Monitorowanie tworzenia się wydzielanego bakteryjnego czynnika wirulencji za pomocą sieciowania specyficznego dla miejsca

Podsumowanie

Ten artykuł ilustruje zastosowanie znakowania radiowego w pogoni za impulsami w połączeniu z fotosieciowaniem specyficznym dla danego miejsca do monitorowania interakcji między interesującym białkiem a innymi czynnikami w E. coli. W przeciwieństwie do tradycyjnych chemicznych metod sieciowania, podejście to generuje "migawki" o wysokiej rozdzielczości uporządkowanej ścieżki składania w żywej komórce.

Streszczenie

Ten artykuł opisuje metodę wykrywania i analizowania dynamicznych interakcji między interesującym białkiem a innymi czynnikami in vivo. Nasza metoda opiera się na technologii tłumienia bursztynu, która została pierwotnie opracowana przez Petera Schultza i współpracowników¹. Bursztynowa mutacja jest najpierw wprowadzana do określonego kodonu genu kodującego białko będące przedmiotem zainteresowania. Bursztynowy mutant ulega następnie ekspresji w E. coli wraz z genami kodującymi bursztynowe supresorowe tRNA i syntetazę aminoacylo-tRNA pochodzącą z Methanococcus jannaschii. Za pomocą tego systemu fotoaktywowany analog aminokwasu p-benzoilofenyloalanina (Bpa) jest włączony do bursztynowego kodonu. Komórki są następnie naświetlane światłem ultrafioletowym w celu kowalencyjnego połączenia reszty Bpa z białkami znajdującymi się w granicach 3-8 A. Fotosieciowanie przeprowadza się w połączeniu ze znakowaniem impulsowym i immunoprecypitacją białka będącego przedmiotem zainteresowania w celu monitorowania zmian w interakcjach białko-białko, które zachodzą w skali czasu od sekund do minut. Zoptymalizowaliśmy procedurę, aby zbadać składanie bakteryjnego czynnika wirulencji, który składa się z dwóch niezależnych domen, domeny zintegrowanej z błoną zewnętrzną i domeny, która jest translokowana do przestrzeni zewnątrzkomórkowej, ale metoda może być stosowana do badania wielu różnych procesów składania i szlaków biologicznych zarówno w komórkach prokariotycznych, jak i eukariotycznych. Zasadniczo za pomocą spektrometrii mas można zidentyfikować czynniki oddziałujące, a nawet specyficzne reszty czynników oddziałujących, które wiążą się z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania.

Wprowadzenie

Często konieczne jest zidentyfikowanie i scharakteryzowanie interakcji między interesującym białkiem a innymi składnikami komórkowymi, aby określić jego rolę w szlaku biologicznym, zrozumieć jego składanie lub wyjaśnić mechanizm jego działania. Do badania interakcji białko-białko powszechnie stosuje się wiele różnych podejść, ale wszystkie mają swoje ograniczenia. Najprostszą bezstronną metodą identyfikacji białek, które wiążą się z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania, jest kooczyszczanie (lub koimmunoprecypitacja), ale takie podejście wymaga, aby kompleks białkowy pozostał nienaruszony podczas procedury oczyszczania. Słabe lub przejściowe interakcje białek można ustabilizować poprzez chemiczne sieciowanie, ale ta metoda zazwyczaj wymaga użycia związków, które łączą białka za pośrednictwem amin pierwszorzędowych, które są szeroko rozproszone w sekwencji białka. Można generować skomplikowane wzorce sieciowania, które są trudne do interpretacji, zwłaszcza gdy interesujące białka są składnikami kompleksów wielobiałkowych. Ponadto, ponieważ ramiona dystansowe chemicznych środków sieciujących zwykle przekraczają długość 10 A, wiązania kowalencyjne mogą być tworzone z białkami, które znajdują się w pobliżu, ale nie oddziałują bezpośrednio z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Metody takie jak chromatografia powinowactwa i badania przesiewowe dwóch hybryd są również często przydatne do identyfikacji interakcji białko-białko. Pierwsze podejście wymaga jednak odtworzenia warunków, które sprzyjają fizjologicznie istotnym interakcjom i nie mogą być wykorzystywane do wykrywania słabych interakcji. To ostatnie podejście wymaga, aby interakcje wiążące mogły być replikowane w organizmie gospodarza i były utrzymywane, gdy białko będące przedmiotem zainteresowania i jego partnerzy wiążący są umieszczane w kontekście białka fuzyjnego. Metody dwuhybrydowe mają również tendencję do generowania wyników fałszywie dodatnich². Po ustaleniu interakcji białko-białko często konieczne jest znaczne nałożenie pracy na mapowanie miejsca interakcji. Być może najważniejszą wadą tradycyjnych podejść jest to, że nie dostarczają one żadnych informacji na temat czasowej sekwencji oddziaływań międzycząsteczkowych ani kinetyki wiązania.

Ten artykuł opisuje prostą metodę, która pokonuje niektóre ograniczenia innych podejść, które są używane do badania interakcji białko-białko. Początkowo do genu kodującego białko o znaczeniu bawełnianym wprowadzana jest pojedyncza mutacja bursztynowa. Bursztynowy mutant ulega następnie koekspresji z bursztynowym supresorowym tRNA i syntetazą aminoacylo-tRNA pochodzącą z Methanococcus jannaschii, które zostały zaprojektowane tak, aby zawierały fotoaktywowany analog aminokwasu p-benzoilofenyloalaniny (Bpa) tylko w bursztynowych kodonach³. Naświetlanie komórek światłem ultrafioletowym (UV) o dużej długości fali (~365 nm) ułatwia następnie tworzenie wiązania kowalencyjnego między Bpa a białkami mieszczącymi się w zakresie ~3-8 A^4,5. W niektórych kontekstach eksperymentalnych mogą również powstawać wiązania krzyżowe między aktywowanym Bpa a niebiałkowymi składnikami komórek, takimi jak lipidy i kwasy nukleinowe⁶. Cząsteczki, które są zakończone na bursztynowym kodonie, powinny być na ogół łatwe do odróżnienia od pełnowymiarowego białka na SDS-PAGE i nie mogą być sieciowane z innymi białkami. Poddając komórki znakowaniu radioaktywnemu impulsowo przed sieciowaniem, a następnie immunoprecypitacji lub produktom sieciowania oczyszczającym powinowactwo, można ustalić sekwencję i czas trwania interakcji białko-białko. Zdolność do generowania czasowych informacji o interakcjach międzycząsteczkowych jest szczególnie cenna w badaniu progresji białka będącego przedmiotem zainteresowania przez dowolny uporządkowany wieloetapowy szlak składania, transportu lub sygnalizacji oraz w identyfikowaniu produktów pośrednich szlaku. Podobnie jak sieciowanie chemiczne, sieciowanie specyficzne dla miejsca wykrywa interakcje białko-białko, które zachodzą w warunkach fizjologicznych, ale wprowadzenie sieciownika w jednej pozycji ułatwia analizę interakcji między poszczególnymi segmentami białka a innymi czynnikami. Ta unikalna cecha sieciowania specyficznego dla miejsca jest szczególnie korzystna, gdy białko będące przedmiotem zainteresowania ma wiele segmentów lub domen, które mają potencjał do interakcji z różnymi partnerami wiążącymi. Co więcej, sieciowanie specyficzne dla danego miejsca może być stosowane w połączeniu z metodami takimi jak spektrometria mas w celu precyzyjnego mapowania reszt, które pośredniczą w interakcjach białko-białko. Chociaż metoda ta jest zoptymalizowana do stosowania w E. coli, włączenie analogów aminokwasów fotaktywowanych do białek przez supresję bursztynu odnotowano w Mycobacterium, drożdżach i komórkach ssaków^7-11. Dzięki temu w zasadzie nasza metoda może być stosowana w innych systemach.

Intensywnie używaliśmy tej metody do identyfikacji interakcji międzycząsteczkowych, które ułatwiają biogenezę EspP, czynnika wirulencji E. coli O157:H7. EspP należy do nadrodziny białek znanych jako "autotransportery", które zawierają dużą N-końcową domenę zewnątrzkomórkową ("domena pasażera") i domenę aC-końcową ("domena b"), która składa się w cylindryczną strukturę beczki b i zakotwicza białko w błonie zewnętrznej (OM)¹². Mechanizm, za pomocą którego domena pasażerów jest przenoszona przez OM, od dawna był tajemnicą. Podobnie jak wszystkie białka powierzchniowe komórek bakteryjnych, EspP musi być transportowany przez błonę wewnętrzną, transportowany przez peryplazmę (przestrzeń między błoną wewnętrzną i zewnętrzną) i kierowany do OM w serii uporządkowanych zdarzeń. Po translokacji przez OM, domena pasażerska EspP jest również oddzielana od domeny b przez rozszczepienie proteolityczne i uwalniana z powierzchni komórki. Łącząc sieciowanie specyficzne dla miejsca z radioznakowaniem impulsowym, wykazaliśmy, że obie domeny białka początkowo oddziałują z molekularnym chaperonem Skp w peryplazmie⁶. Następnie dyskretne segmenty domeny b oddziałują w sposób stereospecyficzny ze składnikami heterooligomeru zwanego kompleksem Bam, który katalizuje integrację białek beczkowych b z bakteryjnym OM za pomocą nieznanego mechanizmu. Być może najciekawsze jest to, że odkryliśmy, że domena pasażerska jest w kontakcie z jedną z podjednostek kompleksu Bam (BamA) podczas jej przechodzenia przez OM¹³. Nasze wyniki pozwoliły nam skonstruować szczegółowy model montażu autotransportera¹⁴ i uwikłać kompleks Bam w transport domeny pasażerskiej przez OM.

Protokół

1. Budowa plazmidu

1. Po sklonowaniu genu, który koduje interesujące białko do odpowiedniego wektora ekspresji, wprowadź mutacje bursztynowe w pożądanych lokalizacjach za pomocą zestawu do mutagenezy ukierunkowanej na miejsce.
   UWAGA: Informacje strukturalne i przewidywania ekspozycji powierzchniowej mogą służyć jako użyteczne przewodniki do określania pozycji mutacji. Ponieważ skuteczność tłumienia i sieciowania bursztynu może się znacznie różnić, mutacje bursztynu powinny być wprowadzane w wielu pozycjach. Ponadto, ponieważ Bpa jest analogiem tyrozyny i fenyloalaniny, należy spróbować wprowadzić mutacje bursztynu w pozycjach, które normalnie kodują duże hydrofobowe aminokwasy, aby zminimalizować zaburzenia struktury i funkcji białka. Wreszcie, wybierając wektor ekspresji, należy pamiętać, że nadprodukcja białka będącego przedmiotem zainteresowania na bardzo wysokim poziomie może ograniczyć efektywność inkorporacji Bpa.

2. Przygotowanie kultury

1. Użyj elektroporacji, aby przekształcić odpowiedni szczep E. coli z plazmidem, który koduje bursztynowy system supresyjny (pDULE-p Bpa; patrz odniesienie⁴) i kompatybilnym plazmidem, który koduje białko będące przedmiotem zainteresowania z bursztynową mutacją.
2. Płytki komórkowe na agarze LB zawierające odpowiednie antybiotyki (użyć 5 μg/ml tetracykliny do wyboru pDULE-p Bpa). Inkubować płytki O/N w temperaturze 37 °C.
3. Następnego dnia rozpocznij hodowle O/N z pojedynczych kolonii w 3-5 ml pożywki M9¹⁴ zawierającej 0,2% glicerolu, wszystkie L-aminokwasy z wyjątkiem metioniny i cysteiny (40 μg/ml) oraz antybiotyki. Inkubować w temperaturze 37 °C.
4. Następnego dnia odwirować kultury O/N o masie 2,500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia komórek. Ponownie zawiesić komórki w 5 ml świeżej pożywki M9 i powtórzyć wirowanie.
   UWAGA: Ten etap płukania ma kluczowe znaczenie dla utrzymania plazmidów, które kodują oporność na ampicylinę, ponieważ niewielkie ilości laktamazy b, które są obecne w pożywce z kultur O/N, rozkładają świeżo dodaną ampicylinę, zanim nastąpi znaczny wzrost komórek.
5. Zawiesić komórki w 2 ml świeżej pożywki i zmierzyć stężenie komórek w spektrofotometrze (OD₅₅₀).
6. Dodać komórki do kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml zawierającej 50 ml pożywki M9 i antybiotyków o OD₅₅₀ = 0,03. Inkubować kultury w temperaturze 37 °C w wytrząsającej łaźni wodnej.

3. Włączenie Bpa i przygotowanie do fotosieciowania

UWAGA: Protokół opisany poniżej dotyczy przykładowego kursu czasowego, który ma trzy punkty czasowe (0, 1 i 5 minut). Dostosuj odpowiednio głośność, jeśli pożądana jest inna liczba punktów czasowych. Zarys procedury przedstawiono na rysunku 1.

1. Podczas gdy kultury rosną, przygotuj świeży 1 M (1,000x) roztwór Bpa w 1 M NaOH (27 mg Bpa w 100 μl 1 M NaOH). Użyj rurki o ciemnych ściankach, aby utrzymać roztwór w ciemności.
2. Gdy kultury osiągną wczesną do środkowej fazy logarytmicznej (OD₅₅₀ = 0,2), dodaj 50 μl 1 M Bpa do każdej kultury. Dodawaj Bpa po jednej kropli na raz, obracając kolbę, aby uniknąć wytrącania się. Następnie dodaj wszelkie induktory, które są potrzebne do napędzania ekspresji bursztynowego mutanta. Kontynuować inkubację kultur w temperaturze 37 °C przez dodatkowe 30 minut.
3. Podczas 30-minutowego okresu indukcji oznaczyć sześć jednorazowych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml punktem czasowym (0 min, 1 min, 5 min) i "+ UV" lub "- UV". Umieść probówki na lodzie.
4. Napełnij drugie wiadro na lód lodem i umieść 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej na wierzchu lodu.
5. Rozmrozić ³⁵S-metioninę i 35 S-cysteinę o wysokiej aktywności właściwej (¹⁰⁰⁰mCi/mmol) (lub wstępnie przygotowaną mieszaninę tych dwóch związków) do znakowania impulsowego i przygotować (lub rozmrozić) roztwór nieradioaktywnej L-cysteiny i L-metioniny (po 100 mM każdy) do pościgu.
6. Włącz lampę UV pięć minut przed znakowaniem radioaktywnym.
   UWAGA: Lampa powinna być regulowana tak, aby można ją było ustawić ~3-4 cm od próbek w płytce wielodołkowej.
7. Dodaj lód (~2 ml) do każdej probówki oznaczonej "- UV" i do dwóch studzienek w płytce wielodołkowej.
   UWAGA: Lód należy dodać do trzeciego dołka bezpośrednio przed 5-minutowym punktem czasowym. Niezbędne jest umieszczanie lodu bezpośrednio w rurach i studzienkach, aby natychmiast zatrzymać reakcje wewnątrzkomórkowe w każdym punkcie czasowym, a tym samym uzyskać dokładne "migawki" określonego szlaku biochemicznego.
8. Pod koniec 30-minutowego okresu indukcji przenieść 25 ml kultury do wstępnie podgrzanej jednorazowej kolby Erlenmeyera o pojemności 125 ml. Umieścić kolbę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.

4. Etykietowanie impulsowe i promieniowanie UV

UWAGA: Etykietowanie impulsowe i protokół naświetlania promieniowaniem UV składa się z wielu kroków, które muszą być wykonane w odpowiednim czasie i które wymagają znacznej organizacji i wcześniejszego przygotowania. Wszystkie odczynniki i probówki powinny być łatwo dostępne. Poniżej przedstawiono protokół eksperymentu, który ma punkty czasowe 0, 1 i 5 minut.

1. O godzinie 0:00 (min:s) przenieść 25 ml kultury do kolby o pojemności 125 ml.
2. O godzinie 0:30 dodać 30 μCi/ml radioaktywnych aminokwasów; szybko zamieszać, aby wymieszać. Umieścić kolbę w łaźni wodnej wytrząsającej o temperaturze 37 °C.
3. O godzinie 1:00 dodać 250 μl 100 mM roztworu metioniny i cysteiny; szybko zamieszać do wymieszania.
   1. Natychmiast odpipetować 4 ml kultury do jednego z dołków schłodzonej płytki wielodołkowej zawierającej lód. Odpipetować drugą porcję o pojemności 4 ml do probówki o pojemności 15 ml oznaczonej "0 min - UV". Umieścić kolbę z powrotem w łaźni wodnej.
4. O godzinie 2:00 odpipetować 4 ml kultury do drugiego dołka schłodzonej płytki wielodołkowej, która zawiera lód. Odpipetować kolejną porcję o pojemności 4 ml do 15 ml probówki oznaczonej "1 min - UV". Umieścić kolbę z powrotem w łaźni wodnej.
5. O godzinie 6:00 odpipetować 4 ml kultury do trzeciego dołka schłodzonej płytki wielodołkowej, która zawiera lód. Odpipetować kolejną porcję o pojemności 4 ml do 15 ml probówki oznaczonej "5 min - UV".
6. Umieść pojemnik na lód z płytką wielodołkową pod podgrzaną lampą UV i naświetlaj każdą próbkę indywidualnie przez 4 min.
   UWAGA: W eksperymentach, w których punkty czasowe są oddalone od siebie o co najmniej 4 minuty, każda próbka powinna być napromieniana zaraz po jej odpipetowaniu do płytki wielodołkowej.
7. Przenieś komórki do schłodzonych probówek o pojemności 15 ml oznaczonych "0 min + UV", 1 min + UV" itp.
8. Odwirować komórki przy 2 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
9. Zawiesić każdą próbkę w 300 μl pożywki M9 lub PBS i dodać 33 μl 100% zimnego kwasu trichlorooctowego (TCA) w celu wytrącenia białek. Odwirować TCA, wytrącić w mikrodymie z maksymalną prędkością przez 10 minut i usunąć supernatant. W tym momencie próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.

5. Wykrywanie produktów immunoprecypitacji i sieciowania

1. Dodać 50 μl buforu do rozpuszczania (15% glicerolu, 200 mM Trisbase, 15 mM EDTA, 4% SDS, 2 mM PMSF) do każdej próbki i podgrzewać z mieszaniem w temperaturze 95 °C przez 5 minut w celu rozpuszczenia wytrąconego białka.
2. Dodać 1 ml buforu do testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA) (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 1,0% Igepal CA-630, 0,5% deoksycholanu, 0,1% SDS) i przeprowadzić standardowe immunoprecypitacje¹⁵ przy użyciu jednej piątej do połowy każdej próbki.
   UWAGA: Igepal CA-630 (glikol oktylofenylopolietylenowy) jest stosowany zamiast NP-40, który nie jest już dostępny na rynku. Te dwa związki są chemicznie nie do odróżnienia.
3. Rozpoznawanie białek immunoprecypitowanych za pomocą SDS-PAGE. Bejcować, odbarwiać i suszyć żele.
4. Wystaw żele na działanie ekranu luminoforowego O/N i wykryj białka radioaktywne (w tym produkty sieciowania) za pomocą luminowizora.

Wyniki

Użyliśmy fotolinkowania specyficznego dla miejsca, aby zidentyfikować białka, które oddziałują z EspP podczas jego podróży do OM. W eksperymentach, które są tutaj pokazane, kodony fenyloalaniny w resztach 1113 i 1214 zostały zastąpione kodonami bursztynowymi. Obie pozycje znajdują się w bdomenie, która integruje się z OM i służy jako kotwa membranowa. Struktura krystaliczna domeny EspPβ¹⁶ pokazuje, że dwie reszty znajdują się po peryplazmatycznej stronie lufy b, ale są oddalone od siebie o ~120°

Dyskusja

W artykule opisano metodę, która łączy fotosieciowanie specyficzne dla miejsca z etykietowaniem impulsowym w celu zbadania dynamiki interakcji między białkiem będącym przedmiotem zainteresowania a innymi składnikami żywej komórki. Metoda jest szczególnie przydatna do badania wieloetapowych procesów, w których białko oddziałuje sekwencyjnie z innymi czynnikami. W przeciwieństwie do tradycyjnych podejść do chemicznego sieciowania, fotosieciowanie specyficzne dla miejsca dostarcza szczegółowych informacji o stanie poszczegó...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
QuikChange II Zestaw do mutagenezy ukierunkowanej na miejsce	Agilent	200521
BPA (H-p-Bz-Phe-OH)	Bachem	F-2800
TRAN35S-LABEL, odczynnik do znakowania metabolicznego (35S-L-metionina i 35S-L-cysteina, >1,000 Ci/mmol)	MP Biomedicals	51006
Spektrolina SB-100P Lampa UV o bardzo wysokiej intensywności, 365 nm	Spectronics Corporation	SB-110P
Wymienna żarówka spektrolinowa 100S	Spectronics Corporation	11-992-15
Płytka do hodowli tkankowych Falcon, 6-dołkowa	Becton Dickinson Labware	353046
Jednorazowa kolba Erlenmeyera 125 ml	Corning	430421
Innova 3100 wytrząsająca kąpiel wodna	Nowość Brunswick Scientific	n.a.