taliną, integryn receptorów na powierzchni komórki, a także uczestniczą w sygnalizacji zewnętrznej integracji i kontroli transkrypcji genów w jądrze komórkowym. Kingliny są białkami wielodomenowymi o masie ~75 kDa i wiążą się z motywem NPxY i klastrem T / S ogona cytoplazmatycznego podjednostki integryny β. Ważna hematopoetycznie izoforma kindliny, kindlin-3, ma kluczowe znaczenie dla agregacji płytek krwi podczas tworzenia skrzepliny, toczenia leukocytów w odpowiedzi na infekcję i stan zapalny oraz tworzenia podocytów osteoklastów w resorpcji kości. Rola Kindlin-3 w tych procesach zaowocowała szeroko zakrojonymi badaniami komórkowymi i fizjologicznymi. Istnieje jednak potrzeba opracowania skutecznej metody pozyskiwania wysokiej jakości miligramowych ilości białka do dalszych badań. Opracowaliśmy opisany tutaj protokół do efektywnej ekspresji i oczyszczania rekombinowanego mysiego kindlin-3 za pomocą systemu ekspresji opartego na bakulowirusie w komórkach Sf9, dających wystarczające ilości białka o pełnej długości o wysokiej czystości, aby umożliwić jego biofizyczną charakterystykę. To samo podejście można zastosować w badaniach nad innymi izoformami kindlin ssaków.

Wprowadzenie

Białka z rodziny kindlin są kluczowym składnikiem ogniskowego montażu adhezyjnego, a zatem niezbędnym dla złożonego życia. Kindliny, z których występują 3 izoformy u ssaków (kindlin-1, kindlin-2 i kindlin-3), są uważane za koaktywatory integryn receptorów zewnątrzkomórkowych wraz z taliną¹. Adhezja komórkowa za pośrednictwem integryny łączy powierzchnię komórki z macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) u wyższych eukariontów. Jest to krytyczny i powszechny proces w wielu zjawiskach fizjologicznych, które obejmują integralność tkanek, embriogenezę, metabolizm kości, hemostazę i odporność. Adhezja komórkowa za pośrednictwem integryny jest aktywowana poprzez transdukcję sygnału od wewnątrz na zewnątrz poprzez wiązanie taliny i kindliny z ogonami cytoplazmatycznymi (CT) podjednostki integryny β w ich konserwatywnych motywach NPxY. Biomedyczne znaczenie białek kindlin rozciąga się jednak aż do jądra, gdzie w kilku ostatnich doniesieniach wykazano, że kindlin-2 bierze udział w kontroli transkrypcji^2,3.

Kindlins to wielodomenowe białka o masie około 75 kDa, charakteryzujące się posiadaniem dwudzielnej C-końcowej domeny FERM (pasmo 4.1, ezryna, radixin, moesin), która jest przerywana przez domenę homologii pleckstrin (PH) w centrum jej subdomeny F2^4,5. Badania domen PH kindlin-2 i kindlin-3 wykazały, że wiąże się on z drugimi przekaźnikami lipidowymi fosfatydyloinozytolem-(3,4,5)-trifosforanem i fosfatydyloinozytolem-(4,5)-bisfosforanem^6-8. Jednak badania domeny PH kindlin-1 pokazują, że wiąże się ona z PtdIns(3,4,5)P₃ ze znacznie niższym powinowactwem, co można wytłumaczyć w kindlin-1 specyficznym dla izoformy mostkiem solnym, zapobiegającym wiązaniu lipidów⁹. Ponadto w domenie F1 kindlinów znajduje się pętla aminokwasowa ~100, która zgodnie z przewidywaniami zostanie rozwinięta, ale wiąże się z fosfatydyloseryną w wewnętrznej płatku błony komórkowej^10,11. Domena FERM Kinklin jest uważana za homologiczną do domeny FERM talin, chociaż domena FERM talin nie posiada domeny homologii pleckstrin. Zarówno kindliny, jak i talin oddziałują z motywami NPxY na ogonach β integryny za pośrednictwem regionu F3 ich domeny FERM, ale kindlin wiąże się z motywem dystalnym błony, podczas gdy talin celuje w błonę proksymalną^12-16. Kindlins i talin posiadają ponadto N-końcową domenę F0 z fałdem podobnym do ubikwityny, którego nie ma w innych białkach FERM^11,17. Badania nad domeną F0 kindlin-2 wykazały, że niezależnie wiąże się ona z błonami wzbogaconymi fosfatydyloinozytolem-(4,5)-bisfosforanem¹⁷.

Kingliny wykazują specyficzne dla paralogu wzorce ekspresji tkanek i niezbędne funkcje fizjologiczne. Kindlin-1 ulega ekspresji przede wszystkim w naskórku, ale także w mniejszym stopniu w okrężnicy, żołądku i nerkach; Kinglina-2 ulega wszechobecnej ekspresji, ale jest skoncentrowany w mięśniach prążkowanych i gładkich i jest jedynym Kinglinem wyrażanym w rozwoju embrionalnym⁴; A Kinglina-3 ulega ekspresji w tkankach krwiotwórczych, przy czym najwyższe stężenie Kindlin-3 występuje w megakariocytach¹⁸. Jednak nowsze badania sugerują, że funkcjonalne białko ulega ekspresji również w tkankach śródbłonka¹⁹.

Kindlin-3 ma duże znaczenie medyczne ze względu na jego ważną rolę fizjologiczną we krwi. Ma to kluczowe znaczenie dla agregacji i rozprzestrzeniania się płytek krwi podczas tworzenia skrzepliny²⁰, toczenia leukocytów w odpowiedzi na zakażenie i stan zapalny^21,22 oraz tworzenia podocytów osteoklastów w resorpcji kości²³. Ponadto wyczerpanie kindlin-3 u ludzi prowadzi do niedoboru adhezji leukocytów typu III - choroby charakteryzującej się zagrażającymi życiu zaburzeniami krzepnięcia i nawracającymi infekcjami bakteryjnymi^20,24,25. Badania nokautujące Kindlin-3 na myszach ujawniły kluczową funkcję białka w adhezji komórek. Myszy KIND3^-/- wykazują różne fenotypy, takie jak ciężkie krwawienie z powodu nieaktywnych integryn płytkowych, ciężka osteopetroza i upośledzona adhezja leukocytów^20,22, przypominające objawy u ludzi pozbawionych kindlin-3.

Do tej pory dane strukturalne o wysokiej rozdzielczości na kindlinach były ograniczone do indywidualnych subdomen, takich jak domena homologii pleckstrin (PH) kindlin-1⁹ i kindlin-2^26,27 oraz domena F0 kindlin-1¹¹ i kindlin-2¹⁷. Większość subdomen każdego polipeptydu kindlin oparła się jednak klonowaniu i analizie strukturalnej (Yates i Gilbert, niepublikowane obserwacje), a badania białek o pełnej długości były utrudnione przez trudności w ekspresji i oczyszczaniu wystarczających ilości przy użyciu E. coli (niepublikowane obserwacje i Harburger i wsp.¹⁴). Istnieje znaczne zainteresowanie medyczne kindlin-3 i jego funkcją, wraz z pozostałymi dwoma członkami rodziny, a ostatnio wygenerowaliśmy miligramowe ilości tego leku przez rekombinowaną ekspresję w komórkach Spodoptera frugiperda napędzanych przez zakażenie bakulowirusem¹². Dlatego opisujemy tutaj metody produkcji miligramowych ilości rekombinowanego mysiego kindlin-3 w hodowli komórek owadów, odpowiednie do rozległych badań strukturalnych i analizy biochemicznej.

W tym protokole używamy zaprojektowanego bakimdu nokautującego (BAC10_KO:1629), który sam w sobie nie jest w stanie wyprodukować żywotnych wirionów²⁸. DNA wirusa jest zatem ratowane przez rekombinację z wektorem transferowym, który w tym przypadku obejmuje również gen kindlin-3 (FERMT3) i powoduje, że gen FERMT3 zastępuje bardzo późny gen wirusa, który jest wysoce eksprymowany, ale zbędny, w wyniku czego powstaje rekombinowany wirus, który wyraża mysi kindlin-3 w ramach cyklu życiowego wirusa²⁸. Zidentyfikowaliśmy tę metodę do produkcji kindlin-3 po tym, jak próby ekspresji i oczyszczenia go w innych gospodarzach ekspresji okazały się zbyt trudne (niepublikowane obserwacje), ale także ze względu na wszechstronność zestawu wektorów pPIN, którego użyliśmy do klonowania i który może zostać wdrożony w wielu gospodarzach ekspresji²⁹.

Protokół

Ten protokół zakłada, że mysi gen kindlin-3 (FERMT3) został pomyślnie sklonowany do wektora poniżej bardzo późnego promotora p10 i że wektor posiada flankujące sekwencje bakulowirusa, które umożliwiają rekombinację z bakmidem BAC10_KO:1629 opracowanym przez I.M. Jonesa i współpracowników²⁸. Na potrzeby tego protokołu gen kindlin-3 został sklonowany do pOPINE²⁹, a zastosowane startery i strategię klonowania można znaleźć w innym miejscu¹². Plazmid jest zmodyfikowany w taki sposób, że gen FERMT3 (kindlin-3) jest pod kontrolą promotora bakulowirusa p10, a wektor zawiera 5′ UTR / ORF603 i ORF 1629 i koduje C-końcowy znacznik His₆ do dalszego oczyszczania²⁹.

1. Hodowla i utrzymanie komórek owadów

1. Przed rekombinowaną amplifikacją bakulowirusa należy hodować i utrzymywać komórki Spodoptera frugiperda przystosowane do hodowli zawiesinowej (komórki Sf9). Z komórkami owadów należy zawsze obchodzić się z użyciem technik aseptycznych w specjalnym dygestorium do hodowli tkankowych.
2. Hodowle zawiesinowe komórek owadów inkubuje się w płynnym podłożu wolnym od surowicy Sf-900 II (SFM) uzupełnionym 100 μg/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny w kolbach w temperaturze 27 °C z wytrząsaniem przy 100 obr./min.
3. Utrzymać zakres gęstości hodowli komórek owadów między 1 x 10⁶ - 1 x 10⁷ komórek/ml poprzez rozszczepienie i rozcieńczenie kultury komórkowej świeżą pożywką Sf-900 II.
   Uwaga: zdrowe komórki powinny wyglądać na jednolitej wielkości i powinny mieć kulisty kształt.
4. Policz komórki w objętości próbki za pomocą hemocytometru i mikroskopii świetlnej, aby obliczyć gęstość komórek hodowli.

2. Generacja rekombinowanego bakulowirusa

1. Hoduj i utrzymuj komórki Sf9 w zawiesinie przy użyciu pożywki Sf-900 II uzupełnionej 100 μg/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. W celu wytworzenia bakulowirusa komórki owadów należy hodować w zakresie gęstości 5 x 10⁵ - 1 x 10⁶ komórek/ml.
2. Wysiewać około 1 x 10⁶ komórek Sf9 na studzienkę sterylnej 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej w 2 ml pożywki Sf-900 II uzupełnionej 100 μg/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Pozostaw ogniwa Sf9 w temperaturze pokojowej w dygestorium, aby przylegały do podstawy studzienek z tworzywa sztucznego i w ten sposób tworzyły monowarstwę.
3. Przeprowadź rekombinowaną generację bakulowirusa poprzez kotransfekcję DNA bakmidowego i plazmidowego DNA na hodowlę jednowarstwową.
   1. Do każdej transfekcji zmieszać 1-2 μg oczyszczonego pOPINE-mFERMT3, który zawiera ORF1629 elementy bakulowirusa, z 0,5 μg oczyszczonego BAC10_KO:1629 w 100 μl Sf-900 II SFM bez antybiotyków (roztwór A).
   2. W oddzielnej probówce rozcieńczyć 6 μl odczynnika Cellfectin II ze 100 μl Sf-900 II SFM bez antybiotyków dla każdej reakcji transfekcji (roztwór B). W tym miejscu można utworzyć "mieszankę wzorcową" w celu ograniczenia obsługi cieczy, jeśli wymagana jest wiele transfekcji.
   3. Wymieszać dwa roztwory (A i B, około 200 μl) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby utworzyć kompleks lipidowo-DNA.
   4. Rozcieńczyć kompleksy lipid-DNA 800 μl Sf-900 II SFM bez antybiotyków. Ostrożnie zassać jednowarstwowe podłoże komórkowe Sf9 i ostrożnie odpipetować roztwór A/B oraz pożywkę na wierzchu monowarstwy Sf9.
   5. Inkubować transfekowane komórki w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 27 °C O/N i dodać kolejny 1 ml Sf-900 II SFM bez antybiotyków do każdej kultury jednowarstwowej następnego dnia. Inkubować komórki w temperaturze 27 °C przez kolejne 5 dni.
4. Pobrać rekombinowanego bakulowirusa bezpośrednio z pożywki hodowlanej (łącznie około 2 ml) i przenieść do czystej probówki wirówkowej (na przykład probówki Falcon o pojemności 15 ml).
   1. Sklarować wszelkie resztki komórek Sf9 przez odwirowanie w temperaturze 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze suchej masy. Przenieść wirusa, który znajduje się w powstałym supernatencie i jest oznaczony jako P1, do czystej probówki i przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności do czasu użycia. Na tym etapie pozostała monowarstwa Sf9 może być wykorzystana do oceny wytwarzania rekombinowanego wirusa poprzez ocenę obecności rekombinowanego kindlin-3 w komórkach owadów.
5. Zawiesić monowarstwę za pomocą 0,5 ml PBS i rozcieńczyć próbkę o objętości 10 μl z równą objętością 2x buforu ładującego SDS-PAGE. Podgrzewać próbki w temperaturze >95 °C przez co najmniej 10 minut.
   1. Sonikować próbkę przez 1 sekundę przy amplitudzie 10% za pomocą końcówki mikrosonografu, jeśli jest zbyt lepka do prawidłowego obciążenia żelem.

3. Amplifikacja rekombinowanego bakulowirusa

1. Do amplifikacji wirusa w zawiesinie należy użyć gęstości komórek 1,4 x 10⁶ komórek/ml, która powinna zajmować 1/20 całkowitej objętości kolby (tj. 50 ml kultury w kolbie o pojemności 2 l).
2. Osiągnąć amplifikację rekombinowanego wirusa poprzez zakażenie hodowli komórek owadów zapasem wirusa P1 przy wielokrotności infekcji (MOI) 0,1 przy użyciu następującego wzoru;
   
   Uwaga: Można założyć, że oczekiwane miano wirusa generacji P1 wynosi 1 x 10⁷ pfu/ml. Jednak przed tym etapem można przeprowadzić test płytki nazębnej.
3. Inkubować kulturę owadów zakażonych P1 w temperaturze 27 °C, wytrząsając przy 100 obr./min przez 3 dni (72 godz.).
4. Zebrać wirusa, oddzielając komórki od pożywki przez wirowanie przy 1,000 x g przez 5 minut w temperaturze suchej częstotliwości. Na tym etapie należy zachować otrzymaną osadkę komórkową w celu potwierdzenia produkcji rekombinowanego wirusa poprzez ocenę ekspresji białka kindlin-3 za pomocą SDS-PAGE i western blotting.
5. Przenieść oczyszczoną pożywkę wzbogaconą w wirusa do czystej probówki i przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności do czasu użycia. Ten szczep wirusowy jest oznaczony jako P2.
   Uwaga: Można przewidzieć miano wirusa 2 x 10⁸ pfu/ml (lub szybkość amplifikacji 100 pfu/komórkę).

4. Ekspresja kindlin-3 w Sf9 zakażonym bakulowirusem

1. Hoduj odpowiednią objętość kultur komórek Sf9 w zawiesinie w Sf-900 II SFM uzupełnionym 100 μg/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny, przed ekspresją rekombinowanego kindlin-3 na dużą skalę w celu oczyszczenia. Inkubować kultury w zawiesinie w temperaturze 27 °C, wytrząsając przy prędkości 100 obr./min, przy stosunku całkowitej objętości kultury do objętości kolby wynoszącym 1:5.
2. Infekować kultury zawiesinowe Sf9 o gęstości 2 x 10⁶ komórek/ml.
3. Uzupełnij kultury Sf9 o końcowym stężeniu 1% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS), a następnie amplifikowanym rekombinowanym wirusem (szczep wirusa P2), aby uzyskać MOI 1. Inkubować zakażone kultury w temperaturze 27 °C, wytrząsając przy 100 obr./min.
4. Zebrać rekombinowane komórki Sf9 z ekspresją kindlin-3-CHIS₆ 72 godziny po zakażeniu przez odwirowanie w temperaturze 1 000 x g, a otrzymane osady komórkowe przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia lub -80 °C w przypadku długotrwałego przechowywania.

5. Oczyszczanie rekombinowanego Kindlin-3

1. Rozmrozić zamrożone granulki komórek owadów zakażonych bakulowirusem (Sf9) wyrażające rekombinowany kindlin-3 na lodzie.
2. Ponownie zawiesić rozmrożony osad komórkowy za pomocą buforu do lizy (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 1% (v/v) Tween-20), uzupełnionego koktajlem inhibitorów proteazy wolnym od EDTA i 1,000-2,000 U DNazy1,
   Uwaga: Alternatywnie można również zastosować zmodyfikowaną sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), w której stężenie NaCl jest dostosowane do 500 mM, aby zapobiec niespecyficznym interakcjom między endogennymi białkami komórek Sf9 a kolumną powinowactwa do unieruchomionego metalu używaną do dalszego oczyszczania (patrz poniżej).
3. Lizować komórki, inkubując zawieszone komórki z detergentem i wirując. Sonikować (40% amplitudy, 10 cykli 10-sekundowego impulsu, a następnie 10-sekundowe chłodzenie) próbkę w celu dalszego rozerwania komórek w łaźni lodowej lub alternatywnie użyć homogenizatora Dounce.
4. Klarować lizat przez odwirowanie w temperaturze 48 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Otrzymany supernatant załadować do kolumny HisTrap (objętość kolumny 5 ml), wstępnie zrównoważonej buforem do lizy, w temperaturze 4 °C z szybkością 1 ml/min.
   Uwaga: Alternatywnie, oczyszczony lizat można inkubować w złożu o objętości 1–5 ml wstępnie zrównoważonych kulek sefarozy niklu (np. Ni Sepharose 6 o szybkim przepływie) w temperaturze 4 °C przez 1–2 godziny. Kolumna sefarozy Ni może być uformowana po etapie wiązania za pomocą kolumny przepływu grawitacyjnego.
5. Przepłukać kolumnę 10 objętościami buforu płuczącego (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 10 mM imidazol) w celu usunięcia niezwiązanych białek.
6. Zastosować liniowy gradient imidazolu od 10-500 mM z szybkością 10 mM/ml (lub w objętościach 10 kolumn) za pomocą Äkta FPLC do elucji związanego rekombinowanego kindlin-3-CHIS₆.
7. Frakcjonować elucję na frakcje o wielkości 0,5-1 ml za pomocą Äkta FPLC, przy czym frakcje zawierające kindlin-3-CHIS₆ zwykle eluują przy stężeniu imidazolu 300 mM.
8. Ocenić skład białkowy eluantu za pomocą SDS-PAGE i przy pierwszym oczyszczeniu potwierdzić za pomocą western blot przy użyciu przeciwciała anty-His₆ lub przeciwciała anty-mysiego kindlin-3.
9. Połączyć frakcje zawierające kindlin-3 i wymianę buforową w 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl poprzez serię rozcieńczeń do stężeń buforu i próbki przy użyciu odśrodkowego koncentratora białek z punktem odcięcia masy cząsteczkowej 50 kDa (MWCO) w temperaturze 4 °C.
   Uwaga: Alternatywnie, dializować roztwór białka za pomocą kasety do dializy Slide-A-lyzer z MWCO 30 kDa w 4 °C przez 4 godziny do O/N do 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl.
   Uwaga: w przypadku wymiany jonowej (patrz poniżej) można zastosować niższe stężenie NaCl, tj. 50 mM.
10. Nałożyć roztwór białka wymienianego buforem na wstępnie zrównoważoną kolumnę HP heparyny HiTrap (objętość kolumny 5 ml) przy użyciu Äkta FPLC z szybkością 0,5 ml/min.
    Uwaga: Związany kindlin-3 jest eluowany za pomocą liniowego gradientu NaCl (0,2 M NaCl do 1 M NaCl) w tym samym buforze, zwiększając się z szybkością 10 mM/ml. Oczekuje się, że Kindlin-3-CHIS6 będzie eluował przy ~0,6 M NaCl.
11. Frakcjonować elucję na frakcje o objętości 0,5-1 ml i ocenić skład białka za pomocą SDS-PAGE i western blot, jeśli to konieczne.
    Uwaga: można oczekiwać czystości białka bliskiej 95%, zgodnie z oceną SDS-PAGE.
12. Pula frakcji zawierających kindlin-3 i koncentrat za pomocą koncentratora białka wirówkowego z MWCO 50 kDa do końcowej objętości 0,5-2 ml.
13. W ostatnim etapie wypoleruj skoncentrowane białko i wymień bufor białka za pomocą chromatografii wykluczania wielkości (SEC).
    1. Nałożyć oczyszczone białko na Superdex S200 (16/60) lub (10/30) wstępnie zbalansowane w 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl, 1 mM DTT z szybkością 1 ml/min lub 0,5 ml/min w zależności od użytej wielkości kolumny.
       Uwaga: W razie potrzeby chromatografię wykluczającą wielkość można również przeprowadzić w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS).
    2. Oczyść białka zgodnie z wielkością, nakładając bufor na kolumnę z szybkością 1 ml/min lub 0,5 ml/min, w zależności od użytej wielkości kolumny.
       Uwaga: Białko eluowane z kolumny jest frakcjonowane i monitorowane przy użyciu absorbancji przy 280 nm.
    3. Należy spodziewać się pojedynczego piku absorbancji z SEC, który jest frakcjonowany i oceniany przez SDS-PAGE w celu określenia jednorodności i zwykle ma czystość >95% po tym etapie.
14. Zagęścić oczyszczony kindlin-3-CHIS₆ za pomocą koncentratora białka wirówki o MWCO od 50 kDa do ~15 mg / ml, zgodnie z oceną spektrofotometryczną przy użyciu obliczonego współczynnika ekstynkcji (ε) 109,320 ^{M-1 cm-1} (przy założeniu, że wszystkie reszty cysteiny są zredukowane).
15. W przypadku przechowywania w temperaturze -20 °C i długotrwałego przechowywania w temperaturze -80 °C, należy podzielić białko na porcje do probówek PCR i błyskawicznie zamrozić próbki w ciekłym azocie. Alternatywnie, białko może być wykorzystane bezpośrednio do badań przy użyciu szeregu technik biochemicznych i biofizycznych.

Wyniki

Ekspresja na dużą skalę rekombinowanego mysiego kindlin-3 przy użyciu komórek Sf9 zakażonych bakulowirusem może potrzebować mniej niż dwa tygodnie, aby osiągnąć miligramowe ilości, jak pokazano na schemacie Rysunek 1A i wymaga tylko niewielkiej ilości plazmidowego DNA, na przykład z zestawu QIAprep Miniprep. Wytwarzanie rekombinowanego bakulowirusa osiąga się poprzez kotransfekcję komórek Sf9 z mysim plazmidem zawierającym kindlin-3 (FERMT3) wraz z zmodyfikowanym linearyzowanym bakcydem (BAC10: KO₁₆₂₉) i zbieranie nowo powstałych wirionów po 5-7 dniach, jak pokazano na rysunku 1A. Ta metoda generowania bakulowirusa daje w wyniku 100% rekombinowane wirusy i zasadniczo eliminuje potrzebę oczyszczania płytki nazębnej^28,30. Reprezentatywna hodowla na małą skalę (2 ml jednowarstwowa) pozwoli wytworzyć rekombinowany roztwór zawierający wirusa o oczekiwanym mianie wirusa wynoszącym 1 x^10,7 jednostek tworzących płytki miażdżycowe (pfu) na ml hodowli. Można przeprowadzić test płytki nazębnej w celu określenia rzeczywistego miana wirusa, ale jest to być może zbyt pracochłonne, gdy duża liczba konstruktów jest testowana do badań strukturalnych. Powodzenie etapu generowania wirusa można ocenić przy użyciu równolegle plazmidu zawierającego eGFP lub, dla tego konstruktu kindlin-3, monowarstwę Sf9 można ponownie zawiesić w PBS i ocenić za pomocą SDS-PAGE i western blot, który zazwyczaj wykazuje wyraźne prążki odpowiadające białku znakowanemu Hisem o masie 75 kDa, jak pokazano na rysunku 1B. Wirus jest następnie amplifikowany w celu wytworzenia wystarczających ilości do zakażenia komórkami owadów na dużą skalę (objętości litrów) i izolacji rekombinowanego białka. Wirus drugiego pasażu (P2) jest generowany przez zakażenie kultur zawiesinowych o szacowanym MOI 0,1 (patrz protokół). Istotne jest, aby kultura zawiesiny Sf9 ze wzmocnieniem zajmowała tylko jedną dwudziestą całkowitej objętości kolby. To dodatkowe napowietrzenie zapewnia, że powstałe pożywki zawierające wirusa, zebrane po 3 dniach (72 godzinach) po zakażeniu, wytworzą wystarczające ilości kindlin-3 w późniejszej kulturze ekspresji. Zakłada się, że amplifikowany zapas wirusa (P2) ma oczekiwane miano wirusa 2 x 10⁸ pfu/ml w oparciu o konserwatywne oszacowanie 100 pfu/komórkę przy użyciu gęstości komórek 2 x 10⁶ komórek/ml podczas amplifikacji³¹. Ogólnie rzecz biorąc, dla optymalnej amplifikacji bakulowirusa i produkcji białek, komórki Sf9 powinny być jednorodne pod względem wielkości i kuliste, jak pokazano na rysunku 1C. Ponadto amplifikacja wirusa i ekspresja białka są maksymalne po 72 godzinach od zakażenia i są znacznie zmniejszone po 96 godzinach po zakażeniu.

Po amplifikacji wirusa i użyciu go do infekowania komórek Sf9 w eksperymentach na dużą skalę, rekombinowany kindlin-3 jest częściowo oczyszczany dzięki zaprojektowanemu C-terminalowi His_6-tag przy użyciu immobilizowanej chromatografii powinowactwa do metalu, jak pokazano na rysunku 2. Ważne jest, aby przeprowadzić oczyszczanie w temperaturze 4 °C i dodać wystarczającą ilość inhibitorów proteazy, aby zapobiec proteolizie. Częściowo oczyszczony kindlin-3 jest dalej oczyszczany do prawie jednorodności za pomocą chromatografii jonowymiennej (IEC) przy użyciu kolumny heparyny, jak pokazano na rysunku 3. Zastosowaliśmy użycie kolumny heparyny zamiast konwencjonalnej kolumny jonowej, ponieważ przewidywaliśmy, że duża liczba reszt zasadowych, w tym odcinek polilizyny w domenie kindlin-3 F1, będzie silnie oddziaływać z ujemnie naładowanymi grupami siarczanowymi kolumny. Strategia ta jest szczególnie przydatna w przypadku białek wiążących DNA i RNA z podstawowymi łatami wiążącymi kwasy nukleinowe, na przykład końcową urydylilotransferazą wiążącą RNA Cid1³². Na koniec czystość kindlin-3 jest "polerowana" przez chromatografię wykluczania wielkości w celu usunięcia agregatów i osiągnięcia jednorodności, jak pokazano na rysunku 4. określone w protokołach są standardowymi często stosowanymi w oczyszczaniu białek do analizy strukturalnej. Ogólnie rzecz biorąc, unika się na bazie fosforanów do oczyszczania białek w badaniach strukturalnych, zwłaszcza w badaniach przesiewowych krystalizacji ze względu na tworzenie się kryształów fosforanu w kroplach krystalizacji (szczególnie w przypadku eksperymentów w temperaturze 4 °C). Przeprowadziliśmy jednak test przesunięcia termicznego oparty na termofluorze, aby określić, które stabilizują się dla kindlin-3, jak pokazano na rysunku 5. Krótko mówiąc, oczyszczony roztwór białka rozcieńcza się do, które obejmują zakres stężeń pH i chlorku sodu, tworząc w ten sposób 2-wymiarowe sito. Topnienie białka mierzy się, obserwując fluorescencję pomarańczowego barwnika Sypro (sondy molekularne), który wiąże się z resztami hydrofobowymi w pofałdowanym rdzeniu białkowym, w zakresie temperatur 20-95 °C (293-368 K). Punkt środkowy temperatury, w którym rozwija się białko (temperatura przejścia, T_m) został obliczony za pomocą oprogramowania Opticon Monitor i jest opisany w innym miejscu³³. Zaobserwowano, że Kindlin-3 jest stabilny przy wysokich stężeniach chlorku sodu (500 mM) w zakresie pH 7,0-9,0, przy stałej temperaturze przejścia (T_m) wynoszącej 55 °C. Zaobserwowano również, że T_m Kindlin-3 wynosił około 55 °C w zakresie pH 7,0-7,5 niezależnie od stężenia chlorku sodu.

Stwierdziliśmy, że proteoliza kindlin-3 była ograniczona podczas oczyszczania, ale analiza SDS-PAGE wysoko skoncentrowanego białka (~15 mg/ml) wykazała ograniczone zanieczyszczenie dwoma dodatkowymi polipeptydami o jednakowej intensywności. Co dziwne, nie ma jednak żadnych wskazówek dotyczących dodatkowych gatunków ze względu na chromatografię wykluczającą rozmiar, jak pokazano na rysunku 4. Uważa się zatem, że białko jest nacinane przez proteazy, ale pozostaje pofałdowane i hydrodynamicznie nie do odróżnienia od białka o pełnej długości. Co ciekawe, kalpaina jest znaną proteazą, która rozszczepia kindlin-3 w Tyrozynie373, która znajduje się w pętli β1-β2 domeny homologii pleckstrin (PH)³⁴ i może wyjaśniać nasze obserwacje. Co więcej, western blotting ujawnia, że jeden z dubletów polipeptydowych posiada C-końcowy znacznik His, a pozorna masa cząsteczkowa dubletu, po zsumowaniu, wynosi 75 kDa, czyli taką samą masę cząsteczkową jak białko natywne. Wydajność oczyszczonego rekombinowanego kindlinu-3 na litr komórek Sf9 (~ 2 g masy komórki) wynosi w najlepszym przypadku 5 mg.

Rycina 1. Przegląd ekspresji heterologicznych białek w komórkach owadów zakażonych bakulowirusem. (A) Schematyczny przegląd generacji bakulowirusa i ekspresji kindlin-3 w komórkach Sf9. Na schemacie wektora DNA 5'UTR/ORF603 jest pokolorowany na czerwono, ORF1629 jest pokolorowany na zielono, a gen białka będącego przedmiotem zainteresowania (POI) jest pokolorowany na niebiesko. oraz Western blot, przy użyciu przeciwciała anty-His₆, sześciu małych (2 ml monowarstwowych) kultur (pasy znakowane zgodnie z hodowlą) komórek Sf9 wytwarzających rekombinowanego bakulowirusa i rekombinowaną mysią kindlinę-3. (C) Obraz z mikroskopii świetlnej zdrowych komórek Sf9 wyhodowanych w zawiesinie w Sf-900 II SFM uzupełnionych antybiotykami i przeniesionych do naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 35 mm (patrz protokół). Obraz ma 20-krotne powiększenie.

Rysunek 2.Reprezentatywne oczyszczanie kindlin-3 metodą chromatografii powinowactwa do unieruchomionego metalu (IMAC).SDS-PAGE oczyszczonego powinowactwa do niklu rekombinowanego mysiego kindlin-3 ulegającego ekspresji w komórkach Sf9 zakażonych bakulowirusem (~ 2 g masy komórki). Zaadsorbowane białko eluowano za pomocą gradientu imidazolu (pokazanego nad żelem). Pasy ruchu są oznaczone w następujący sposób: MW, marker masy cząsteczkowej; Lys, lizat całokomórkowy; FT, przepływ przez (niezwiązany); WI, pranie 1; WII, pranie 2. Przeprowadzono również analizę Western blot (poniżej) przy użyciu frakcji elucyjnych, aby potwierdzić obecność zmodyfikowanego znacznika His na rekombinowanym białku. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3. Reprezentatywne oczyszczanie kindliny-3 metodą chromatografii powinowactwa heparyny. (A) Profil elucji obserwowany przy 280 nm (niebieski) wykazujący pojedynczy symetryczny pik eluujący w liniowym gradieniu chlorku sodu (zielony) przy użyciu zakresu stężeń NaCl 0,05-1,0 M. (B) Analiza SDS-PAGE frakcjonowanej elucji wykazująca obecność białka 75 kDa, kindlin-3 (oznaczonego K3). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4.Reprezentatywna chromatografia z filtracją żelową i skoncentrowany kindlin-3. (A) Profil elucji w postaci filtracji żelowej oczyszczonego kindlin-3 przy użyciu Superdex S200 (16/60) w Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl i 1 mM DTT w temperaturze 20 °C. W oparciu o objętość elucji, kindlin-3 migruje zgodnie z oczekiwaniami dla białka 75 kDa, co sugeruje, że jest głównie monomeryczny. (B) SDS-PAGE wysoko skoncentrowanego, oczyszczonego rekombinowanego kindlin-3 w stężeniu 14,5 mg/ml. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5.Test przesunięcia termicznego oparty na termofluorze do badań przesiewowych. Kindlin-3 rozcieńczono do różnych zawierających dwuwymiarowe badanie przesiewowe pH w stosunku do stężenia chlorku sodu. Temperatury przejścia (punkty środkowe temperatury) obserwowano za pomocą fluorescencji barwnika związanego hydrofobowo, oranżu Sypro (sondy molekularne) i obliczono za pomocą oprogramowania Opticon Monitor. (A) Wykres 3D temperatur przejścia jest wykreślany wraz z (B) zmianą temperatury przejścia w stosunku do obliczonej średniej 50,4 °C. Dla jasności słupki są pokolorowane zgodnie z zakresem temperatur, którym odpowiadają. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Systemy ekspresji bakulowirusa stają się coraz bardziej popularne i stanowią ważne narzędzie do produkcji miligramowych ilości rekombinowanego białka do charakteryzowania białek za pomocą badań biofizycznych, w tym krystalografii rentgenowskiej. Pomimo tego, że są bardziej wymagające eksperymentalnie, systemy ekspresji bakulowirusa mają kilka zalet w porównaniu z E. coli , jedną z nich jest prawie natywne środowisko dla białek pochodzenia eukariotycznego , np. obecność odpowiednich białek opiekuńczych i możliwość modyfikacji potranslacyjnej. W naszych własnych wysiłkach na rzecz ekspresji kindlin-3 użyto alternatywnych gospodarzy ekspresji, w tym linii komórkowych ssaków i szczepów ekspresyjnych bakterii (niepublikowane obserwacje). Ogólnie rzecz biorąc, wiele testowanych szczepów E. coli wytwarzało bardzo małe ilości rekombinowanego kindlinu-3 (~0,5 mg/L hodowli; obserwacje niepublikowane). Jednak ekspresja sterowana przez bakulowirusa w komórkach owadów była szczególnie skuteczna i, w porównaniu z przejściową ekspresją w komórkach ssaków, bardziej podatna na generowanie dużej biomasy wymaganej do wyizolowania miligramów rekombinowanych białek cytoplazmatycznych (obserwacje niepublikowane). Spekulujemy, że obecność eukariotycznych białek opiekuńczych może pozwolić na wydajną produkcję kindlin-3.

Baculoviridae infekują komórki owadów, a do rekombinowanej ekspresji białek bakulowirus użyty w tej pracy jest oparty na wirusie polihedrozy jądrowej Autographa californica (AcNPV). W naturze AcNPV, który infekuje larwy owadów Autographa californica (lucerna nożycowata), wymaga białka polihedryny do tworzenia okluzji, w wyniku których wirony są zamknięte w krystalicznej matrycy białkowej, zapewniając w ten sposób niezbędną ochronę do ich uwalniania. W hodowanych komórkach tworzenie ciał okluzyjnych nie jest wymagane do replikacji i dlatego jest zbędne. W przypadku ekspresji obcych białek gen białka polihedryny może zostać zastąpiony rekombinowanym AcNPV genem białka będącego przedmiotem zainteresowania. AcNPV może infekować inne gatunki Lepidopteron i do celów rekombinowanej ekspresji białek stosuje się komórki jajnika Spodoptera frugiperda . W przedstawionym tutaj podejściu, bakmid AcNPV (BAC10) jest modyfikowany w taki sposób, że niezbędny gen wirusa, ORF1629, jest inaktywowany przez wprowadzenie acetylotransferazy chloramfenikolu, co prowadzi do nokautującego bakmidu (BAC10: KO₁₆₂₉), tak że nie jest on w stanie tworzyć zakaźnych bakulawirionów²⁸. Kotransfekcja komórek Sf9 ze zlinearyzowanym BAC10: KO₁₆₂₉ i wektorem transferowym zawierającym FERMT3 naprawia nieaktywne ORF1629 poprzez transpozycję, w wyniku czego powstaje żywotny genom, który zawiera również gen FERMT3 pod kontrolą promotora polihedryny²⁸.

Opisujemy protokół oczyszczania do izolacji wysoce czystego rekombinowanego mysiego kindlin-3 za pomocą trzyetapowego podejścia chromatograficznego. Metody zastosowane tutaj można z łatwością zastosować do innych białek znakowanych przez Hisa. Zastosowaliśmy etap wymiany jonowej w celu dalszego oczyszczenia kindlin-3, ale uważamy, że jest to kolejny etap pseudo-powinowactwa, ponieważ kindlin-3 posiada dużą liczbę podstawowych reszt, w tym rozciąganie polilizyny w domenie F1. Ponadto uważa się, że kindlin-3 wiąże się i oddziałuje z cytoplazmatyczną powierzchnią błony plazmatycznej, gdzie funkcjonuje, dlatego przewidujemy, że grupowanie podstawowych reszt pozwoli białku przeciwdziałać ujemnie naładowanej błonie.

opisane w protokołach oczyszczania są uważane za standardowe i są często stosowane w biologii strukturalnej. Test termofluorowy (ryc. 5) pokazuje, że kindlin-3 jest stabilny w większości warunków buforowych powyżej pH 6,0. Było to szczególnie przydatne i ważne dla informowania o naszych eksperymentach podczas badania interakcji ogona kinldin-3:β1_A za pomocą NMR, która dała doskonałe widma przy pH 6,1 przy niskich stężeniach NaCl¹².

Zanim będzie można przeprowadzić jakiekolwiek badanie biofizyczne, ważne jest, aby wykazać, że oczyszczone białko, które jest przedmiotem zainteresowania, jest rzeczywiście prawidłowo sfałdowane i jest funkcjonalnie aktywne. W poprzedniej publikacji wykazaliśmy, że rekombinowany kindlin-3 wyrażany i oczyszczany tą metodą był monomerem i monodyspersją w roztworze, co oceniano za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar, dynamicznego rozpraszania światła, analitycznego ultrawirowania i rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem, a także był zdolny do wiązania i rozpoznawania dystalnego NPxY błony i poprzedzającego klastra seryny / treoniny ogonów cytoplazmatycznych β^{1A 14}, potwierdzając w ten sposób, że zachowuje się jak białko natywne, co jest zgodne z wcześniejszymi badaniami komórkowymi i fizjologicznymi^14,20,22. Zastosowanie testu stabilności termicznej jest dodatkowym sposobem sugerowania prawidłowego fałdowania białka będącego przedmiotem zainteresowania, ponieważ nieprawidłowo sfałdowane białko spowoduje tło o wysokiej fluorescencji z powodu odsłoniętych reszt hydrofobowych.

Rodzina białek kindlin znalazła się w centrum uwagi od czasu odkrycia ich nieoczekiwanej roli jako niezbędnych koaktywatorów integryn in vivo . Spowodowało to wiele wysiłku, aby wyrazić je rekombinacyjnie i rozwiązać ich struktury. Do tej pory odnotowano ograniczone sukcesy w ekspresji miligramowych ilości rekombinowanego białka o pełnej długości, ale tutaj opisaliśmy zastosowanie systemu bakulowirusa, który pozwala na ekspresję na dużą skalę na poziomach, na których możliwe stają się badania strukturalne. Spodziewamy się, że wytwarzając duże ilości rekombinowanego kindlinu-3, pomoże to w dalszych badaniach nad tym białkiem. Metoda oparta na bakulowirusie i opisany tutaj przepływ oczyszczania dla rekombinowanego mysiego kindlin-3 może być również wykorzystana do ekspresji i oczyszczania innych izoform kindlin, które są również trudne do ekspresji, a także posiadają odcinki polilizyny, i mogą być dalej przystosowane do innych białek cytoplazmatycznych, takich jak białka wiążące kwasy nukleinowe, które nie ulegają ekspresji w szczepach bakteryjnych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sf-900 II pożywka bez surowicy (SFM) 1x płyn	Life Technologies	10902-096	przechowywać w 4 stopniach; C i podgrzać do RT przed użyciem
Odczynnik Cellfectin II	Invitrogen	10362-100	Alternatywnie można użyć odczynnika do transfekcji GeneJuice (EMD)
Siarczan streptomycyny (stały)	Melford	S0148	Filtr sterylizacyjny (0,22 μ m filtr) przed użyciem
Penicylina G, sól potasowa (stała)	Melford	P0580	Sterylizuj filtr (0,22 μ m filter) przed użyciem
CELLSTAR Sterylna 6-dołkowa płytka hodowlana	Greiner Bio-One	657160
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Life Technologies	10100-147
Koktajl inhibitorów proteazy	Sigma	P8849	Uwaga: Inhibitory proteazy rozpuszcza się w DMSO
Deoksyrybonukleaza (Dnaza) z trzustki bydlęcej (Dnaza) I	Sigma	D5025
HisTrap FF (5 ml)	GE Heathcare	17-5286-01	Wymaga Ä kta FPLC
maszyna HiTrap Heparyna (5 ml)	GE Heathcare	17-0407-01	Wymaga Ä Maszyna kta FPLC
Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-15 (z membraną Ultracel-50)	Milipora	UFC905024	pojemności 15 ml i MWCO koncentratora białek 50 kDa