Artykuł metodologiczny

Model niedokrwienia/reperfuzji beztlenowej u C. elegans

9.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51231

⸱

11 marca 2014

 ,  , 
1Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo, 2Department of Medicine, Nephrology Division, University of Rochester Medical Center, School of Medicine and Dentistry

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano protokół, który wykorzystuje anoksję/głód u C. elegans do modelowania niedokrwienia/reperfuzji. Wyniki funkcjonalne obejmują zwiększoną śmiertelność, widoczne nieprawidłowości w procesach neuronalnych znakowanych GFP oraz upośledzone reakcje behawioralne, które wymagają funkcji neuronalnej.

Streszczenie

Protokoły dotyczące anoksji/głodu w organizmie modelu genetycznego C. elegans symulują niedokrwienie/reperfuzję. Robaki są oddzielane od pokarmu bakteryjnego i umieszczane w stanie anoksji na 20 godzin (symulowane niedokrwienie), a następnie przenoszone do normalnej atmosfery z jedzeniem (symulowana reperfuzja). Ten eksperymentalny paradygmat skutkuje zwiększoną śmiertelnością i uszkodzeniem neuronów, a także przedstawiono techniki oceny żywotności organizmu, zmian w morfologii procesów neuronów dotyku, a także wrażliwości na dotyk, która reprezentuje behawioralne wyjście funkcji neuronalnych. Na koniec opisano metodę budowy inkubatorów hipoksyjnych przy użyciu zwykłych kuchennych pojemników do przechowywania. Dodanie jednostki sterującej przepływem masowym pozwala na wprowadzanie zmian w mieszaninie gazów w niestandardowych inkubatorach, a łaźnia z obiegiem wody pozwala zarówno na kontrolę temperatury, jak i ułatwia identyfikację nieszczelności. Ta metoda stanowi tanią alternatywę dla dostępnych na rynku jednostek.

Wprowadzenie

C. elegans to nicień, który od czasu jego wprowadzenia przez Brennera1 został powszechnie przyjęty jako wielokomórkowy eukariotyczny organizm modelowy. Jest to tani, prosty i wszechstronny model, który umożliwia łatwe powiązania między zmianami genetycznymi a zmianami fenotypowymi2.

Niedokrwienie charakteryzuje się brakiem składników odżywczych i dopływu tlenu do tkanki, po którym następuje reperfuzja, gdy wytwarzany jest wyrzut reaktywnych form tlenu3 i dochodzi do większości uszkodzeń. W 2002 r. opracowano model niedokrwienia/reperfuzji (IR) u C. elegans 4 polegający na poddaniu całego robaka działaniu niedotlenienia, niedoboru składników odżywczych i stresu cieplnego przez około 20 godzin, a następnie 24 godziny w normalnych warunkach. Chociaż ten model jest technicznie stanem głodu beztlenowego (AS), śmierć komórki zachodzi poprzez mechanizmy, które są konserwatywne u ssaków, w tym uszkodzenia wywołane przez utleniacze podczas reperfuzji5. Ponadto, podobnie jak w przypadku podczerwieni u ssaków, uszkodzeniom wywołanym przez AS u C. elegans można zapobiec poprzez wstępne kondycjonowanie niedokrwienne6,7 lub wstępne kondycjonowanie anestezjologiczne8,9.

Poniższe protokoły pokazują, jak naśladować IR u C. elegans za pomocą modelu AS, jak oceniać nieprawidłowości morfologiczne i behawioralne wynikające z AS, oraz jak dostosować protokół w sposób, który pozwala na przeprowadzenie eksperymentu przy niższej inwestycji początkowej przy użyciu specjalnie zaprojektowanej, łatwej do skonstruowania alternatywy komory.

Protokół

1. Wzrost C. elegans

  1. Przygotować płytki agarowe z 35 mm pożywką do wzrostu nicieni (NGM) obsiane bakteriami OP50, zgodnie ze standardowymi metodami uprawy1.
  2. Zsynchronizuj C. elegans, umieszczając 6 grawych dorosłych osobników na wysiewanej płytce NGM. Usuń dorosłe osobniki po złożeniu ~100 jaj (~3 godziny).
  3. Inkubować płytki przez 3 dni w temperaturze 20 °C, po czym robaki rozwiną się do stadium młodego dorosłego i są optymalne do tego eksperymentu. Alternatywne protokoły synchronizacji C. elegans opisano w innym miejscu10.

2. Materiały dla AS

  1. Bufor M9 (22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl, 1 mMMgSO4) powinien zostać oczyszczony z tlenu przez zrównoważenie zN2 (można również użyć argonu) przez 30 minut przed eksperymentem i przechowywany w otoczeniu lodu.
  2. Zrób mały otwór (o szerokości 3 mm) w pokrywie probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, w którym umieszczone zostaną robaki podczas AS. Otwór pozwala na wymianę gazu bez konieczności utrzymywania otwartej pokrywy, ponieważ może to prowadzić do nadmiernego parowania mediów.

3. Anoksyzja/Głód

  1. Przeprowadzaj wszystkie eksperymenty co najmniej w trzech egzemplarzach.
  2. Dodać 1 ml natlenionego buforu M9 do każdej płytki o średnicy 35 mm zawierającej młode dorosłe robaki wyhodowane w sposób opisany powyżej. Uważaj, aby nie usunąć bakterii z talerza (dodaj M9 do krawędzi, na których bakterie nie zostały zasiane). Po ~1 min robaki powinny pływać w M9.
  3. Pokryj końcówkę pipety o pojemności 1 ml roztworem BSA, pipetując i usuwając sterylny 1% roztwór BSA.
  4. Ostrożnie przechylić płytkę zawierającą robaki w buforze M9, wyjąć M9 z tego samego miejsca, w którym została dodana, i umieścić zawiesinę w przygotowanych probówkach do mikrowirówek. Odstaw na lód, aż robaki opadną na dno rurek (~1-2 min).
  5. Usunąć maksymalną możliwą ilość M9 bez naruszania robaków z probówki (pozostawiając około 100 μl), dodać 1 ml oczyszczonego tlenem i zamrożonego M9 i umieścić probówkę na lodzie, aż robaki ponownie osiądą na dnie. Powtórz ostatni krok 3 razy. W ostatnim praniu wyjmij M9, aż w tubie pozostanie ~100 μl.
  6. Umieść probówki z robakami w odtlenionym M9 w komorze beztlenowo-niedotlenionej (patrz instrukcje poniżej, sekcja 3.6.1) lub, alternatywnie, w specjalnie zaprojektowanym pojemniku (patrz instrukcje poniżej, sekcja 3.6.2).
    1. Jeśli ma być używana komora antyoksykacyjna/hipoksyjna, pozostaw trochę oczyszczonego M9 w komorze przed rozpoczęciem kroku 3.5 i powtórz krok 3.5, gdy robaki znajdą się w komorze.
    2. Jeżeli ma być użyta komora celna, szczegółowy opis sposobu stworzenia taniego aparatu znajduje się na końcu niniejszego protokołu i został opisany przez inną grupę wcześniej11. Krótko:
      1. Wykonaj dwa otwory w pokrywie pojemnika typu Tupperware o pojemności 250 ml i dodaj do nich łączniki rurek. Jeden będzie służył do wstrzykiwania mieszaniny gazów, podczas gdy drugi będzie wyjściem gazu do łaźni wodnej.
      2. Umieść robaki w komorze i uszczelnij komorę za pomocą pokrywy.
      3. Gaz o stałym strumieniuN2 (100 ml/min).
      4. Umieścić pojemnik w łaźni wodnej o temperaturze 26 °C. Upewnić się, że rurka wylotowa jest dobrze zanurzona w wodzie, aby powietrze nie wracało i aby nie było nieszczelności w systemie (widoczne przez pęcherzyki unoszące się z samej komory).
  7. Inkubować robaki w temperaturze 26 °C przez 20 godzin.

4. Symulowana reperfuzja

  1. Po 20 godzinach w warunkach AS wyjąć rurki z komory inkubacyjnej do powietrza w pomieszczeniu.
  2. Odpipetować C. elegans końcówką pokrytą BSA (jak w kroku 3.3) na płytkę NGM o średnicy 35 mm z ziarnem OP50. Inkubować płytki w temperaturze 20 °C przez 24 godziny. Po tym robaki będą gotowe do zdobycia.

5. Rozpoznawanie martwych i żywych robaków

  1. Za pomocą platynowego kilofa delikatnie dotknij czubka głowy robaka. Żywe robaki będą się cofać po dotknięciu. Jeśli robaki nie reagują, oznacz je jako martwe. Czasami robak nie porusza się do tyłu, ale może wykazywać lekkie ruchy głowy na boki. Chociaż nie są one technicznie martwe, prawie na pewno wygasną w ciągu kilku godzin i powinny zostać ocenione jako martwe. Jeśli ktoś czeka zbyt długo z nacięciem robaków, może dojść do wewnętrznego wylęgu potomstwa i te "worki robaków" mogą pęknąć, co bardzo utrudni wykrycie tusz.
  2. Usuń zarówno żywe, jak i martwe robaki z płytki podczas ich liczenia, aby uniknąć podwójnego liczenia. Żywe robaki można przenieść na osobną płytkę w celu przeprowadzenia testów behawioralnych. Ilość żywych robaków w stosunku do ogółu jest reprezentowana jako % robaków, które przeżyły (rysunek 1A).

6. Test reakcji na dotyk

  1. Szczegółowy opis tego protokołu został przedstawiony w: Hart, Anne C., ed. Behavior (July 3, 2006), WormBook, ed. The C. elegans Research Community, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org.
    1. Aby ocenić reakcję na dotyk, zidentyfikuj poruszające się robaki i delikatnie dotknij boku głowy robaka (w pobliżu środkowej części gardła) szpikulcem do rzęs (ryc. 3).
    2. Jeśli robak porusza się do tyłu, oceniony jako responsywny, jeśli nie, oceniony jako niereagujący (Rysunek 1B). Powtórz ten krok 10-15 razy dla każdego robaka w odstępach 10 sekund. Zbadaj co najmniej 10 robaków w każdej grupie, aby uzyskać dokładne dane. Ten sam test można zastosować do oceny zmian lokomotorycznych do przodu po lekkim dotknięciu tylnej ściany ciała. Pamiętaj, aby nie dotykać głowy ani ogona robaka, ponieważ stymuluje to wyraźne zachowanie.
    3. Na koniec włącz szczepy kontroli genetycznej [N2 Bristol typu dzikiego dla pozytywnego, mutant mec (mechanosensoryczny) dla ujemnego - np. CB1338 mec-3 (e1338)IV], aby skalibrować siłę, z jaką dotykać robaków. Zbyt ostra stymulacja wywoła reakcję behawioralną u mutantów mec, zbyt mała nie wywoła efektu u dzikich grup kontrolnych N2
      4. .

7. Modyfikacje neuronalne

  1. Aby uwidocznić modyfikacje neuronów po AS, użyj szczepu, który wyraża GFP w neuronach mec reagujących na dotyk4,5. Neurony te mają długie wyrostki, które przebiegają wzdłuż ściany ciała i są łatwe do oceny pod kątem nieprawidłowości morfologicznych. Ponadto informacje morfologiczne można zintegrować z behawioralnymi pomiarami funkcji neuronów, jak opisano powyżej. Jednym ze szczepów, który można wykorzystać do tego celu, jest TU2583, który jest dostępny w Centrum Genetyki C. elegans i zawiera zintegrowany transgen uIs25 eksprymujący GFP z promotora mec-18 lub alternatywnie TU2562, który zawiera zintegrowaną fuzję mec-3::GFP.
  2. Przygotuj podkładkę z agarozą.
    1. Rozpuść 2% agarozy w wodzie, doprowadź do 1x M9 z 10x bulionem i utrzymuj roztwór w temperaturze 70 °C.
    2. Umieść kroplę (~20 μl) tego roztworu na szkiełku podstawowym (25 mm x 75 mm), które zostało umieszczone między dwoma innymi szkiełkami, z których każde ma pojedynczy kawałek taśmy na spodniej stronie.
    3. Umieść ostatnie szkiełko szkiełkowe prostopadłe do pierwszego na wierzchu 2% roztworu agarozy i pozwól mu ostygnąć w temperaturze pokojowej. Powinno to utworzyć podkładkę o grubości taśmy.
    4. Zdejmij górny szkiełko i dodaj 10 μl M9 zawierającego 0,1% tetramizolu, który unieruchomi robaki.
  3. Przenieś kilka (~10) żywych robaków na 2% zjeżdżalnię agarozową. Umieść na nich szkiełko nakrywkowe i zwizualizuj GFP za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego pod obiektywem 100X przy odpowiednim oświetleniu.
  4. Uszkodzone neurony będą wykazywać cytozolowy ciąg błony perłowej wzór w procesach, składający się z wielu punctum (ryc. 2A) i / lub nieprawidłowości, w których procesy wydają się być przerwane (ryc. 2B). Policz punctum i nieprawidłowości w obu neuronach dla każdego robaka, używając w sumie co najmniej 10 robaków.

8. Laboratoryjna komora hipoksyjna

  1. Szczelny, hermetyczny pojemnik w stylu Tupperware można doposażyć w komorę beztlenową. Zadbaj o to, aby wybrać pojemnik, który jest tak mały, jak to tylko możliwe. Mały pojemnik szybciej tworzy środowisko niedotlenienia i łatwiej go zmieścić w kąpieli wodnej (ryc. 4).
  2. Wykonaj dwa otwory w pokrywie (można to zrobić śrubokrętem lub podgrzewając kleszcze i wciskając w pokrywkę) i włóż plastikowy lub metalowy łącznik pasujący do rurki (Rysunek 5A). Użyj kleju, który można umieścić pod wodą, a także twardnieje po wyschnięciu, unikając przesuwania złącza, a tym samym zmniejszając możliwość wycieku (rysunek 5B).
  3. Pojemnik należy umieścić w łaźni wodnej tak, aby był całkowicie zanurzony (rysunek 4). Aby zanurzyć pojemnik, użyj obciążnika do butelki lub ciężarka do nurkowania.
  4. Jedno z połączeń rurki posłuży do wprowadzenia mieszaniny gazów, a druga rurka będzie działać jako redukcja ciśnienia, dlatego należy ją pozostawić pod wodą, aby pojemnik był szczelnie odcięty od środowiska zewnętrznego (rysunek 4).
  5. Skład powietrza można modulować za pomocą specjalnie wykonanych gazów, regulatorów przepływu masowego lub dowolnej aparatury, która miesza pożądane gazy. Przepływ gazu powinien być kontrolowany, ponieważ wysoki przepływ może powodować nadmierne parowanie. Na przykład w pojemniku o pojemności 250 ml 100 ml/min gazu zapewni dobrą przestrzeń dla robaków i odpowiedni topnik.
  6. Długość przewodów powinna być ograniczona do minimum, ponieważ mogą one przepuszczać gaz, umożliwiając wejścieO2. Ważne jest, aby unikać stosowania rurek silikonowych, Tygon, ponieważ materiały te są przepuszczalne dla wymiany gazowej. Preferujemy rurki polipropylenowe lub nylonowe. Rurki szklane lub metalowe dobrze utrzymują gazy, ale są również trudniejsze w obróbce.

Wyniki

Poddanie C. elegans 20 h AS w temperaturze 26 °C w specjalnie wykonanej komorze inkubacyjnej, zgodnie z opisem (Sekcja 3.6.2), doprowadziło do znacznej śmiertelności (Rycina 1A)5. Następnie wykonane obrazowanie fluorescencyjne punktacji i pęknięć w znakowanych GFP wypustkach neuronalnych osobników, które przeżyły, potwierdziło obecność nieprawidłowości morfologicznych (Rycina 2). Osobniki te wykazywały również słabą reakcję na delikatny dotyk ściany ciała (Rycina 1B). Model ten był wykorzystywany przez wiele grup badawczych do analizy wpływu predyspozycji genetycznych, interwencji farmakologicznych oraz plastyczności metabolicznej na efekty zależne od AS4-6,8,9,12,13.

Wykresy słupkowe przedstawiające przeżywalność i reakcję na dotyk w grupach kontrolnej i AS; analiza odpowiedzi biologicznej.
Rycina 1. Przeżywalność i reakcja na dotyk C. elegans po AS. A) Procent nicieni wykazujących przeżywalność 24 h po AS. Szczep N2 stanowi genetyczne tło typu dzikiego, a KWN85 zawiera zintegrowany transgen znakujący neurony mec białkiem GFP. B) Reakcja żywych C. elegans (szczep N2) na bodźce dotykowe po AS. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat nieprawidłowości neuronów z obrazami mikroskopowymi, wykresy słupkowe A i B przedstawiające wyniki analizy.
Rysunek 2. Modyfikacje neuronów dotykowych po AS. Nieprawidłowości neuronów dotykowych (PLML i PLMR), takie jak pokręcone wypustki i przerwy (A) lub gromadzenie się agregatów GFP w wypustkach (B), były monitorowane u przeżyłych znieczulonych C. elegans po AS.

Drobnoporowaty emiter, źródło jonizacji, układ eksperymentu MS, analiza białek, zbliżenie.
Rycina 3. Pęseta z rzęsy. Zmontowana pęseta z rzęsy. Na wstawce szczegół rzęsy przyklejonej do drewnianego wykałaczkowego trzonka.

Układ do zbierania gazu w zbiorniku z wodą, schemat pokazujący dopływ/odpływ gazu, stabilizację ciężaru butelki.
Rycina 4. Samoróbka komory hipoksycznej w kąpieli wodnej. Zamknięty pojemnik przygotowany do rozpoczęcia eksperymentu. Strzałki wskazują wlot i wylot gazu oraz obciążenie w postaci butelki, które zapobiega wypływaniu pojemnika na powierzchnię.

Złączniki rurek szczelnego pojemnika; układ eksperymentalny do badania transferu płynów; schemat.
Rysunek 5. Szczegóły wewnętrznej i zewnętrznej strony pokrywy pojemnika. A) Zewnętrzna strona pokrywy pojemnika, przedstawiająca rurkę i jej złącznik przymocowany do wcześniej wykonanego otworu. B) Zewnętrzna strona pokrywy pojemnika, przedstawiająca złącznik rurki przymocowany do wcześniej wykonanego otworu.

Dyskusja

AS jest szeroko stosowany u C. elegans do modelowania obrażeń IR. W tym protokole należy podkreślić kilka kluczowych punktów: C. elegans są odporne na szeroki wachlarz urazów, co uzasadnia potrzebę 3 jednoczesnych zniewag (upał, głód i niedotlenienie), aby osiągnąć śmierć przy użyciu tego systemu. Sama anoksja nie zabija robaków w tym oknie czasowym14. Ponadto wzrost temperatury jest dodatkowym stresem, dlatego ważne jest, aby uważnie monitorować. Ściśle mówiąc, głód sam w sobie nie przyczynia się znacząco do obserwowanego stopnia śmiertelności7, ale wydaje się, że zmniejsza zmienność wśród eksperymentalnych powtórzeń. Biorąc pod uwagę, że z dnia na dzień może występować znaczna zmienność, niezwykle ważne jest porównywanie próbek prowadzonych bezpośrednio równolegle i powtarzanie eksperymentów przez wiele dni. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki są mierzone dla trzech oddzielnych płytek po 50-100 robaków/warunki eksperymentalne, a następnie są one uśredniane i traktowane jako pojedyncza replika eksperymentalna. Ogólnie rzecz biorąc, od siedmiu do dziewięciu powtórzeń wydaje się być wystarczających do osiągnięcia lub wykluczenia istotności statystycznej.

Stadium rozwojowe robaków wykorzystanych w eksperymencie również musi być dokładnie monitorowane, ponieważ podatność różnych stadiów na uszkodzenie ZA różni się znacznie15,16. Stosowanie młodych dorosłych jest standardem, a robaki w stadium larwalnym (L3 i L4) wydają się być bardziej odporne na szkodliwe działanie ZZSK (dane niepublikowane).

Protokół ten przedstawia dwa sposoby przeprowadzania eksperymentów, jeden przy użyciu aparatury laboratoryjnej (przy użyciu pojemników typu Tupperware i wejścia gazowego11), a drugi przy użyciu komercyjnej komory hipoksyjnej4,6. Anoksję można osiągnąć za pomocą innych środków, które zużywają tlen, jak opisano w innym miejscu13,17. Zastosowanie alternatywnych technik w celu stworzenia środowiska hipoksyjnego może zmienić czas inkubacji AS niezbędny do wytworzenia pożądanej ilości śmierci. Celowanie w przeżycie ~20% jest idealnym punktem wyjścia do badania interwencji ochronnych, podczas gdy 80% jest podobnie idealne dla interwencji, które nasilają szkodliwe skutki ZZSK. Kolejnym ważnym zastrzeżeniem jest czas, w którym obserwator ocenia martwe/żywe robaki. Jeśli czas analizy zostanie wydłużony poza 24 godziny, dane mogą być mylące, ponieważ martwe robaki stają się coraz trudniejsze do zidentyfikowania. Może to wynikać z faktu, że tusze robaków stają się z czasem stosunkowo przezroczyste, ale także z faktu, że zapłodnione zarodki mogą rozwinąć się w potomstwo pośmiertne wewnątrz tusz i zakłócać je w miarę pojawiania się.

Analiza morfologii neuronów może być zmodyfikowana tak, aby przyjrzeć się wzorcom ekspresji białek18,fragmentacji jądra 4 i innym parametrom19 poprzez podstawienie szczepu robaka, który wyraża odpowiedni marker kodowany genetycznie. Ostatnim zastrzeżeniem jest to, że wizualizacja procesów neuronalnych powinna być wykonana w czasie krótszym niż 30 minut po umieszczeniu robaków na szkiełku. Zwierzęta trzymane pod narkozą na szkiełkach przez dłuższy czas mogą wykazywać uszkodzenia niezależne od AS. Dostosuj liczbę zwierząt na slajdzie do czasu potrzebnego na ich śledzenie i analizowanie.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Rysunki 1 i 2 zostały wcześniej opublikowane w Free Radical Biology & Medicine (Queliconi et al.5) i posiadają prawa autorskie należące do Elsevier. Prace te były wspierane przez Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Processos Redox em Biomedicina, Núcleo de Apoio à Pesquisa de Processos Redox em Biomedicina, USPHS NS064945 (K.N.) i USPHS GM087483 (K.N.). B.B.Q. jest doktorantem w ramach stypendium FAPESP.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
N2  szczepCGCSzczep typu dzikiego.

http://www.cbs.umn.edu/CGC/

TU2583 uIs25 (Pmec-18::GFP)CGCTU2583zintegrowany transgen fluorescencyjny używany do znakowania neuronów dotykowych.

http://www.cbs.umn.edu/CGC/

CB1338 mec-3 (e1338)IVCGCCB1338kanoniczny mutant mec-3, który jest niewrażliwy na dotyk.

http://www.cbs.umn.edu/CGC/

Rurka do mikrowirówkiEppendorf0030 120.086
Mikroskop Nikon Eclipse TE2000-U Nikon USATE2000-U
Sheldon Manufacturing Inc.Model 2005
Szpikulecrzęs Wykałaczkę do rzęs można przygotować, przymocowując  rzęsę do drewnianej wykałaczki, a następnie umieszczając wykałaczkę w szklanej pipecie Pasteura (Rysunek 3).
Hypoxic ChamberCoy8307030Schowek na rękawice hipoksyjne wyposażony w katalizator paladowy i kontroler CO2.
Inkubator niskotemperaturowy do

Bibliografia

  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  2. Maine, E. M. Studying gene function in Caenorhabditis elegans using RNA-mediated interference. Briefings Funct. Genom. Proteom. 7 (3), 184-194 (2008).
  3. Vanden Hoek,, L, T., Shao, Z., Li, C., Zak, R., Schumacker, P. T., Becker, L. B. Reperfusion injury on cardiac myocytes after simulated ischemia. Am. J. Physiol. 270 (4), 1334-1341 (1996).
  4. Ba Scott,, Avidan, M. S., Crowder, C. M. Regulation of hypoxic death in C. elegans by the insulin/IGF receptor homolog DAF-2. Science. 296 (5577), 2388-2391 (2002).
  5. Queliconi, B. B., Marazzi, T. B. M., et al. Bicarbonate modulates oxidative and functional damage in ischemia-reperfusion. Free Rad. Biol. Med. 55, 46-53 (2013).
  6. Wojtovich, A. P., DiStefano, P., Sherman, T., Brookes, P. S., Nehrke, K. Mitochondrial ATP-sensitive potassium channel activity and hypoxic preconditioning are independent of an inwardly rectifying potassium channel subunit in Caenorhabditis elegans. FEBS Lett. 586 (4), 428-434 (2012).
  7. Dasgupta, N., Patel, A. M., Scott, B. A., Crowder, C. M. Hypoxic Preconditioning Requires the Apoptosis Protein CED-4 in C. elegans. Curr. Biol. 17 (22), 1954-1959 (2007).
  8. Jia, B., Crowder, C. M. Volatile anesthetic preconditioning present in the invertebrate Caenorhabditis elegans. Anesthesiology. 108 (3), 426-433 (2008).
  9. Wojtovich, A. P., Sherman, T. A., Nadtochiy, S. M., Urciuoli, W. R., Brookes, P. S., Nehrke, K. SLO-2 is cytoprotective and contributes to mitochondrial potassium transport. PloS One. 6 (12), e28287(2011).
  10. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J. Vis. Exp. (64), e4019(2012).
  11. Fawcett, E. M., Horsman, J. W., Miller, D. L. Creating defined gaseous environments to study the effects of hypoxia on C. elegans. J. Vis. Exp. (65), e4088(2012).
  12. Butler, J. A., Mishur, R. J., Bokov, A. F., Hakala, K. W., Weintraub, S. T., Rea, S. L. Profiling the anaerobic response of C. elegans using GC-MS. PLoS One. 7 (9), 10-1371 (2012).
  13. Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C., Roth, M. B. Dephosphorylation of cell cycle-regulated proteins correlates with anoxia-induced suspended animation in Caenorhabditis elegans. Mol. Biol. Cell. 13 (5), 1473-1483 (2002).
  14. Jiang, H., Guo, R., Powell-Coffman, J. The Caenorhabditis elegans hif-1 gene encodes a bHLH-PAS protein that is required for adaptation to hypoxia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (14), 7916-7921 (2001).
  15. Twumasi-Boateng, K., Wang, T. W., et al. An age-dependent reversal in the protective capacities of JNK signaling shortens Caenorhabditis elegans lifespan. Aging Cell. 11 (4), 659-667 (2012).
  16. Wang, Y., Chen, J., Wei, G., He, H., Zhu, X., Xiao, T., Yuan, J., Dong, B., He, S. S. kogerbøG., Chen, R. The Caenorhabditis elegans intermediate-size transcriptome shows high degree of stage-specific expression. Nucleic Acids Res. 39 (12), 5203-5214 (2011).
  17. Perry, C. N., Huang, C., Liu, W., Magee, N., Carreira, R. S., Gottlieb, R. Xenotransplantation of mitochondrial electron transfer enzyme, Ndi1, in myocardial reperfusion injury. PloS One. 6 (2), e16288(2011).
  18. Chai, Y., Li, W., Feng, G., Yang, Y., Wang, X., Ou, G. Live Imaging of Cellular Dynamics During Caenorhabditis elegans Postembryonic Development. Nature Protoc. 7 (12), 2090-2102 (2012).
  19. Nehrke, K. A reduction in intestinal cell pHi due to loss of the Caenorhabditis elegans Na+/H+ exchanger NHX-2 increases life span. J. Biol. Chem. 278 (45), 44657-44666 (1074).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Symulacja niedokrwienia i reperfuzjinicienie C elegansniestandardowa komora hipoksycznasystem przep ywu azotuocena odpowiedzi na dotykanaliza z u yciem mikroskopii fluorescencyjnejocena morfologii neuron wbadanie ywotno ci organizm wprzygotowanie buforu M9
Model niedokrwienia/reperfuzji beztlenowej u C. elegans
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.