Cytotoksyczna skuteczność terapii fotodynamicznej w komórkach kostniakomięsaka in vitro

Podsumowanie

Opisany tutaj protokół pozwala na ocenę skuteczności terapii fotodynamicznej (PDT) w liniach komórkowych i optymalizację ustawień PDT przed zastosowaniem terapii na modelach zwierzęcych.

Streszczenie

W ostatnich latach pojawiły się trudności ze znalezieniem bardziej skutecznych terapii przeciwko rakowi z mniej ogólnoustrojowymi skutkami ubocznymi. Dlatego terapia fotodynamiczna jest nowatorskim podejściem do bardziej selektywnego leczenia nowotworu.

Terapia fotodynamiczna (PDT) wykorzystująca nietoksyczny fotosensybilizator (PS), który po aktywacji światłem o określonej długości fali w obecności tlenu generuje rodniki tlenowe, które wywołują reakcję cytotoksyczną¹. Pomimo zatwierdzenia przez FDA prawie dwadzieścia lat temu, PDT jest obecnie stosowana tylko w leczeniu ograniczonej liczby rodzajów raka (skóra, pęcherz moczowy) i chorób nieonkologicznych (łuszczyca, rogowacenie słoneczne)².

Główną zaletą stosowania PDT jest możliwość przeprowadzenia miejscowego leczenia, co zapobiega ogólnoustrojowym skutkom ubocznym. Ponadto pozwala na leczenie nowotworów w delikatnych miejscach (np. wokół nerwów czy naczyń krwionośnych). W tym przypadku rozważa się śródoperacyjne zastosowanie PDT w kostniakomięsaku (OS), guzie kości, w celu celowania w pierwotne satelity guza pozostawione w tkance otaczającej guz po chirurgicznej resekcji guza. Leczenie ma na celu zmniejszenie liczby nawrotów oraz zmniejszenie ryzyka przerzutów (pooperacyjnych).

W obecnym badaniu prezentujemy procedury PDT in vitro, aby ustalić optymalne ustawienia PDT dla skutecznego leczenia powszechnie stosowanych linii komórkowych OS, które są używane do rozmnażania ludzkiej choroby w dobrze znanych mysich modelach OS piszczelowych. Wychwyt PS mTHPC badano za pomocą spektrofotometru, a fototoksyczność prowokowano za pomocą wzbudzenia mTHPC światłem laserowym przy długości fali 652 nm w celu wywołania śmierci komórki ocenianej za pomocą testu WST-1 i zliczania komórek, które przeżyły. Sprawdzone techniki pozwalają nam określić optymalne ustawienia PDT dla przyszłych badań na modelach zwierzęcych. Są one łatwym i szybkim narzędziem do oceny skuteczności PDT in vitro przed zastosowaniem in vivo.

Wprowadzenie

Dzisiejsze najnowocześniejsze leczenie kostniakomięsaka (OS), pierwotnego guza kości, obejmuje połączenie neoterapii uzupełniającej i chirurgii. Ten schemat leczenia wykazał wzrost przeżywalności pacjentów z chorobą zlokalizowaną z około 20% przed zastosowaniem chemioterapii do obecnie między 60-70%^3,4. Jednak w ciągu ostatnich dwóch dekad całkowite przeżycie pacjentów z OS z chorobą miejscową ustabilizowało się na poziomie ^4,5. Co więcej, u 30-40% tych pacjentów dochodzi do nawrotu choroby w ciągu 3 lat od rozpoznania, a pacjenci z chorobą przerzutową nadal mają słabe przeżycie wynoszące 20-30%^4,6,7. Aby poprawić wyniki leczenia tych pacjentów, należy opracować nowe strategie terapeutyczne.

Terapia Fotodynamiczna (PDT), dość nowatorska terapia przeciwnowotworowa, wykorzystuje światło o określonej długości fali do wzbudzenia fotosensybilizatora (PS), który gromadzi się w komórkach nowotworowych po wstrzyknięciu do krwiobiegu. Wzbudzenie światłem laserowym PS generuje rodniki tlenowe w obecności tlenu, które indukują reakcję cytotoksyczną w komórkach nowotworowych i śmierć komórki. Oprócz tego podstawowego mechanizmu, dwa dodatkowe procesy biologiczne wywołane PDT przyczyniają się do zmniejszenia wzrostu guza: PDT powoduje zwężenie naczyń krwionośnych i tworzenie się skrzepliny w mikrokrążeniu guza, a w konsekwencji miejscowe niedotlenienie i niedotlenienie wewnątrz guza, co prowadzi do zawału guza. Wreszcie, uszkodzone i umierające komórki nowotworowe PDT wywołują miejscową odpowiedź immunologiczną, co jest dość unikalną cechą PDT. Wiąże się to z układem dopełniacza i aktywacją komórek dendrytycznych^{prezentujących} antygen 8. W ten sposób tworzone są warunki do prezentacji antygenów nowotworowych z późniejszą aktywacją komórek limfatycznych, co prowadzi do odporności swoistej dla nowotworu.

Do tej pory PDT było stosowane w leczeniu kilku typów guzów tkanek miękkich i hiperplazji, takich jak rogowacenie słoneczne, przełyk Barretta, guzy wewnątrzoskrzelowe, rak pęcherza moczowego, rak podstawnokomórkowy oraz paliatywne leczenie raka głowy i szyi². Wiadomo, że leczenie wywołuje miejscową martwicę na dużą skalę z niewielkimi skutkami ubocznymi, a zatem ma potencjał do selektywnego eliminowania tkanki nowotworowej. Pomimo tych zalet zastosowanie PDT pozostaje technicznie bardziej wymagające niż podawanie leków chemioterapeutycznych. Aby osiągnąć maksymalną skuteczność, należy zoptymalizować stężenie PS, czas ekspozycji na światło i całkowity transfer energii świetlnej. Można to zrobić w eksperymentach in vivo, ale ze względu na stosunkowo dużą liczbę parametrów, które należy zoptymalizować, bardziej efektywne jest wstępne określenie optymalnych warunków in vitro.

W eksperymentach opisanych poniżej, testowaliśmy skuteczność in vitro PDT przy użyciu PS 5,10,15,20-tetrakis(meta-hydroksyfenylo)chloriny, w skrócie mTHPC (Rysunek 1A). mTHPC jest substancją czynną produktu leczniczego Foscan, który jest obecnie stosowany w klinice do paliatywnego leczenia raka głowy i szyi. Jest to jeden z najsilniejszych PS, wywołujący masywne uszkodzenia komórek już przy niskich stężeniach i wykazano, że jest lepszy od innych PS pod względem penetracji tkanek ^9,10. Jego widmo absorpcji światła (ryc. 1B) pokazuje dwa wyraźne piki, jeden przy 417 nm, a drugi przy 652 nm, które są wykorzystywane odpowiednio do lokalizacji tkankowej akumulującego się PS i do indukcji PDT.

Obecnie trwają prace nad liposomalnym preparatem dla mTHPC. W tym miejscu opisujemy procedury ilościowego określania wchłaniania tego preparatu liposomalnego oraz wykonywania PDT w dwóch ludzkich liniach komórkowych OS ; nisko przerzutowe HOS i wysokoprzerzutowe komórki 143B. Niektóre z przedstawionych tu danych zostały zgłoszone wcześniej¹¹. Opisane tutaj podejście umożliwia nam zbadanie wpływu fenotypu przerzutowego na skuteczność PDT. Limfocyty 143B, wstrzykiwane ortotopowo do tylnych kończyn myszy z SCID z niedoborem odporności, powodują pierwotne guzy z przerzutami do kości piszczelowej, model ściśle naśladujący ludzką chorobę przerzutową. W związku z tym proponowane eksperymenty in vitro doskonale nadają się do oceny optymalnych ustawień PDT, które mają być później wykorzystane w eksperymentach in vivo.

Protokół

1. Porównanie wychwytu mTHPC w odpowiednich liniach komórkowych HOS i 143B OS o niskim i wysokim poziomie przerzutów

1. Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych zawierającą DMEM, szynkę F12 i podgrzać inaktywowaną płodową surowicę cielęcą w stosunku 4,5:4,5:1,
   nuta: Liposomalny preparat PS mTHPC rozpuszczono w wodzie w końcowym stężeniu 1,5 mg/ml mTHPC.
2. Płytka 0,2 x 10⁶ komórek HOS i 143B / studzienka na płytkach 6-dołkowych (trzykrotnie dla każdego warunku) i pozwól komórkom przylegać przez noc.
   Uwaga: liczba musi być dostosowana do poszczególnych linii komórek. Zbieg 80-90% jest najbardziej odpowiedni w czasie eksperymentu.
3. Następnego dnia należy inkubować komórki ze stałym stężeniem mTHPC przez różne okresy czasu (wychwyt zależny od czasu) lub ze wzrostem stężenia mTHPC w ustalonym okresie czasu (wychwyt zależny od dawki).
4. Inkubować komórki z mTHPC dla określonych punktów czasowych lub stężeń mTHPC.
   Uwaga: W tym badaniu zarówno linie komórkowe HOS, jak i 143B inkubowano z 0,6 μg/ml mTHPC przez 0, 2,5, 5 lub 10 godzin lub z 0, 0,6, 2,5 i 10 μg/ml mTHPC przez 5 godzin. Stosowane okresy i dawki mogą się różnić w zależności od używanej linii komórkowej.
5. Pamiętaj, aby zawsze pracować w ciemności lub w przyciemnionych warunkach oświetleniowych, aby zapobiec bezpośredniemu narażeniu ogniw na światło.
6. Po inkubacji komórek we wskazanych warunkach należy odessać pożywkę i trzykrotnie przemyć komórki PBS. Następnie odłącz komórki za pomocą 0,5 ml trypsyny/EDTA i policz komórki.
7. Po odłączeniu odwirować komórki przy 400 x g przez 5 minut, odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w PBS do końcowej gęstości 200 000 komórek/ml.
8. Pobrać pipetę 100 μl otrzymanej zawiesiny komórek (tj. 20 000 komórek) na płytkę 96-dołkową i zmierzyć fluorescencję tych komórek w spektrofotometrze fluorescencyjnym. Ustawienia dla pomiarów fluorescencji mTHPC to: 417 nm dla wzbudzenia i 652 nm dla emisji.
9. Aby obliczyć ilość zinternalizowanego mTHPC na komórkę, znormalizuj względną jednostkę fluorescencji (RFU) dla liczby komórek i objętości komórek w następujący sposób:
10. Przygotować krzywą wzorcową, stosując różne stężenia mTHPC w PBS od 0 do 4 μg/ml (użyć trzykrotnych pomiarów). Odpipetować 100 μl każdego rozcieńczenia na płytce 96-dołkowej i zmierzyć fluorescencję studzienek, stosując ustawienia opisane w kroku 1.6.
11. Podziel RFU (uzyskane dla 20 000 komórek) przez nachylenie liniowej krzywej wzorcowej mTHPC, co daje stężenie mTHPC (w μg/ml) w studzience.
12. Podziel to stężenie mTHPC przez 10, aby uzyskać całkowitą ilość mTHPC w jednym dołku (w μg, co odpowiada 100 μl zawiesiny komórek) i podziel tę wartość przez objętość 20 000 komórek.
13. Oblicz objętość za pomocą wzoru na kulę: (4/3 x π) x r³. Uzyskaj promień r, mierząc średnicę 20 trypsynizowanych komórek pod mikroskopem i dzieląc tę wartość przez 2.
14. Na koniec znormalizuj wszystkie wartości do tych uzyskanych dla komórek HOS po 10 godzinach inkubacji (wychwyt zależny od dawki) lub potraktowany 10 μg/ml mTHPC (wychwyt zależny od czasu), które ustawiono na 100%.

2. Pomiar fototoksyczności PS In Vitro

1. Wysiewaj 3,000 komórek/studzienkę na 96-dołkowej płytce (trzykrotnie na każde stężenie użytego mTHPC) i pozwól im przylegać przez noc. Podobnie przygotuj dodatkową 96-dołkową płytkę i potraktuj komórki zgodnie z opisem poniżej, ale następnie odłóż je na bok do obrazowania z kontrastem fazowym.
   Uwaga: liczba musi być dostosowana dla każdej pojedynczej linii komórek. Idealnie nadaje się zbieg 50-60% w czasie eksperymentu.
   1. Należy pamiętać, aby dodać odpowiednią kontrolę ciemnej toksyczności komórek dla każdego ze stężeń mTHPC. Są to komórki, które będą inkubowane przy braku lub obecności wybranych stężeń mTHPC, ale nie będą oświetlane.
2. Następnego dnia inkubuj komórki o różnych stężeniach mTHPC (0, 0,0001, 0,001, 0,01, 0,03, 0,075, 0,15, 0,3, 0,6, 1,25, 2,5, 5 i 10 μg/ml) w zależności od linii komórkowych i trzymaj je w ciemności przez 5 godzin.
   1. Patrz sekcja 1.3.2
      Uwaga: Czas inkubacji przed oświetleniem zależy od linii komórkowej i użytego PS, dlatego zaleca się testowanie różnych stężeń i różnych punktów czasowych w oddzielnych eksperymentach.
3. Po inkubacji przez wskazany okres czasu, przemyć komórki dwukrotnie PBS i dodać nową świeżą pożywkę bez mTHPC.
4. Oświetlić ogniwa laserem diodowym o długości fali 652 nm, specyficznym dla widma absorpcji mTHPC (patrz rysunek 1).
   1. Ustaw laser na moc 21,88 mW/^cm2 na wysokości 13,5 cm odległości od ogniw, w celu uzyskania dawki energii 5 J/^cm2. Oświetlaj ogniwa przez 230 sekund. Nie oświetlać ciemnych komórek kontroli toksyczności (z mTHPC i bez).
      nuta: Zawsze noś okulary, aby chronić oczy przed światłem laserowym używanym do wzbudzania PS.
5. Po naświetleniu utrzymuj ogniwa w ciemności w temperaturze 37 ºC przez 24 godziny. Następnie dodać rozpuszczalny w wodzie odczynnik tetrazolowy (WST-1) (10 μl/100 μl pożywki).
6. Trzy godziny po dodaniu odczynnika WST-1 zmierzyć absorbancję poszczególnych studzienek płytki 96-dołkowej przy długości fali 415 nm.
7. Aby obliczyć odsetek komórek, które przeżyły, należy ustawić średnią wartości uzyskanych dla komórek nietraktowanych mTHPC dla każdego stanu na 100% (tj. oświetlone, bez mTHPC i nieoświetlone, bez mTHPC).

3. Szacowanie numeru komórki na podstawie zliczania komórek

1. Wysiej 20 000 komórek/studzienkę na 24-dołkowej płytce i pozwól im przylegać przez noc.
2. Inkubować komórki przez 5 godzin z mTHPC (0,001, 0,003, 0,15, 0,6 i 1,25 μg/ml) i oświetlać je zgodnie z powyższym opisem.
3. Zebrać pożywkę, przemyć komórki raz PBS, trypsynizować je i zbierać przez odwirowanie przy 400 x g przez 5 minut.
4. Po odwirowaniu odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w 200 μl świeżej pożywki.
5. Policz komórki w komorze Neubauera.

Wyniki

Za pomocą opisanych tutaj technik, zbadaliśmy PDT oparte na mTHPC w ludzkich komórkach OS. Po pierwsze, zbadano zależny od czasu i dawki wychwyt mTHPC w liniach komórkowych 143B OS o niskim poziomie przerzutów oraz w liniach komórkowych 143B OS o wysokim stopniu przerzutów. Wychwyt mTHPC można ocenić, mierząc fluorescencję mTHPC za pomocą spektrofotometru fluorescencyjnego (ryc. 2, odtworzony za zgodą Reidy i wsp.¹¹). Rysunek 2A ilustruje wychwyt mTHPC w sposób zależn...

Dyskusja

Aby osiągnąć optymalną cytotoksyczność w odpowiedzi na PDT, kluczowe znaczenie ma wybór odpowiednich ustawień światła laserowego i czasu inkubacji. Opisane tutaj procedury są spójne i skuteczne w określaniu wychwytu PS i ilościowym określaniu cytotoksyczności indukowanej PDT in vitro. Korzystając ze specyficznych długości fal absorpcyjnych PS mTHPC, wychwyt komórkowy PS można określić w sposób bezpośredni, a PS można aktywować w celu wytworzenia cytotoksycznych reaktywnych form tlenu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM	PAA GmbH, Fryburg, Niemcy	E15-883
HAM F12	PAA GmbH, Fryburg, Niemcy	E15-817
Inaktywowana termicznie surowica cielęca	płodu GIBCO, Bazylea, Szwajcaria	10500-064
mTHPC	biolitec Research GmbH, Jena, Niemcy		Ponieważ ten preparat liposomalny pochodzi z R& D w chwili obecnej nie jest dostępny numer katalogowy. Zapas: 1,5 mg/ml; dostarczany w mieszaninie 9:1 dipalmitoilofosfatydylocholiny (DPPC) i dipalmitoilofosfatydyloglicerolu (DPPG; >czystość 99%)
Czytnik płytek Spectramax Gemini XS	Urządzenia molekularne, Sunnyvale, CA	ID# 861
Mikroskop Zeiss Observer.Z1	Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Niemcy
Ceralas PDT 652 nm Laser	biolitec AG, Jena, Niemcy	LD652nm2W400u
Rozpuszczalny w wodzie odczynnik tetrazolowy (WST)	Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Szwajcaria	1644807