Pomiar zmian wrażliwości dotykowej w tylnej łapie myszy za pomocą elektronicznego aparatu von Freya

Podsumowanie

Elektroniczne pomiary von Freya są skuteczną i ulepszoną alternatywą dla klasycznych filamentów von Freya, ponieważ pozwalają na szybki i precyzyjny pomiar zmian w progach mechanicznego wycofywania gryzoni do stale stosowanych bodźców ciśnieniowych przed i po zdarzeniu zapalnym.

Streszczenie

Pomiar wywołanych stanem zapalnym zmian w progach wycofania tylnej łapy pod wpływem nacisku mechanicznego jest użyteczną techniką oceny zmian w odczuwaniu bólu u gryzoni. Progi wycofania można zmierzyć najpierw na początku badania, a następnie po zastosowaniu leku, jadu, urazu, alergenu lub w inny sposób wywołanego stanu zapalnego, poprzez przyłożenie dokładnej siły do bardzo określonych obszarów skóry. Elektroniczny aparat von Freya umożliwia precyzyjną ocenę progów wycofania tylnej łapy myszy, które nie są ograniczone dostępnymi rozmiarami włókien, w przeciwieństwie do klasycznych pomiarów von Freya. Łatwość i szybkość pomiarów pozwala na włączenie oceny wyników wrażliwości dotykowej do różnych modeli bólu zapalnego i neuropatycznego o szybkim początku, ponieważ można wykonać wiele pomiarów w krótkim czasie. Pomiary eksperymentalne dla poszczególnych gryzoni mogą być wewnętrznie kontrolowane w odniesieniu do indywidualnych odpowiedzi wyjściowych i kryteriów wykluczenia łatwo ustalonych w celu standaryzacji odpowiedzi wyjściowych w obrębie grup eksperymentalnych i między nimi. W związku z tym pomiary za pomocą elektronicznego aparatu von Freya stanowią użyteczną modyfikację dobrze znanych klasycznych testów opartych na włóknach von Freya dla mechanicznej allodynii gryzoni, które mogą być również stosowane do innych modeli ssaków innych niż ludzie.

Wprowadzenie

Przewlekłe choroby niezakaźne są odpowiedzialne za nieproporcjonalną część obciążeń ludzkich związanych ze śmiertelnością i zachorowalnością¹. Przewlekły ból jest coraz częściej uznawany za ważny składnik globalnego obciążenia chorobą². Dało to ogromny impuls do innowacji w zapobieganiu, leczeniu i leczeniu bólu. Jednocześnie istnieje wiele dowodów na to, że biologia leżąca u podstaw bólu jest^złożona3. Mechanizmy leżące u podstaw bólu ochronnego, a także nieprzystosowawczego i przewlekłego wskazują na skomplikowane wzajemne oddziaływanie między układem odpornościowym i nerwowym^3,4. Wyjaśnienie tych mechanizmów wymaga rygorystycznych ilościowych, powtarzalnych podejść eksperymentalnych, od analizy molekularnej po analizę behawioralną.

Modele gryzoni były nieocenione w charakterystyce molekularnych czynników bólu zapalnego i neuropatycznego⁵. Skrócenie czasu i intensywności wcześniej określonych reakcji na szkodliwe bodźce służy do pomiaru stanów bólowych u tych zwierząt, ponieważ gryzonie nie są w stanie w inny sposób zgłosić uczucia bólu⁶. Zmienione reakcje na temperaturę i ciśnienie są powszechnie stosowane jako wskaźniki wrażliwości tkanek w modelach nocycepcji zapalnej gryzoni, która może być spowodowana infekcją^7,8, ekspozycją chemiczną^{6, 9,10}, nacięciem chirurgicznym¹¹, a także bólem neuropatycznym spowodowanym podwiązaniem nerwów¹².

Czułość mechaniczna, czyli reakcja na bodźce naciskowe, jest często mierzona za pomocą klasycznych włókien von Freya (CvF) - serii (np. 0,4-15 g¹³) ważonych końcówek ręcznie nakładanych na badaną tkankę w przyrostach seryjnych, aż do wywołania zachowań bólowych u osób kontrolnych i eksperymentalnych. Istnieją różne metody wykorzystania tych końcówek lub włosów do oceny wrażliwości mechanicznej^6,13; Najczęściej stosowana metoda jest następująca. Końcówka o określonym ciśnieniu (w obrębie serii; Np. 2 g¹³) jest wybierany jako punkt wyjścia, a 50% próg wycofania szczura lub myszy (intensywność bodźca wymagana do wywołania odpowiedzi w 50% przypadków, gdy końcówka jest przykładana do tkanki) jest określany przez przesuwanie się w górę i w dół wagi końcówki w oparciu o wyświetlanie wcześniej określonych zachowań odpowiedzi¹³. Bezwzględne 50% progi wycofania dla grup leczonych są następnie porównywane między punktami czasowymi wyjściowymi i po leczeniu. Ta ręczna technika jest dość czasochłonna. Oprócz wydłużenia czasu spędzonego przez każdego badanego zamkniętego w komorze von Freya, zwiększa to również liczbę nakładanych końcówek testowych o różnej wadze na tkankę objętą stanem zapalnym, powodując większy dyskomfort u gryzoni w badaniu. Ponadto oblicza się 50% progi wycofania i porównuje je między grupami gryzoni; Indywidualne reakcje osób eksperymentalnych zazwyczaj nie są znormalizowane w stosunku do ich indywidualnych nieleczonych odpowiedzi wyjściowych, z, o ile nam wiadomo, jednym wyjątkiem⁶. W związku z tym gryzonie nie są zwykle zgłaszane jako przypisane do grup leczonych na podstawie spójnych odpowiedzi wyjściowych w wcześniej ustalonym zakresie, ani też poszczególne osoby nie są oceniane na podstawie konsekwentnie stosowanego zestawu kryteriów wykluczenia, które pozwalają na standaryzację odpowiedzi wyjściowych dla dowolnego konkretnego zestawu badań i testów.

Tutaj prezentujemy alternatywną metodę pomiaru wrażliwości dotykowej tylnej łapy myszy po ekspozycji na jad Bothrops jararaca za pomocą elektronicznego aparatu von Freya (EvF). Cunha i współpracownicy^byli pionierami w stosowaniu technik EvF u gryzoni i systematycznie porównywali skuteczność CvF i EvF, aby wykazać, że EvF zapewnia "bardziej czułą, obiektywną i ilościową" miarę wrażliwości dotykowej w modelach bólu zapalnego gryzoni. Krótko mówiąc, w pomiarach EvF, niehigroskopijna polipropylenowa końcówka von Freya o jednolitej średnicy (0,8 mm) o odpowiedniej sztywności dla badanej tkanki jest przymocowana do sondy elektronicznej i odczytu, który pokazuje siłę/wagę, przy której gryzoń chowa się z końcówki. Istnieje kilka istotnych różnic między pomiarami CvF i EvF. Po pierwsze, proces pomiaru zarówno odpowiedzi wyjściowych, jak i eksperymentalnych za pomocą EvF jest znacznie usprawniony, ponieważ nacisk na tylną łapę może być wywierany z rosnącą siłą, aż do wystąpienia odpowiedzi i nie ma potrzeby zmiany końcówek, jak w CvF; Zwierzęta spędzają mniej czasu zamknięte w komorach testowych, dzięki czemu są mniej zestresowane i czują się bardziej komfortowo podczas eksperymentu. Po drugie, EvF pozwala na relatywną łatwość implementacji kryteriów racjonalnego wykluczenia badanych osób w postaci zakresów akceptowalnych progów wyjściowych. Pozwala to na standaryzację wyjściowych odpowiedzi w obrębie grup leczenia i między nimi. Po trzecie, odpowiedź pacjenta po eksperymentalnym leczeniu jest zawsze porównywana z jego indywidualną reakcją wyjściową, tworząc ważne wewnętrzne kontrole pomiarów. Po czwarte, dokładność progów wycofania jest rejestrowana na wyższym poziomie rozdzielczości, ponieważ ciśnienie może być stosowane w sposób ciągły, a nie w przyrostach dostępnych w postaci mas włókien ręcznych. Podobnie jak w przypadku dobrze zaprojektowanych testów CvF, eksperymenty oparte na EvF są również przeprowadzane z tym samym badaczem (ślepym na leczenie) przykładającym siłę i rejestrującym zachowania reakcji. Ważne jest, aby zauważyć, że technika ta wymaga czasu i wysiłku ze strony badaczy w celu ustalenia wewnętrznej spójności pomiarów i wymaga planowania eksperymentów w taki sposób, aby uwzględnić odpowiednie uwzględnienia dla myszy, które mogą być wykluczone z powodu niespójnych odpowiedzi wyjściowych.

Łatwa do wdrożenia, skuteczna, dobrze kontrolowana ocena wrażliwości mechanicznej ułatwia dodanie oceny behawioralnej do modeli zdarzeń zapalnych, takich jak zatrucie - przykład, którego użyliśmy tutaj, aby zilustrować możliwości i moc pomiarów EvF w pomiarze zmian wrażliwości dotykowej. Odkryliśmy, że samce szwajcarskich myszy ND4 wykazywały zwiększoną wrażliwość mechaniczną po wstrzyknięciu jadu pochodzącego z południowoamerykańskiej żmii Bothrops jararaca w tylną łapę. Reakcjom behawioralnym towarzyszył obrzęk, napływ neutrofili i degranulacja komórek tucznych w dotkniętej tkance.

Protokół

Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami (IACUC) Macalester College's zatwierdził wszystkie protokoły. Do tych eksperymentów użyto 8-12 tygodniowych samców szwajcarskich myszy ND4.

1. Preparat i wstrzyknięcie jadu Bothrops jararaca

1. UWAGA: Jad B. jararaca jest toksyczny. Nosić rękawice, maskę i okulary ochronne podczas obchodzenia się z proszkiem i przygotowywania roztworów.
2. Podawać 45 μg/kg jadu B. jararaca (schemat określony na podstawie wcześniejszych doświadczeń dawka-odpowiedź) lub 0,9% nośnika soli fizjologicznej (10 μl) przez wstrzyknięcie dopodeszwowe do obu tylnych łap za pomocą strzykawek insulinowych 3/10 ml z igłami 29 G x 1/2. Uwaga: W zależności od projektu eksperymentalnego, roztwory lecznicze i kontrolne mogą być wstrzykiwane oddzielnie odpowiednio do każdej tylnej łapy, aby zapewnić wewnętrzną kontrolę u każdego pacjenta.

2. Konfiguracja i obsługa elektronicznego aparatu von Freya

1. Umieść elektroniczną jednostkę von Freya na stojaku sondy. Upewnij się, że sonda i są prawidłowo podłączone do wyświetlacza i włącz instrument. Ustaw odczyt na zero (0.00 g) w trybie konfiguracji i delikatnie umieść dostarczony wzorzec masy (5.00 g) na stożku sondy von Freya.
2. Zapisz odczyt w notatniku laboratoryjnym i powtórz tę procedurę po zakończeniu sesji testowej. Jeśli występuje rozbieżność większa niż 0,20 g między odczytami wzorca masy przed i po sesji testowej lub jeśli odczyt zmienia się po nałożeniu wzorca masy, może być konieczna ponowna kalibracja przyrządu (przez producenta).
3. Aby ocenić próg wycofania tylnej łapy myszy, należy użyć odpowiedniej końcówki polipropylenowej spośród dostarczonych z sondą. Wybór końcówki zależy od badanej tkanki. Sztywne końcówki dobrze sprawdzają się w przypadku mniej wrażliwych, twardszych tkanek tylnej łapy, podczas gdy półelastyczne końcówki mogą być lepszym wyborem dla bardziej wrażliwego obszaru, takiego jak grzbiet odbytu i narządów płciowych (Chatterjea, niepublikowane). Delikatnie zamontuj sztywną końcówkę na stożku sondy.
4. Aby zarejestrować maksymalne zastosowane ciśnienie, przełącz tryb pracy z konfiguracji na pracę tak, aby maksymalne zastosowane ciśnienie zostało zarejestrowane na wyświetlaczu. W tym trybie odczyt maksymalnego zastosowanego ciśnienia zostanie zapisany na ekranie wyświetlacza po wsunięciu sondy.

3. Ogólne uwagi dotyczące oceny progu wycofania tylnej łapy

1. Idealnie byłoby, gdyby do pomiaru progu wycofania tylnej łapy (czułości mechanicznej) za pomocą aparatu EvF potrzebnych było dwóch badaczy - jeden do obsługi aparatury i wykonywania pomiarów, a drugi do transkrypcji zarejestrowanych pomiarów i obchodzenia się z myszami.
2. W celu zmniejszenia błędu systematycznego, badacz obsługujący aparaturę powinien być ślepy na leczenie i zarejestrowane wartości progowe wycofania. Ponadto, aby zapewnić spójność między pomiarami, ta sama osoba powinna ocenić wszystkie podstawowe i eksperymentalne progi wycofania.
3. Wszystkie pomiary wykonuj w cichym pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze i o tej samej porze^{dnia 14}.
4. Eksperymentator rejestrujący pomiary powinien umieścić każdą mysz w indywidualnych komorach wielojednostkowej obudowy z polimetakrylanu metylu (PMMA) ustawionej na siatkowym stojaku podłogowym. Przykryj komory perforowanymi pokrywami z PMMA, a na wierzchu połóż ciężki przedmiot, aby zapobiec ucieczce myszy. Umieść materiał chłonny pod stojakiem, aby wchłonąć/zebrać wydalane odpady. Pozwolić myszom zaaklimatyzować się przez 15 minut w komorach przed oceną wyjściową lub eksperymentalną oceną progu wycofania ^6,7,10.
5. Tylne łapy myszy muszą być łatwo dostępne przez otwory w siatkowej podłodze, dlatego należy umieścić siatkowy stojak podłogowy na wygodnej wysokości na wózku z hamulcami lub na stabilnym blacie, który jest dostępny ze wszystkich stron.
6. Podczas pomiarów myszy mogą wymagać odwrócenia uwagi za pomocą granulki żywności¹⁵ umieszczonej tuż na zewnątrz komory pomiarowej lub bardzo niewielkiego hałasu wytwarzanego przez stukanie lub przesuwanie długopisem po siatce drucianej podłogi komory przed, ale nie w trakcie pomiaru. To skłania mysz do pozostawania w bezruchu, umożliwiając eksperymentatorowi łatwiejsze rozpoczęcie wykonywania pomiarów.

4. Podstawowa ocena progu wycofania tylnej łapy

1. Pierwszy zestaw pomiarów wyjściowych należy wykonać 48 godzin przed rozpoczęciem leczenia. Wyzeruj sondę po zamontowaniu sztywnej końcówki. Używając dwóch rąk, powoli podnieś sondę, aby stymulować środek (obszar opuszki stopy) lewej lub prawej tylnej łapy (jeśli obie łapy otrzymały takie samo leczenie).
2. Stopniowo zwiększaj ciśnienie, aż zaobserwuje się zdefiniowane zachowania reakcji nocyceptywnej, takie jak cofanie tylnej łapy, lizanie tylnej łapy lub skakanie na czterech łapach^6,10. Poinstruuj drugiego badacza, aby dokonał transkrypcji nacisku, który wywołał zaobserwowane zachowanie.
3. Zmierz próg wycofania myszy znajdującej się w sąsiedniej komorze. Kontynuuj, aż raz ocenisz progi wycofania każdej myszy. Powtórz kolejne cztery razy, tak aby każda mysz była mierzona 5 razy, jak opisano^{wcześniej 10}.
4. Dla każdej myszy oblicz wartość mediany 5 pomiarów, a następnie oblicz, jak bardzo każda wartość odbiega od mediany. Wybierz 3 wartości, które najmniej się różnią, i uśrednij je, aby uzyskać podstawowy próg wycofania, jak opisano wcześniej¹⁰. W tej demonstracji pomiar został ustandaryzowany przy użyciu 3 z 5 wartości; Chociaż konkretna liczba pomiarów może się różnić w zależności od projektu eksperymentalnego, ważne jest, aby upewnić się, że wszystkie myszy są szturchnięte taką samą liczbę razy w celu oceny linii wyjściowych.
5. Powtórz pomiary podstawowe 24 godziny później. Wykonaj 5 pomiarów na mysz i uśrednij 3, które są najbliższe medianie, aby uzyskać wyjściowy próg wycofania.
6. Aby obliczyć średni wyjściowy próg wycofania myszy, należy uśrednić jej wyjściowe progi wycofania przyjęte po 48 i 24 godzinach przed leczeniem. Jeśli średni wyjściowy próg wycofania jest niższy niż 3,50 g lub jeśli dwa podstawowe progi różnią się o 2,00 g lub więcej, należy wykluczyć mysz z eksperymentu. Kryteria te zapewniają, że wszystkie myszy w eksperymencie mają spójne odpowiedzi wyjściowe i wystarczająco wysokie wyjściowe progi wycofania, które pozwalają na zaobserwowanie niższych progów po leczeniu.
7. Uwaga: Próg wykluczenia będzie zależał od badanej tkanki, szczepu badanych zwierząt i rodzaju użytej końcówki. Na przykład odkryliśmy, że 3,5 g jest użytecznym punktem odniesienia dla tkanki tylnej łapy ND4, ale bardziej wrażliwe obszary, takie jak grzbiet odbytu i narządów płciowych, wymagają niższego progu wykluczenia (Chatterjea, niepublikowane).
8. Przypisz myszy do grup leczonych tak, aby średnia wartość wyjściowa odstawienia grup eksperymentalnych była jak najbardziej podobna przed podaniem leczenia.

Uwaga: Pomiary bazowe mogą być wykonane przed upływem 48 godzin przed eksperymentem. Należy jednak wykonać co najmniej 2 zestawy pomiarów wyjściowych w regularnych odstępach czasu przed rozpoczęciem leczenia.

5. Eksperymentalna ocena progu wycofania tylnej łapy

1. Oceń próg wycofania tylnej łapy (wrażliwość mechaniczną) po leczeniu w odpowiednich punktach czasowych określonych przez projekt eksperymentu. Wróć myszy do ich klatek z dostępem do jedzenia i wody natychmiast po zakończeniu pomiarów.
2. Postępuj zgodnie z krokami opisanymi powyżej; wykonaj 3 zamiast 5 pomiarów, aby zmniejszyć możliwość nadmiernej stymulacji (leczonej) tkanki tylnej łapy, zwłaszcza jeśli wrażliwość ma być oceniana w wielu punktach czasowych. Jeśli dowolne dwa z trzech wykonanych pomiarów różnią się o więcej niż 2,00 g, wykonaj czwarty pomiar.
3. Oblicz średnią z 3 pomiarów, aby uzyskać eksperymentalny próg wycofania dla każdej myszy. Dla dowolnych myszy, dla których wykonano 4 pomiary, należy obliczyć średnią z trzech, które najmniej odbiegają od mediany, w celu uzyskania eksperymentalnego progu wycofania.
4. Aby uzyskać próg wycofania delta dla każdej myszy w określonym punkcie czasowym, odejmij linię bazową od eksperymentalnego progu wycofania. Powtórz dla wszystkich myszy i wszystkich eksperymentalnych punktów czasowych⁹.
5. Wykonaj odpowiednią analizę statystyczną na zebranych danych. W tym przypadku użyliśmy JMP 9.0 (SAS, Cary, NC) do przeprowadzenia jednokierunkowej analizy ANOVA i Tukey HSD post hoc.

Wyniki

Miejscowe podanie jadu B. jararaca powoduje zmiany w czułości dotykowej tylnej łapy oraz obrzęk tkanek u samców myszy szwajcarskich ND4.

1,5 h po podaniu 45 µg/kg jadu B. jararaca, samce myszy szwajcarskich ND4 cofały tylne łapy przy nacisku o 3,0 g niższym niż wartość wyjściowa (Rysunek 1A). Wartość wyjściowa cofania łap dla wszystkich grup wynosiła ~4,5 g przyłożonego nacisku; po podaniu jadu myszy eksperymentalne cofały tylne łapy przy nacisku 1-1,5 g (dane nie zostały przedstawione). Myszy kontrolne traktowane solą fizjologiczną wykazały niewielki lub żaden spadek reakcji na nacisk w porównaniu z wartością wyjściową we wszystkich badanych punktach czasowych. Obniżone progi reakcji u myszy traktowanych były wyraźnie utrzymywane w 3. i 6. godzinie po enwenomacji (Rysunek 1A) i stały się nierozróżnialne od grupy kontrolnej do 24. godziny (dane nie zostały przedstawione). Tylne łapy myszy po enwenomacji wykazywały obrzęk tkanek charakterystyczny dla stanu zapalnego. W 1,5 h po podaniu jadu tylne łapy myszy traktowanych, mierzone zgodnie z wcześniejszym opisem¹⁰, były o 1,5 mm grubsze niż w wartości wyjściowej; obrzęk utrzymywał się przez 3. i 6. godzinę (Rysunek 1B). W przeciwieństwie do nich, łapy traktowane solą fizjologiczną nie wykazały opuchlizny ani zmiany grubości w okresie eksperymentalnym. W reprezentatywnym eksperymencie przedstawionym tutaj, do pomiarów wyjściowych wykorzystano łącznie 21 myszy, z czego 14 wybrano do udziału w eksperymencie. Zostały one przypisane do grup terapeutycznych w taki sposób, aby średnie reakcje cofania w wartości wyjściowej wynosiły około 4,5 g dla każdej grupy jako całości.

B. jararaca wywołane jadem zmiany w wrażliwości dotykowej towarzyszą degranulacji komórek tucznych i napływowi neutrofili do tylnych łap samców myszy szwajcarskich ND4.

Oprócz zwiększonej wrażliwości dotykowej i obrzęku tkanek, oceniliśmy również napływ neutrofili (Rysunki 2A-B) oraz degranulację komórek tucznych (Rysunki 2C-D) w tylnych łapach myszy po wstrzyknięciu jadu w porównaniu z myszami traktowanymi solą fizjologiczną. Neutrofile są pierwszymi komórkami zapalnymi rekrutowanymi z krążenia do miejsca uszkodzenia i wiadomo, że pośredniczą one w zapalnych odpowiedziach nocyceptywnych^10,16,17. Komórki tuczne są tkankowymi komórkami wartowniczymi¹⁸, a ich degranulacja była wiązana z odpowiedziami nocyceptywnymi w tylnych łapach myszy¹⁰ oraz w oponie twardej szczurów¹⁹.

Stwierdzono tutaj, że napływ neutrofili do tylnych łap po wstrzyknięciu jadu zwiększył się niemal 1000-krotnie w porównaniu z tylnymi łapami traktowanymi solą fizjologiczną (Rycina 3A), co oceniono poprzez zliczenie neutrofili w barwionych hematoksyliną i eozyną 4 µm przekrojach strzałkowych tkanki podeszwy zatopionych w parafinie¹⁰, pobranych od uśpionych myszy 1,5 h po podaniu jadu.

W łapach traktowanych solą fizjologiczną komórki tuczne podeszwy w tkance tylnej łapy pozostały w dużej mierze nienaruszone lub wykazały łagodne degranulowanie (Rysunek 3B). W przeciwieństwie do nich, w tylnych łapach poddanych działaniu jadu stwierdzono 20-15% umiarkowanego i rozległego degranulowania komórek tucznych (Rysunek 3B). Opisane powyżej przekroje tkankowe zabarwiono błękitem toluidyny, a liczbę widocznych ziarn policzono w każdej zaobserwowanej komórce tucznej, aby ustalić stopień degranulowania zgodnie z wcześniejszym opisem¹⁰.

Rysunek 1. Lokalny B. jararaca podanie jadu powoduje zmiany w mechanicznej wrażliwości tylnej łapy oraz obrzęk tkankowy u samców myszy szwajcarskich szczepu ND4. Wyjściowe progi wycofania oraz wyjściowa szerokość łapy były oceniane 48 i 24 godziny przed podaniem wewnątrzpodeszwowym B. jararaca jad (Bjv; 45 µg/kg) lub podanie nośnika (soli fizjologicznej) (10 µl). Progi wycofywania oceniano w 1,5, 3 i 6 godzinie po zastosowaniu leczenia (A). Aśrednia szerokość łapy (średnia szerokość lewej i prawej łapy myszy) w środkowej części podeszwy oceniono za pomocą suwmiarki cyfrowej w punkcie wyjściowym, a następnie po 1,5, 3 i 6 godzinach od zastosowania leczenia, aby określić obrzęk tkanek zgodnie z wcześniejszym opisem¹⁰ (B). Istotność statystyczną porównano z myszami traktowanymi solą fizjologiczną (* = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < odpowiednio 0,001). n = 10–11 myszy na grupę terapeutyczną. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Rysunek 2. Nadwrażliwość mechaniczna wywołana jadem B. jararaca towarzyszy degranulacji komórek tucznych i napływowi neutrofili do tylnych łap samców myszy szwajcarskich ND4. U 3 myszy na grupę zabiegową wykonano eutanazję za pomocą CO₂ 1,5 hr po zabiegu , a następnie wycięto tylne łapy, które przechowywano w 10% formalinie przez 24 hr, przeniesiono do 70% etanolu, odwapniono przez 1-2 tygodnie w 15% EDTA i zatopiono w parafinie. Przekroje strzałkowe o grubości 4 µm barwiono hematoksyliną i eozyną (A-B) oraz błękitem toluidyny (C-D) w celu wizualizacji odpowiednio neutrofili (A-B) i komórek tucznych (C-D). Obrazy pozyskano przy powiększeniu 400X i 1 000X zgodnie z opisem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz. 

Rycina 3. Nadwrażliwość mechaniczna wywołana jadem B. jararaca towarzyszy znacznemu wzrostowi poziomu degranulacji komórek tucznych oraz napływowi neutrofili do tylnych łap samców myszy ND4 Swiss. Neutrofile i komórki tuczne na barwionych przekrojach tkanek zliczano przy użyciu mikroskopu Olympus CX21LED. Neutrofile zliczano w 3 tylnych łapach na każdą grupę zabiegową, od pięty do palców, w sąsiadujących polach widzenia przy powiększeniu 400X (A). Komórki tuczne zliczano w 3 poduszkach stopy na każdą grupę zabiegową, a ich stopień degranulacji oceniano na podstawie liczby widocznych ziarnistek poza granicą komórki: nienaruszone (0), łagodna (0-10), umiarkowana (10-20), rozległa (21+), zgodnie z wcześniejszym opisem¹⁰ (B).  Aby uniknąć podwójnego liczenia tych samych komórek, badacze oceniający liczbę neutrofili i poziom degranulacji komórek tucznych w przekrojach tylnych łap stosowali siatkę wpisaną w siatkę okularową. Badacze nie znali przydziału grup zabiegowychs. Istotność statystyczną określano w porównaniu do myszy traktowanych roztworem soli fizjologicznej (odpowiednio * = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001). n = 3 myszy na grupę zabiegową.  Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Dyskusja

Pomiar zmian w reakcjach odstawienia jest ważnym narzędziem wykorzystywanym do oceny zmian wrażliwości dotykowej w modelach bólu i stanu zapalnego gryzoni. Tutaj pokazujemy użyteczność elektronicznego aparatu von Freya do przeprowadzenia tej oceny. Technika ta ma kilka zalet: i) możemy szybko ocenić reakcje odstawienia na zastosowany nacisk dla wielu myszy w wielu punktach czasowych, które są dość blisko siebie, ii) możemy użyć jednej końcówki do zastosowania ciągłego i specyficznego nacisku na mały obszar tkanki, iii) możemy dokładnie zmierzyć dokładny nacisk zastosowany w celu uzyskania reakcji odstawienia, oraz iv) możemy łatwo wdrożyć solidne punkty odcięcia, kryteria wykluczenia i kontrole wewnętrzne, aby zapewnić, że oceny zachowań są tak precyzyjne i obiektywne, jak to tylko możliwe.

Kluczowymi krokami zapewniającymi najlepsze wyniki testu EvF są wcześniejsza kalibracja przyrządu i spójne praktyki pomiarowe. Jak wyszczególniono w sekcji protokołu, z przyrządem należy obchodzić się ostrożnie, a przed i w trakcie użytkowania należy zapewnić odpowiednią kalibrację. Przed wykonaniem jakichkolwiek pomiarów należy potwierdzić odczyty wzorca masy testowej, aby zapewnić optymalne działanie maszyny. Jeśli odczyty ulegają znacznym wahaniom lub jeśli odczyty wzorca masy nie są dokładne, należy niezwłocznie skontaktować się z producentem w celu kalibracji urządzenia. Mając to na uwadze, zaleca się, jeśli to możliwe, posiadanie zapasowego elektronicznego aparatu von Freya, aby nie narażać na szwank eksperymentów wrażliwych na czas z powodu nieoczekiwanej potrzeby kalibracji instrumentu. Co więcej, pojedynczy, dobrze wyszkolony badacz powinien wykonać wszystkie pomiary podstawowe i eksperymentalne dla danego badania lub serii eksperymentów, pozostając ślepym na grupy leczone. Myszy powinny być oceniane w cichym pomieszczeniu, utrzymywane w stałej temperaturze, aklimatyzowane w komorach EvF przez co najmniej 15 minut, ale nie krępowane w komorze dłużej niż to konieczne (zwłaszcza jeśli wykonuje się wiele pomiarów w ciągu jednego dnia), aby zminimalizować zmiany w zachowaniu wywołane stresem i dyskomfortem.

Pomiary EvF oferują znaczące ulepszenia w stosunku do istniejących technik CvF. Badacze mogą stosować ciągły nacisk i nie muszą przełączać się między końcówkami o różnej wadze, jak ma to miejsce w eksperymentach z filamentami CvF⁶. Prowadzi to do mniejszej liczby ukłuć tkanki, co jest szczególnie istotne w przypadku tkanki objętej stanem zapalnym lub uszkodzonej. Dokładne ciśnienie, przy którym następuje wycofanie, może być zmierzone w porównaniu z pomiarami 50% wycofania, które są również ograniczone dostępnymi masami filamentów używanymi w pomiarach CvF¹³. Ponieważ można wdrożyć racjonalne i jednolite kryteria wykluczenia (jak omówiono powyżej), myszy można przypisać do grup eksperymentalnych w taki sposób, aby wszystkie grupy miały podobne średnie wartości wyjściowe na początku eksperymentu. Pomiary EvF oceniają zmiany w reakcji behawioralnej na dany bodziec, a nie same reakcje bezwzględne. W związku z tym zmiana odpowiedzi nocyceptywnej każdej myszy jest mierzona jako różnica między jej indywidualnym wycofaniem eksperymentalnym a wyjściowym, zapewniając w ten sposób wewnętrzną kontrolę dla każdego wykonanego pomiaru.

Być może najbardziej znaczącym ograniczeniem EvF jest to, że podobnie jak w przypadku jego ręcznego odpowiednika, ten sam badacz musi wykonać wszystkie pomiary dla określonej serii pomiarów podstawowych i eksperymentalnych. To sprawia, że skalowanie techniki jest wyzwaniem z punktu widzenia czasu, personelu i sprzętu. Okazuje się, że ~20 myszy na raz (w zależności od konfiguracji komór testowych) można zmierzyć w ciągu 30-45 minut lub mniej w wielu punktach czasowych, pod warunkiem, że między pomiarami jest co najmniej 45 minut. Pokrewną kwestią w tym względzie jest krzywa uczenia się poszczególnych eksperymentatorów. Wewnętrzna spójność musi zostać ustalona, zanim pojedynczy badacz będzie mógł rozpocząć eksperyment na pełną skalę, a to wymaga wielu godzin poświęconej praktyki, obejmującej powtarzające się pomiary odpowiedzi wyjściowej, aż do osiągnięcia pożądanej spójności. Ponadto użycie wartości odcięcia linii bazowej oznacza, że nie wszystkie myszy z bazą do eksperymentu mogą zostać uwzględnione; Okazuje się, że 25-30% myszy z wartością bazową na eksperyment jest zwykle wykluczonych.

Jeśli chodzi o modyfikacje i przyszłe zastosowania, pomiary behawioralne EvF dodają potężny wymiar do szerokiej gamy modeli stanu zapalnego w celu analizy współistniejącego ostrego i/lub przewlekłego bólu, który może leżeć u podstaw patologii zapalnych. W przypadku jadu stwierdziliśmy, że wyraźne, szybkie zmiany wrażliwości dotykowej towarzyszyły oczekiwanym wynikom obrzęku tkanek, rekrutacji leukocytów i degranulacji komórek tucznych w tylnych łapach samców myszy ND4. Odkrycia te potwierdzają wcześniejsze obserwacje dotyczące udziału mediatorów komórek tucznych we wrażliwości termicznej u szczurów²⁰ i wrażliwości mechanicznej indukowanej przez jad B. jararaca u szwajcarskich myszy ND4 mierzonych za pomocą CvF²¹. Protokół EvF można łatwo zmodyfikować do stosowania na tkankach innych niż tylna łapa , np. brzuch⁷ i grzbiet odbytu i narządów płciowych⁸ , gdzie obecnie stosuje się CvF. Modele alergii, gojenia się ran, neuropatii i innych patologii u gryzoni można łatwo dostosować do pomiarów wrażliwości mechanicznej w tkankach, w tym i poza tylną łapą.

Podsumowując, EvF jest użyteczną i skuteczną techniką, która aktualizuje klasyczne podejście do pomiaru nocycepcji u gryzoni i jest ważnym nowym narzędziem w badaniu złożonych mechanizmów leżących u podstaw bólu w szerokim zakresie modeli chorób.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ND4 Szwajcarskie samce myszy	Harlan	0-32	Użyte tutaj myszy miały 8-12 tygodni i były trzymane i używane zgodnie z wytycznymi IACUC Macaleter College.
3 ml/100 Strzykawka insulinowa z igłą 29 G 1/2 in	BD	BD309301	Po każdym użyciu przelać do odpowiedniego pojemnika.
B. jararaca jad	Sigma	V5625	UWAGA: Substancja toksyczna. Nosić ochronę oczu i skóry. Rozpuścić w sterylnym 0,9% roztworze soli fizjologicznej.
Elektroniczny aparat von Freya; sonda = zakres 90 g	IITC	2394	Poruszaj się delikatnie i upewnij się, że zawsze jest poziomy. Aby wyzerować sondę, naciśnij "Program" i "Wyczyść". Aby przełączyć się z trybu konfiguracji do trybu pracy, naciśnij "Funkcja" (dla odczytu "MH") lub "MAX".
Stojak siatkowy + komory PMMA	IITC	410	Umieść na stabilnym blacie lub wózku z czterema kołami, aby uzyskać dostęp ze wszystkich stron.
Tylko sztywne końcówki elektroniczne von Frey, zakres 90 g	IITC	2390	n/a