Wydajna produkcja i oczyszczanie rekombinowanego mysiego Kindlin-3 z komórek owadów do badań biofizycznych

Podsumowanie

Kindliny mają fundamentalne znaczenie dla adhezji komórek poprzez integryny, ale badania nad nimi były utrudnione z powodu trudności napotkanych podczas ich rekombinacyjnej ekspresji u gospodarzy bakteryjnych. Opisujemy tutaj metody ich efektywnej produkcji w komórkach owadów zakażonych bakulowirusem.

Streszczenie

Kindlins są niezbędnymi koaktywatorami, wraz z taliną, integryn receptorów na powierzchni komórki, a także uczestniczą w sygnalizacji zewnętrznej integracji i kontroli transkrypcji genów w jądrze komórkowym. Kingliny są białkami wielodomenowymi o masie ~75 kDa i wiążą się z motywem NPxY i klastrem T / S ogona cytoplazmatycznego podjednostki integryny β. Ważna hematopoetycznie izoforma kindliny, kindlin-3, ma kluczowe znaczenie dla agregacji płytek krwi podczas tworzenia skrzepliny, toczenia leukocytów w odpowiedzi na infekcję i stan zapalny oraz tworzenia podocytów osteoklastów w resorpcji kości. Rola Kindlin-3 w tych procesach zaowocowała szeroko zakrojonymi badaniami komórkowymi i fizjologicznymi. Istnieje jednak potrzeba opracowania skutecznej metody pozyskiwania wysokiej jakości miligramowych ilości białka do dalszych badań. Opracowaliśmy opisany tutaj protokół do efektywnej ekspresji i oczyszczania rekombinowanego mysiego kindlin-3 za pomocą systemu ekspresji opartego na bakulowirusie w komórkach Sf9, dających wystarczające ilości białka o pełnej długości o wysokiej czystości, aby umożliwić jego biofizyczną charakterystykę. To samo podejście można zastosować w badaniach nad innymi izoformami kindlin ssaków.

Wprowadzenie

Białka z rodziny kindlin są kluczowym składnikiem ogniskowego montażu adhezyjnego, a zatem niezbędnym dla złożonego życia. Kindliny, z których występują 3 izoformy u ssaków (kindlin-1, kindlin-2 i kindlin-3), są uważane za koaktywatory integryn receptorów zewnątrzkomórkowych wraz z taliną¹. Adhezja komórkowa za pośrednictwem integryny łączy powierzchnię komórki z macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) u wyższych eukariontów. Jest to krytyczny i powszechny proces w wielu zjawiskach fizjologicznych, które obejmują integralność tkanek, embriogenezę, metabolizm kości, hemostazę i odporność. Adhezja komórkowa za pośrednictwem integryny jest aktywowana poprzez transdukcję sygnału od wewnątrz na zewnątrz poprzez wiązanie taliny i kindliny z ogonami cytoplazmatycznymi (CT) podjednostki integryny β w ich konserwatywnych motywach NPxY. Biomedyczne znaczenie białek kindlin rozciąga się jednak aż do jądra, gdzie w kilku ostatnich doniesieniach wykazano, że kindlin-2 bierze udział w kontroli transkrypcji^2,3.

Kindlins to wielodomenowe białka o masie około 75 kDa, charakteryzujące się posiadaniem dwudzielnej C-końcowej domeny FERM (pasmo 4.1, ezryna, radixin, moesin), która jest przerywana przez domenę homologii pleckstrin (PH) w centrum jej subdomeny F2^4,5. Badania domen PH kindlin-2 i kindlin-3 wykazały, że wiąże się on z drugimi przekaźnikami lipidowymi fosfatydyloinozytolem-(3,4,5)-trifosforanem i fosfatydyloinozytolem-(4,5)-bisfosforanem^6-8. Jednak badania domeny PH kindlin-1 pokazują, że wiąże się ona z PtdIns(3,4,5)P₃ ze znacznie niższym powinowactwem, co można wytłumaczyć w kindlin-1 specyficznym dla izoformy mostkiem solnym, zapobiegającym wiązaniu lipidów⁹. Ponadto w domenie F1 kindlinów znajduje się pętla aminokwasowa ~100, która zgodnie z przewidywaniami zostanie rozwinięta, ale wiąże się z fosfatydyloseryną w wewnętrznej płatku błony komórkowej^10,11. Domena FERM Kinklin jest uważana za homologiczną do domeny FERM talin, chociaż domena FERM talin nie posiada domeny homologii pleckstrin. Zarówno kindliny, jak i talin oddziałują z motywami NPxY na ogonach β integryny za pośrednictwem regionu F3 ich domeny FERM, ale kindlin wiąże się z motywem dystalnym błony, podczas gdy talin celuje w błonę proksymalną^12-16. Kindlins i talin posiadają ponadto N-końcową domenę F0 z fałdem podobnym do ubikwityny, którego nie ma w innych białkach FERM^11,17. Badania nad domeną F0 kindlin-2 wykazały, że niezależnie wiąże się ona z błonami wzbogaconymi fosfatydyloinozytolem-(4,5)-bisfosforanem¹⁷.

Kingliny wykazują specyficzne dla paralogu wzorce ekspresji tkanek i niezbędne funkcje fizjologiczne. Kindlin-1 ulega ekspresji przede wszystkim w naskórku, ale także w mniejszym stopniu w okrężnicy, żołądku i nerkach; Kinglina-2 ulega wszechobecnej ekspresji, ale jest skoncentrowany w mięśniach prążkowanych i gładkich i jest jedynym Kinglinem wyrażanym w rozwoju embrionalnym⁴; A Kinglina-3 ulega ekspresji w tkankach krwiotwórczych, przy czym najwyższe stężenie Kindlin-3 występuje w megakariocytach¹⁸. Jednak nowsze badania sugerują, że funkcjonalne białko ulega ekspresji również w tkankach śródbłonka¹⁹.

Kindlin-3 ma duże znaczenie medyczne ze względu na jego ważną rolę fizjologiczną we krwi. Ma to kluczowe znaczenie dla agregacji i rozprzestrzeniania się płytek krwi podczas tworzenia skrzepliny²⁰, toczenia leukocytów w odpowiedzi na zakażenie i stan zapalny^21,22 oraz tworzenia podocytów osteoklastów w resorpcji kości²³. Ponadto wyczerpanie kindlin-3 u ludzi prowadzi do niedoboru adhezji leukocytów typu III - choroby charakteryzującej się zagrażającymi życiu zaburzeniami krzepnięcia i nawracającymi infekcjami bakteryjnymi^20,24,25. Badania nokautujące Kindlin-3 na myszach ujawniły kluczową funkcję białka w adhezji komórek. Myszy KIND3^-/- wykazują różne fenotypy, takie jak ciężkie krwawienie z powodu nieaktywnych integryn płytkowych, ciężka osteopetroza i upośledzona adhezja leukocytów^20,22, przypominające objawy u ludzi pozbawionych kindlin-3.

Do tej pory dane strukturalne o wysokiej rozdzielczości na kindlinach były ograniczone do indywidualnych subdomen, takich jak domena homologii pleckstrin (PH) kindlin-1⁹ i kindlin-2^26,27 oraz domena F0 kindlin-1¹¹ i kindlin-2¹⁷. Większość subdomen każdego polipeptydu kindlin oparła się jednak klonowaniu i analizie strukturalnej (Yates i Gilbert, niepublikowane obserwacje), a badania białek o pełnej długości były utrudnione przez trudności w ekspresji i oczyszczaniu wystarczających ilości przy użyciu E. coli (niepublikowane obserwacje i Harburger i wsp.¹⁴). Istnieje znaczne zainteresowanie medyczne kindlin-3 i jego funkcją, wraz z pozostałymi dwoma członkami rodziny, a ostatnio wygenerowaliśmy miligramowe ilości tego leku przez rekombinowaną ekspresję w komórkach Spodoptera frugiperda napędzanych przez zakażenie bakulowirusem¹². Dlatego opisujemy tutaj metody produkcji miligramowych ilości rekombinowanego mysiego kindlin-3 w hodowli komórek owadów, odpowiednie do rozległych badań strukturalnych i analizy biochemicznej.

W tym protokole używamy zaprojektowanego bakimdu nokautującego (BAC10_KO:1629), który sam w sobie nie jest w stanie wyprodukować żywotnych wirionów²⁸. DNA wirusa jest zatem ratowane przez rekombinację z wektorem transferowym, który w tym przypadku obejmuje również gen kindlin-3 (FERMT3) i powoduje, że gen FERMT3 zastępuje bardzo późny gen wirusa, który jest wysoce eksprymowany, ale zbędny, w wyniku czego powstaje rekombinowany wirus, który wyraża mysi kindlin-3 w ramach cyklu życiowego wirusa²⁸. Zidentyfikowaliśmy tę metodę do produkcji kindlin-3 po tym, jak próby ekspresji i oczyszczenia go w innych gospodarzach ekspresji okazały się zbyt trudne (niepublikowane obserwacje), ale także ze względu na wszechstronność zestawu wektorów pPIN, którego użyliśmy do klonowania i który może zostać wdrożony w wielu gospodarzach ekspresji²⁹.

Protokół

Niniejszy protokół zakłada, że mysi gen kindliny-3 (FERMT3) został pomyślnie sklonowany do wektora za promotorem p10 bardzo późnej fazy oraz że wektor posiada flankujące sekwencje bakulowirusowe umożliwiające rekombinację z bakmidem BAC10_KO:1629 opracowanym przez I.M. Jonesa i współpracowników²⁸. W tym protokole gen kindliny-3 został sklonowany do pOPINE²⁹, a zastosowane primery i strategia klonowania zostały opisane w innym opracowaniu¹². Plazmid został zaprojektowany w taki sposób, aby gen FERMT3 (kindlina-3) znajdował się pod kontrolą bakulowirusowego promotora p10, a wektor zawierał 5′ UTR/ORF603 oraz ORF 1629 i kodował C-końcowy znacznik His₆ do późniejszej puryfikacji²⁹.

1. Hodowla i utrzymanie kultur komórek owadziech

1. Przed amplifikacją rekombinowanego bakulowirusa należy wyhodować i utrzymać komórki Spodoptera frugiperda zaadaptowane do hodowli w zawiesinie (komórki Sf9). Komórki owadzie należy zawsze obsługiwać z zastosowaniem technik aseptycznych w dedykowanej komorze z laminarnym przepływem powietrza do hodowli tkankowych.
2. Hodowle zawiesinowe komórek owadzie inkubuje się w bezsurowiczym ciekłym medium Sf-900 II (SFM) uzupełnionym o 100 μg/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny w kolbach w temperaturze 27 °C przy wytrząsaniu z prędkością 100 rpm.
3. Zakres gęstości hodowli komórek owadzie należy utrzymywać w przedziale od 1 x 10⁶  do 1 x 10⁷  komórek/ml poprzez pasażowanie i rozcieńczanie hodowli świeżą pożywką Sf-900 II.
   Uwaga: zdrowe komórki powinny mieć jednolity rozmiar i kulisty kształt.
4. Liczbę komórek w objętości próbki należy określić za pomocą hemocytometru i mikroskopii świetlnej, aby obliczyć gęstość komórkową hodowli.

2. Generowanie rekombinowanego bakulowirusa

1. Hodować i utrzymywać komórki Sf9 w zawiesinie, stosując pożywkę Sf-900 II uzupełnioną o 100 μg/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. W celu generowania bakulowirusów komórki owadzie należy hodować do gęstości w zakresie 5 x 10⁵ - 1 x 10⁶ komórek/ml.
2. Zasiać około 1 x 10⁶ komórek Sf9 na dołek sterylnej 6-dołkowej płytki do hodowli tkanek w 2 ml pożywki Sf-900 II uzupełnionej o 100 μg/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Pozostawić komórki Sf9 w temperaturze pokojowej (RT) w dygestorium, aby przylgnęły do dna plastikowych dołków i utworzyły monowarstwę.
3. Przeprowadzić generowanie rekombinowanego bakulowirusa poprzez kotransfekcję DNA bacmid i DNA plazmidowego do hodowli monowarstwowej.
   1. Dla każdej transfekcji zmieszać 1-2 μg oczyszczonego pOPINE-mFERMT3, który posiada elementy bakulowirusowe ORF1629, z 0,5 μg oczyszczonego BAC10_KO:1629 w 100 μl bezantybiotykowej pożywki Sf-900 II SFM (roztwór A).
   2. W oddzielnej probówce rozcieńczyć 6 μl odczynnika Cellfectin II w 100 μl bezantybiotykowej pożywki Sf-900 II SFM dla każdej reakcji transfekcji (roztwór B). W przypadku konieczności wykonania wielu transfekcji można przygotować tzw. „master mix” w celu ograniczenia ilości operacji pipetowania.
   3. Zmieszać oba roztwory (A i B, łącznie około 200 μl) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 min do utworzenia kompleksu lipidowo-DNA.
   4. Rozcieńczyć kompleksy lipidowo-DNA w 800 μl bezantybiotykowej pożywki Sf-900 II SFM. Ostrożnie odessać pożywkę z monowarstwy komórek Sf9 i ostrożnie nanieść roztwór A/B wraz z pożywką na monowarstwę Sf9.
   5. Inkubować transfekowane komórki w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 27 °C przez noc (O/N), a następnego dnia dodać kolejne 1 ml bezantybiotykowej pożywki Sf-900 II SFM do każdej hodowli monowarstwowej. Inkubować komórki w temperaturze 27 °C przez kolejne 5 dni.
4. Zebrać rekombinowanego bakulowirusa bezpośrednio z pożywki hodowlanej (łącznie około 2 ml) i przenieść do czystej probówki wirówkowej (np. probówki Falcon 15 ml).
   1. Usunąć resztki komórek Sf9 poprzez wirowanie przy 1,000 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Przenieść wirusa znajdującego się w otrzymanym supernatancie (oznaczonego jako P1) do czystej probówki i przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności do czasu użycia. Na tym etapie pozostałą monowarstwę Sf9 można wykorzystać do oceny generowania rekombinowanego wirusa poprzez analizę obecności rekombinowanej kindliny-3 w komórkach owadzie.
5. Resuspendować monowarstwę w 0,5 ml PBS i rozcieńczyć 10 μl próbki równą objętością 2x buforu do ładowania SDS-PAGE. Podgrzewać próbki w temperaturze >95 °C przez co najmniej 10 min.
   1. Jeśli próbka jest zbyt lepka do prawidłowego załadowania na żel, poddać ją sonikacji przez 1 s przy amplitudzie 10% za pomocą końcówki mikrosonikatora.

3. Amplifikacja rekombinowanego bakulowirusa

1. Do amplifikacji wirusa w zawiesinie należy zastosować gęstość komórek wynoszącą 1.4 x 10⁶ cells/ml, co powinno stanowić 1/20 całkowitej objętości kolby (tj. 50 ml hodowli w kolbie 2 L ).
2. Amplifikację wirusa rekombinowanego przeprowadza się poprzez zakażenie hodowli komórek owadziech zapasem wirusa P1 przy wielokrotności zakażenia (MOI) wynoszącej 0.1, stosując poniższy wzór;
   
   Uwaga: Można przyjąć, że generacja wirusa P1 posiada oczekiwany miano wirusa na poziomie 1 x 10⁷ pfu/ml. Przed tym etapem można jednak przeprowadzić test plackowy.
3. Zakażoną wirusem P1 hodowlę komórek owadziech inkubować w temperaturze 27 °C przy wytrząsaniu 100 rpm przez 3 dni (72 hr).
4. Wirus należy zebrać poprzez oddzielenie komórek od pożywki za pomocą wirowania przy 1,000 x g przez 5 min w RT. Uzyskany na tym etapie osad komórkowy należy zachować w celu potwierdzenia produkcji wirusa rekombinowanego poprzez ocenę ekspresji białka kindlin-3 metodą SDS-PAGE i western blotting.
5. Klarowną pożywkę wzbogaconą w wirusa przenieść do czystej probówki i przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności do momentu użycia. Ten zapas wirusa oznacza się jako P2.
   Uwaga: Można spodziewać się miana wirusa na poziomie 2 x 10⁸ pfu/ml (lub współczynnika amplifikacji 100 pfu/cell).

4. Ekspresja kindlin-3 w komórkach Sf9 zainfekowanych baculowirusem

1. Przed wielkoskalową ekspresją rekombinowanej kindliny-3 w celu jej oczyszczenia należy wyhodować odpowiednią objętość kultur komórek Sf9 w zawiesinie w pożywce Sf-900 II SFM uzupełnionej o 100 μg/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Kultury w zawiesinie inkubować w temperaturze 27 °C przy wytrząsaniu z prędkością 100 rpm , zachowując stosunek całkowitej objętości kultury do objętości kolby wynoszący 1:5.
2. Zainfekować kultury Sf9 w zawiesinie przy gęstości 2 x 10⁶ komórek/ml.
3. Do kultur Sf9 dodać płodową surowicę bydlęcą (FBS) do stężenia końcowego 1% (v/v), a następnie dodać namnożonego wirusa rekombinowanego (stok wirusowy P2), aby uzyskać MOI równy 1. Zainfekowane kultury inkubować w temperaturze 27 °C przy wytrząsaniu z prędkością 100 rpm.
4. Komórki Sf9 eksponujące rekombinowaną kindlin-3-CHIS₆ zebrać 72 hr  po infekcji poprzez wirowanie przy 1,000 x g , a otrzymany pellet komórkowy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia lub w -80 °C w przypadku przechowywania długoterminowego.

5. Oczyszczanie rekombinowanej kindliny-3

1. rozmrozić na lodzie zamrożone osady komórek owadziech (Sf9) zainfekowanych bakulowirusem, ekspresujących rekombinowaną kindlinę-3.
2. Resuspendować rozmrożony osad komórkowy w buforze lizującym (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 1% (v/v) Tween-20), uzupełnionym o koktajl inhibitorów proteaz bez EDTA oraz 1 000-2 000 U DNazy 1.
   Uwaga: Alternatywnie można zastosować zmodyfikowany roztwór soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), w którym stężenie NaCl skorygowano do 500 mM, aby zapobiec nieswoistym oddziaływaniom między endogennymi białkami komórek Sf9 a kolumną powinowactwa do zimmobilizowanych jonów metali stosowaną w dalszym etapie oczyszczania (patrz poniżej).
3. Zlizować komórki poprzez inkubację resuspendowanych komórek z detergentem i mieszanie w wstrząsarzu typu vortex. Próbkę poddać sonikacji (amplituda 40%, 10 cykli po 10 s impulsu i 10 s chłodzenia) w łaźni lodowej w celu dalszej dezintegracji komórek lub alternatywnie użyć homogenizatora Dounce'a.
4. Sklarować lizat poprzez wirowanie przy 48 000 x g przez 1 h w temperaturze 4 °C. Otrzymany supernatant nałożyć na kolumnę HisTrap (objętość kolumny 5 ml), uprzednio równoważoną buforem lizującym, w temperaturze 4 °C z przepływem 1 ml/min.
   Uwaga: Alternatywnie sklarowany lizat można inkubować z 1-5 ml objętości złoża uprzednio równoważonych kulek niklowych sefarozy (np. Ni Sepharose 6 fast flow) w temperaturze 4 °C przez 1-2 h. Kolumnę z sefarozą niklową można utworzyć po etapie wiązania, stosując kolumnę przepływową grawitacyjną.
5. Przemyć kolumnę 10 objętościami kolumny buforu płuczącego (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 10 mM imidazolu), aby usunąć niewiązane białka.
6. Zastosować liniowy gradient imidazolu od 10 do 500 mM z prędkością 10 mM/ml (lub w 10 objętościach kolumny) przy użyciu systemu Äkta FPLC, aby eluować związaną rekombinowaną kindlinę-3-CHIS₆.
7. Rozdzielić eluat na frakcje o objętości 0,5-1 ml za pomocą Äkta FPLC; frakcje zawierające kindlinę-3-CHIS₆ eluują zazwyczaj przy stężeniu imidazolu wynoszącym 300 mM.
8. Ocenić skład białkowy eluatu za pomocą SDS-PAGE, a w przypadku pierwszego oczyszczania potwierdzić go metodą western blotting, stosując przeciwciało anty-His₆ lub przeciwciało anty-mysia kindlina-3.
9. Połączyć frakcje zawierające kindlinę-3 i wymienić bufor na 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl poprzez serię rozcieńczeń w buforze i zagęszczanie próbek przy użyciu wirówkowego koncentratora białek z granicą odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO) 50 kDa w temperaturze 4 °C.
   Uwaga: Alternatywnie można dializować roztwór białka, używając kasety dializacyjnej Slide-A-lyzer o MWCO 30 kDa w temperaturze 4 °C przez 4 h do nocy przeciwko 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl.
   Uwaga: w przypadku wymiany jonowej (patrz poniżej) na tym etapie można stosować i stosowano niższe stężenie NaCl, t.j. 50 mM.
10. Nałożyć roztwór białka po wymianie bufora na uprzednio równoważoną kolumnę HiTrap heparin HP (objętość kolumny 5 ml) przy użyciu Äkta FPLC z przepływem 0,5 ml/min.
    Uwaga: Związaną kindlinę-3 eluuje się za pomocą liniowego gradientu NaCl (od 0,2 M NaCl do 1 M NaCl) w tym samym buforze, zwiększając stężenie z prędkością 10 mM/ml. Przewiduje się, że kindlina-3-CHIS6 eluuje przy ~0,6 M NaCl.
11. Rozdzielić eluat na frakcje o objętości 0,5-1 ml i ocenić skład białkowy za pomocą SDS-PAGE oraz, jeśli to odpowiednie, western blotting.
    Uwaga: można spodziewać się czystości białka bliskiej 95%, ocenianej za pomocą SDS-PAGE.
12. Połączyć frakcje zawierające kindlinę-3 i zagęścić za pomocą wirówkowego koncentratora białek z MWCO 50 kDa do objętości końcowej 0,5-2 ml.
13. W ostatnim kroku przeprowadzić doczyszczanie zagęszczonego białka i wymianę buforu za pomocą chromatografii wykluczania cząsteczkowego (SEC).
    1. Nałożyć oczyszczone białko na kolumnę Superdex S200 (16/60) lub (10/30) uprzednio równoważoną w 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl, 1 mM DTT z przepływem 1 ml/min lub 0,5 ml/min, zależnie od zastosowanego rozmiaru kolumny.
       Uwaga: Chromatografię wykluczania cząsteczkowego można w razie potrzeby przeprowadzić w roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS).
    2. Oczyścić białka według wielkości, podając bufor na kolumnę z przepływem 1 ml/min lub 0,5 ml/min, zależnie od rozmiaru kolumny.
       Uwaga: Białko eluujące z kolumny jest rozdzielane na frakcje i monitorowane za pomocą absorbancji przy 280 nm.
    3. Z SEC powinien wynikać pojedynczy pik absorbancji; eluat ten jest rozdzielany na frakcje i oceniany za pomocą SDS-PAGE w celu określenia homogeniczności; po tym kroku czystość wynosi zazwyczaj >95%.
14. Zagęścić oczyszczoną kindlinę-3-CHIS₆ za pomocą wirówkowego koncentratora białek z MWCO 50 kDa do stężenia ~15 mg/ml, ocenianego spektrofotometrycznie przy użyciu obliczonego współczynnika ekstynkcji (ε) wynoszącego 109 320 M^-1 cm^-1 (przy założeniu, że wszystkie reszty cysteiny są zredukowane).
15. Do przechowywania w -20 °C oraz długoterminowego przechowywania w -80 °C, rozdzielić białko na alikwoty do probówek PCR i zamrozić próbki błyskawicznie w ciekłym azocie. Alternatywnie białko można wykorzystać bezpośrednio do badań z zastosowaniem szeregu technik biochemicznych i biofizycznych.

Wyniki

Wielkoskalowa ekspresja rekombinowanej mysiej kindliny-3 przy użyciu zainfekowanych bakulowirusem komórek Sf9 może zająć mniej niż dwa tygodnie w celu uzyskania ilości rzędu miligramów, co zilustrowano na schemacie Rycina 1A, i wymaga jedynie niewielkiej ilości plazmidowego DNA, np. z zestawu QIAprep Miniprep. Generowanie rekombinowanego bakulowirusa odbywa się poprzez kotransfekcję komórek Sf9 plazmidem zawierającym mysią kindlinę-3 (FERMT3) wraz z inżynieryjnym zlinearyzowanym bakmidem (BAC10:KO₁₆₂₉) i zebraniem nowo powstałych wirionów po 5-7 dniach, jak pokazano na Rycini 1A. Ta metoda generowania bakulowirusów skutkuje otrzymaniem 100% wirusów rekombinowanych i w zasadzie eliminuje potrzebę oczyszczania metodą płytek^28,30. Reprezentatywna hodowla w małej skali (monowarstwa 2 ml) wytworzy roztwór zawierający wirusa rekombinowanego z oczekiwanym mianem wirusowym wynoszącym 1 x 10⁷ jednostek tworzących plamy (pfu) na ml hodowli. Można przeprowadzić test płytek w celu określenia rzeczywistego miana wirusa , lecz może to być zbyt pracochłonne w przypadku testowania dużej liczby konstruktów do badań strukturalnych. Powodzenie etapu generowania wirusa można ocenić, stosując równolegle plazmid zawierający eGFP lub, w przypadku tego konstruktu kindliny-3, monowarstwę Sf9 można resuspenderować w PBS i ocenić za pomocą SDS-PAGE oraz western blottingu, co zazwyczaj wykazuje wyraźny prążek odpowiadający białku z tagiem His o masie 75 kDa, jak pokazano na Rycini 1B. Wirus jest następnie amplifikowany w celu wytworzenia ilości wystarczających do wielkoskalowej (objętości liczone w litrach ) infekcji komórek owadziej i izolacji rekombinowanego białka. Wirus z drugiego pasażu (P2) jest generowany poprzez infekcję hodowli zawiesinowych z szacowanym MOI wynoszącym 0,1 (patrz protokół). Kluczowe jest, aby amplifikowana hodowla zawiesinowa Sf9 zajmowała jedynie jedną dwudziestą całkowitej objętości kolby. To dodatkowe napowietrzanie zapewnia, że uzyskane medium zawierające wirusa, zebrane po 3 dniach (72 h) od infekcji, wytworzy wystarczające ilości kindliny-3 w późniejszej hodowli ekspresyjnej. Przyjmuje się, że zamplifikowany zapas wirusa (P2) posiada oczekiwane miano wirusowe wynoszące 2 x 10⁸ pfu/ml, w oparciu o konserwatywną szacunkową wartość 100 pfu/komórkę przy gęstości komórek 2 x 10⁶ komórek/ml podczas amplifikacji³¹. Zazwyczaj, dla optymalnej amplifikacji bakulowirusa i produkcji białka, komórki Sf9 powinny być jednorodne pod względem wielkości i mieć kształt sferyczny, jak pokazano na Rycini 1C. Dodatkowo, amplifikacja wirusa i ekspresja białka są maksymalne w 72 h po infekcji, a obie są znacząco zredukowane w 96 h po infekcji.

Po namnożeniu wirusa i zakażeniu nim komórek Sf9 w eksperymentach na dużą skalę, rekombinantyczna kindlina-3 jest częściowo oczyszczana dzięki wprowadzonemu inżynieryjnie znacznikowi His₆ na C-końcu przy użyciu chromatografii powinowactwa do zimmobilizowanych jonów metali, co przedstawiono na Rysunku 2. Ważne jest, aby oczyszczanie przeprowadzać w temperaturze 4 °C oraz dodać odpowiednią ilość inhibitorów proteaz, aby zapobiec proteolizie. Częściowo oczyszczona kindlina-3 jest następnie oczyszczana do stopnia bliskiego homogeniczności za pomocą chromatografii wymiany jonowej (IEC) z wykorzystaniem kolumny heparynowej, jak pokazano na Rysunku 3. Zastosowaliśmy kolumnę heparynową zamiast konwencjonalnej kolumny wymiany jonowej, ponieważ przewidywaliśmy, że duża liczba reszt zasadowych, w tym odcinek poli-lizyny w domenie F1 kindliny-3, będzie silnie oddziaływać z ujemnie naładowanymi grupami siarczanowymi kolumny. Strategia ta jest szczególnie użyteczna w przypadku białek wiążących DNA i RNA z zasadowymi obszarami wiążącymi kwasy nukleinowe, na przykład w przypadku wiążącej RNA terminalowej urydylylotransferazy Cid1³². Ostatecznie czystość kindliny-3 jest „doszlifowana” za pomocą chromatografii wykluczania cząsteczkowego w celu usunięcia agregatów i uzyskania homogeniczności, co przedstawiono na Rysunku 4. Bufor podany w protokołach to standardowy bufor często stosowany w oczyszczaniu białek do analiz strukturalnych. Generalnie unika się buforów fosforanowych podczas oczyszczania białek do badań strukturalnych, zwłaszcza podczas przesiewania krystalizacji, ze względu na tworzenie się kryształów fosforanów w kroplach krystalizacyjnych (szczególnie w eksperymentach w 4 °C). Przeprowadziliśmy jednak analizę przesunięcia termicznego w oparciu o metodę Thermofluor, aby określić, które bufory stabilizują kindlinę-3, co pokazano na Rysunku 5. W skrócie, oczyszczony roztwór białka rozcieńczono w buforach obejmujących zakres pH i stężeń chlorku sodu, tworząc w ten sposób dwuwymiarowy screening. Topnienie białka mierzono poprzez obserwację fluorescencji barwnika Sypro orange (sond molekularnych), który wiąże się z resztami hydrofobowymi wewnątrz sfałdowanego rdzenia białka, w zakresie temperatur 20-95 °C (293-368 K). Środkowa temperatura, w której białko ulega rozfałdowaniu (temperatura przejścia, T_m), została obliczona przy użyciu oprogramowania Opticon Monitor i jest opisana w innym opracowaniu³³. Zaobserwowano, że kindlina-3 jest stabilna przy wysokich stężeniach chlorku sodu (500 mM) w zakresie pH 7,0-9,0, ze stałą temperaturą przejścia (T_m) wynoszącą 55 °C. Zaobserwowano również, że T_m kindliny-3 wynosiła około 55 °C w zakresie pH 7,0-7,5, niezależnie od stężenia chlorku sodu.

Stwierdzono, że podczas oczyszczania dochodziło do ograniczonej proteolizy kindlin-3, jednak analiza SDS-PAGE silnie stężonego białka (~15 mg/ml) wykazała niewielkie zanieczyszczenie dwoma dodatkowymi polipeptydami o tej samej intensywności. Co dziwne, chromatografia wykluczania cząsteczkowego nie wskazuje jednak na obecność dodatkowych gatunków, co przedstawiono na Rysunku 4. Przypuszcza się zatem, że białko jest nacinane przez proteazy, ale pozostaje zwinięte i hydrodynamicznie nieodróżnialne od białka o pełnej długości. Co ciekawe, kalpaina jest znaną proteazą, która rozcina kindlin-3 w miejscu tyrozyny 373, znajdującej się w pętli β1-β2 domeny homologii plekstryny (PH)³⁴, co może wyjaśniać nasze obserwacje. Ponadto western blotting ujawnia, że jeden z dubletów polipeptydowych posiada znacznik His na końcu C, a pozorna masa cząsteczkowa dubletu po zsumowaniu wynosi 75 kDa, czyli taką samą masę cząsteczkową jak białko natywne. Wydajność oczyszczonej rekombinowanej kindlin-3 na litr komórek Sf9 (~2 g masy komórkowej) wynosi w najlepszym przypadku 5 mg.

Rycina 1. Przegląd heterologicznej ekspresji białek w zainfekowanych bakulowirusami komórkach owadów. (A) Schematyczna analiza generowania bakulowirusa i ekspresji białka kindlin-3 w komórkach Sf9. Na schematach wektora DNA 5'UTR/ORF603 zaznaczono kolorem czerwonym, ORF1629 kolorem zielonym, a gen białka docelowego (P.O.I.) kolorem niebieskim. (B) Western blot z użyciem przeciwciała anty-His₆ sześciu kultur w małej skali (monowarstwa 2 ml) (ścieżki opisane zgodnie z kulturą) komórek Sf9 produkujących rekombinowany bakulowirus oraz rekombinowany mysi kindlin-3. (C) Obraz z mikroskopii świetlnej zdrowych komórek Sf9 hodowanych w zawiesinie w pożywce Sf-900 II SFM z dodatkiem antybiotyków i przeniesionych do 35 mm naczynia hodowlanego (patrz protokół). Powiększenie obrazu 20X .

Rysunek 2. Reprezentatywne oczyszczanie kindlin-3 za pomocą chromatografii powinowactwa do zimmobilizowanych jonów metali (IMAC). SDS-PAGE rekombinowanego mysiego kindlin-3, oczyszczonego metodą powinowactwa do niklu i ekspresowanego w zainfekowanych bakulowirusem komórkach Sf9 (~2 g masy komórkowej). Zaadsorbowane białko eluowano przy użyciu gradientu imidazolu (pokazanego nad żelem). Próbki w ścieżkach oznaczono następująco: MW, marker masy cząsteczkowej; Lys, lizat całych komórek; FT, frakcja przepływowa (niezwiązana); WI, przemywanie 1; WII, przemywanie 2. Analiza Western blot (poniżej) została również przeprowadzona z wykorzystaniem frakcji elucyjnych w celu potwierdzenia obecności wprowadzonego His-tagu w białku rekombinowanym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Reprezentatywne oczyszczanie kindliny-3 za pomocą chromatografii powinowactwa do heparyny. (A) Profil elucji obserwowany przy 280 nm (kolor niebieski) wykazujący pojedynczy symetryczny pik eluujący w liniowym gradiencie chlorku sodu (kolor zielony) w zakresie stężeń NaCl od 0.05-1.0 M. (B) Analiza SDS-PAGE frakcjonowanej elucji wykazująca obecność białka o masie 75 kDa, kindliny-3 (oznaczonej jako K3). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Reprezentatywna chromatografia filtracyjna żelowa i stężona kindlina-3. (A) Profil elucji w chromatografii filtracyjnej żelowej oczyszczonej kindliny-3 z wykorzystaniem kolumny Superdex S200 (16/60) w buforze Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl i 1 mM DTT w temperaturze 20 °C. Na podstawie objętości elucji kindlina-3 migruje zgodnie z oczekiwaniami dla białka o masie 75 kDa, co sugeruje, że występuje ona głównie w formie monomeru. (B) SDS-PAGE silnie stężonej, oczyszczonej rekombinowanej kindliny-3 o stężeniu 14.5 mg/ml. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rycina 5. Analiza przesunięcia termicznego w oparciu o technikę Thermofluor do screeningu buforów. Kindlin-3 rozcieńczono w różnych buforach obejmujących dwuwymiarowy screening pH w funkcji stężenia chlorku sodu. Temperatury przejścia (punkty środkowe temperatury) obserwowano poprzez fluorescencję barwnika wiążącego się hydrofobowo, Sypro orange (sondy molekularne), a następnie obliczono za pomocą oprogramowania Opticon Monitor. (A) Przedstawiono 3D histogram temperatur przejścia wraz z (B) zmianą temperatury przejścia względem obliczonej średniej wynoszącej 50.4 °C. Dla przejrzystości słupki zostały pokolorowane zgodnie z zakresem temperatur, którym odpowiadają. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

Systemy ekspresji bakulowirusa stają się coraz bardziej popularne i stanowią ważne narzędzie do produkcji miligramowych ilości rekombinowanego białka do charakteryzowania białek za pomocą badań biofizycznych, w tym krystalografii rentgenowskiej. Pomimo tego, że są bardziej wymagające eksperymentalnie, systemy ekspresji bakulowirusa mają kilka zalet w porównaniu z E. coli , jedną z nich jest prawie natywne środowisko dla białek pochodzenia eukariotycznego , np. obecność odpowiednich białek opiekuńczych i możliwość modyfikacji potranslacyjnej. W naszych własnych wysiłkach na rzecz ekspresji kindlin-3 użyto alternatywnych gospodarzy ekspresji, w tym linii komórkowych ssaków i szczepów ekspresyjnych bakterii (niepublikowane obserwacje). Ogólnie rzecz biorąc, wiele testowanych szczepów E. coli wytwarzało bardzo małe ilości rekombinowanego kindlinu-3 (~0,5 mg/L hodowli; obserwacje niepublikowane). Jednak ekspresja sterowana przez bakulowirusa w komórkach owadów była szczególnie skuteczna i, w porównaniu z przejściową ekspresją w komórkach ssaków, bardziej podatna na generowanie dużej biomasy wymaganej do wyizolowania miligramów rekombinowanych białek cytoplazmatycznych (obserwacje niepublikowane). Spekulujemy, że obecność eukariotycznych białek opiekuńczych może pozwolić na wydajną produkcję kindlin-3.

Baculoviridae infekują komórki owadów, a do rekombinowanej ekspresji białek bakulowirus użyty w tej pracy jest oparty na wirusie polihedrozy jądrowej Autographa californica (AcNPV). W naturze AcNPV, który infekuje larwy owadów Autographa californica (lucerna nożycowata), wymaga białka polihedryny do tworzenia okluzji, w wyniku których wirony są zamknięte w krystalicznej matrycy białkowej, zapewniając w ten sposób niezbędną ochronę do ich uwalniania. W hodowanych komórkach tworzenie ciał okluzyjnych nie jest wymagane do replikacji i dlatego jest zbędne. W przypadku ekspresji obcych białek gen białka polihedryny może zostać zastąpiony rekombinowanym AcNPV genem białka będącego przedmiotem zainteresowania. AcNPV może infekować inne gatunki Lepidopteron i do celów rekombinowanej ekspresji białek stosuje się komórki jajnika Spodoptera frugiperda . W przedstawionym tutaj podejściu, bakmid AcNPV (BAC10) jest modyfikowany w taki sposób, że niezbędny gen wirusa, ORF1629, jest inaktywowany przez wprowadzenie acetylotransferazy chloramfenikolu, co prowadzi do nokautującego bakmidu (BAC10: KO₁₆₂₉), tak że nie jest on w stanie tworzyć zakaźnych bakulawirionów²⁸. Kotransfekcja komórek Sf9 ze zlinearyzowanym BAC10: KO₁₆₂₉ i wektorem transferowym zawierającym FERMT3 naprawia nieaktywne ORF1629 poprzez transpozycję, w wyniku czego powstaje żywotny genom, który zawiera również gen FERMT3 pod kontrolą promotora polihedryny²⁸.

Opisujemy protokół oczyszczania do izolacji wysoce czystego rekombinowanego mysiego kindlin-3 za pomocą trzyetapowego podejścia chromatograficznego. Metody zastosowane tutaj można z łatwością zastosować do innych białek znakowanych przez Hisa. Zastosowaliśmy etap wymiany jonowej w celu dalszego oczyszczenia kindlin-3, ale uważamy, że jest to kolejny etap pseudo-powinowactwa, ponieważ kindlin-3 posiada dużą liczbę podstawowych reszt, w tym rozciąganie polilizyny w domenie F1. Ponadto uważa się, że kindlin-3 wiąże się i oddziałuje z cytoplazmatyczną powierzchnią błony plazmatycznej, gdzie funkcjonuje, dlatego przewidujemy, że grupowanie podstawowych reszt pozwoli białku przeciwdziałać ujemnie naładowanej błonie.

opisane w protokołach oczyszczania są uważane za standardowe i są często stosowane w biologii strukturalnej. Test termofluorowy (ryc. 5) pokazuje, że kindlin-3 jest stabilny w większości warunków buforowych powyżej pH 6,0. Było to szczególnie przydatne i ważne dla informowania o naszych eksperymentach podczas badania interakcji ogona kinldin-3:β1_A za pomocą NMR, która dała doskonałe widma przy pH 6,1 przy niskich stężeniach NaCl¹².

Zanim będzie można przeprowadzić jakiekolwiek badanie biofizyczne, ważne jest, aby wykazać, że oczyszczone białko, które jest przedmiotem zainteresowania, jest rzeczywiście prawidłowo sfałdowane i jest funkcjonalnie aktywne. W poprzedniej publikacji wykazaliśmy, że rekombinowany kindlin-3 wyrażany i oczyszczany tą metodą był monomerem i monodyspersją w roztworze, co oceniano za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar, dynamicznego rozpraszania światła, analitycznego ultrawirowania i rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem, a także był zdolny do wiązania i rozpoznawania dystalnego NPxY błony i poprzedzającego klastra seryny / treoniny ogonów cytoplazmatycznych β^{1A 14}, potwierdzając w ten sposób, że zachowuje się jak białko natywne, co jest zgodne z wcześniejszymi badaniami komórkowymi i fizjologicznymi^14,20,22. Zastosowanie testu stabilności termicznej jest dodatkowym sposobem sugerowania prawidłowego fałdowania białka będącego przedmiotem zainteresowania, ponieważ nieprawidłowo sfałdowane białko spowoduje tło o wysokiej fluorescencji z powodu odsłoniętych reszt hydrofobowych.

Rodzina białek kindlin znalazła się w centrum uwagi od czasu odkrycia ich nieoczekiwanej roli jako niezbędnych koaktywatorów integryn in vivo . Spowodowało to wiele wysiłku, aby wyrazić je rekombinacyjnie i rozwiązać ich struktury. Do tej pory odnotowano ograniczone sukcesy w ekspresji miligramowych ilości rekombinowanego białka o pełnej długości, ale tutaj opisaliśmy zastosowanie systemu bakulowirusa, który pozwala na ekspresję na dużą skalę na poziomach, na których możliwe stają się badania strukturalne. Spodziewamy się, że wytwarzając duże ilości rekombinowanego kindlinu-3, pomoże to w dalszych badaniach nad tym białkiem. Metoda oparta na bakulowirusie i opisany tutaj przepływ oczyszczania dla rekombinowanego mysiego kindlin-3 może być również wykorzystana do ekspresji i oczyszczania innych izoform kindlin, które są również trudne do ekspresji, a także posiadają odcinki polilizyny, i mogą być dalej przystosowane do innych białek cytoplazmatycznych, takich jak białka wiążące kwasy nukleinowe, które nie ulegają ekspresji w szczepach bakteryjnych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sf-900 II pożywka bez surowicy (SFM) 1x płyn	Life Technologies	10902-096	przechowywać w 4 stopniach; C i podgrzać do RT przed użyciem
Odczynnik Cellfectin II	Invitrogen	10362-100	Alternatywnie można użyć odczynnika do transfekcji GeneJuice (EMD)
Siarczan streptomycyny (stały)	Melford	S0148	Filtr sterylizacyjny (0,22 μ m filtr) przed użyciem
Penicylina G, sól potasowa (stała)	Melford	P0580	Sterylizuj filtr (0,22 μ m filter) przed użyciem
CELLSTAR Sterylna 6-dołkowa płytka hodowlana	Greiner Bio-One	657160
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Life Technologies	10100-147
Koktajl inhibitorów proteazy	Sigma	P8849	Uwaga: Inhibitory proteazy rozpuszcza się w DMSO
Deoksyrybonukleaza (Dnaza) z trzustki bydlęcej (Dnaza) I	Sigma	D5025
HisTrap FF (5 ml)	GE Heathcare	17-5286-01	Wymaga Ä kta FPLC
maszyna HiTrap Heparyna (5 ml)	GE Heathcare	17-0407-01	Wymaga Ä Maszyna kta FPLC
Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-15 (z membraną Ultracel-50)	Milipora	UFC905024	pojemności 15 ml i MWCO koncentratora białek 50 kDa