Ruch błony neuronalnej dynamicznie kontroluje dostępność białek błony plazmatycznej i znacząco wpływa na neuroprzekaźnictwo. Do tej pory trudno było zmierzyć neuronalny transport endocytarny w dorosłych neuronach. W tym miejscu opisujemy wysoce skuteczną, ilościową metodę pomiaru szybkich zmian ekspresji białek powierzchniowych ex vivo w ostrych wycinkach mózgu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Biotynylacja wycinków mózgu: podejście ex vivo do pomiaru specyficznego dla regionu transportu białek błony plazmatycznej w dorosłych neuronach
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Regulowany transport endocytarny jest centralnym mechanizmem ułatwiającym różnorodne zdarzenia neuromodulacyjne, poprzez dynamiczne kontrolowanie prezentacji receptora, kanału jonowego i powierzchni komórki transportera w skali minutowej. Istnieje szeroka gama mechanizmów, które kontrolują endocytarny transport poszczególnych białek. Badania badające molekularne podstawy transportu opierały się przede wszystkim na biotynylacji powierzchniowej w celu ilościowego pomiaru zmian w ekspresji powierzchni białek błonowych w odpowiedzi na bodźce egzogenne i manipulację genami. Jednak podejście to ograniczało się głównie do hodowanych komórek, które mogą nie odzwierciedlać fizjologicznie istotnych mechanizmów zachodzących w dorosłych neuronach. Co więcej, Podejścia oparte na hodowli komórek mogą zaniżać specyficzne dla regionu różnice w mechanizmach transportu. Tutaj opisujemy podejście, które rozszerza biotynylację powierzchni komórek na przygotowanie ostrego wycinka mózgu. Pokazujemy, że ta metoda zapewnia podejście o wysokiej wierności do pomiaru szybkich zmian poziomów powierzchni białek błonowych w dorosłych neuronach. Podejście to może mieć szerokie zastosowanie w dziedzinie neuronalnego transportu endocytarnego.
Wprowadzenie
Handel endocytarny to wszechobecny mechanizm komórkowy, który precyzyjnie dostosowuje prezentację błony komórkowej różnych integralnych białek błonowych. Endocytoza dostarcza niezbędne składniki odżywcze do środowiska wewnątrzkomórkowego1i zwrażliwia sygnalizację receptora w odpowiedzi na aktywację receptora2. Recykling endocytarny z powrotem do błony plazmatycznej może dodatkowo wzmocnić sygnalizację komórkową poprzez zwiększenie poziomu ekspresji białka na powierzchni komórki3. Co więcej, zaburzenia transportu błonowego są związane z licznymi chorobami i stanami patologicznymi4,5, co podkreśla potrzebę zbadania mechanizmów molekularnych, które rządzą transportem endocytarnym białek. Podczas gdy wiele białek wykorzystuje klasyczne mechanizmy internalizacji zależne od klatryny, coraz więcej dowodów w ciągu ostatnich kilku lat pokazuje, że wiele niezależnych od klatryny mechanizmów endocytarnych rządzi potencjałem endocytarnym rosnącej macierzy białek6,7. W związku z tym znacznie wzrosła potrzeba zbadania mechanizmów endocytarnych ułatwiających transport w odpowiednich układach fizjologicznych.
W mózgu, endocytarny transport receptorów, kanałów jonowych i transporterów neuroprzekaźników odgrywa główną rolę w ustalaniu plastyczności synaptycznej8-11 i odpowiedzi na narkotyki12-15, ostatecznie wpływając na pobudliwość neuronów i reakcje synaptyczne. Do tej pory większość badań nad transportem neuronalnym opiera się albo na heterologicznych systemach ekspresji, albo na hodowanych neuronach pierwotnych, z których żaden nie może wiarygodnie odzwierciedlać mechanizmów odgrywających rolę w dorosłe neurony. Tutaj przedstawiamy podejście, które wykorzystuje biotynylację powierzchniową do ilościowego pomiaru poziomów białka powierzchniowego w ostrych wycinkach mózgu pochodzących od dorosłych gryzoni. Stosując to podejście, przedstawiamy dane, które pokazują, że transporter dopaminy prążkowia myszy szybko internalizuje się w odpowiedzi na aktywację kinazy białkowej C (PKC) za pośrednictwem estru forbolu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie czynności związane ze zwierzętami i pobieranie tkanek odbywały się zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Massachusetts Medical School (IACUC), zgodnie z zatwierdzonym protokołem #A1506 (Melikian, P.I.).
Wymagane rozwiązania
Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF) - Codziennie świeże
125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,2 mM NaH2PO4, 1,2 mM MgCl2, 2,4 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 i 11 mM glukozy
Uwaga: Przygotuj ACSF jako 10x roztwór podstawowy, bez NaHCO3 i glukozy. Przygotuj 1x roztwory robocze dziennie z 10x zapasu, uzupełniając świeżym NaHCO3 i glukozą.
ACSF z dodatkiem sacharozy (SACSF) – Codziennie twórz świeże
250 mM sacharozy, 2,5 mM KCl, 1,2 mM NaH2PO4, 1,2 mM MgCl2, 2,4 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 i 11 mM glukozy
Uwaga: Przygotuj SACSF jako 10x roztwór podstawowy, z wyłączeniem NaHCO3 i glukozy. Przygotuj 1x roztwory robocze dziennie z 10x zapasu, uzupełniając świeżym NaHCO3 i glukozą.
Sulfo-N-hydroksysukcynylo-SS-Biotyna (sulfo-NHS-SS-biotyna, Pierce Chemical Company)
Roztwory podstawowe powinny mieć 200 mg/ml w DMSO i są odporne na wielokrotne cykle zamrażania/rozmrażania. Podwielokrotności są przechowywane w temperaturze -20 °C. Ester sukcynylu ulega szybkiej hydrolizie w roztworze wodnym, dlatego roztwory robocze należy przygotować bezpośrednio przed nałożeniem na plastry.
Roztwór do gaszenia plastrów
ACSF uzupełniony 100 mM glicyną
Bufor do lizy RIPA
10 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1,0 mM EDTA, 1% Triton-X-100, 0,1% SDS, 1% Deoksycholan Na
RIPA z inhibitorami proteazy (RIPA/PI) – Codziennie twórz świeże
RIPA uzupełniony o 1 μM leupeptynę, 1 μM pepstatynę, 1 μM aprotyninę i 1 mM fluorek fenylometylosulfonylu.
1. Przygotuj plasterki mózgu
- Zrób świeże 1x SACSF i 1x ACSF
- Schłodzić SACSF na lodzie w małej zlewce. Będzie on służył do przechowywania świeżo zebranego mózgu myszy.
- Nasycić ACSF i SACSF tlenem, bulgocząc 95%/5%O2/CO2 przez 20 minut na lodzie.
- Myszy P30-38 powinny być używane w celu uzyskania optymalnej żywotności tkanek. Składaj zwierzęta w ofierze poprzez zwichnięcie szyjki macicy i dekapitację, a następnie szybko usuwaj mózgi do wstępnie schłodzonego, natlenionego SACSF.
- Za pomocą wibrującego mikrotomu wykonaj 300 μm skrawków mózgu w obszarze zainteresowania.
- W razie potrzeby wycinki można dalej preparować przed wyzdrowieniem, aby wzbogacić je o określone regiony mózgu lub oddzielić prawą i lewą półkulę, aby użyć ich odpowiednio jako plasterków kontrolnych i eksperymentalnych.
- Za pomocą wypolerowanej na gorąco pipety Pasteura przenieś plastry do komór z siatkowym dnem umieszczonych na płytkach 24-dołkowych.
- Pozostaw plastry do odzyskania przez 40 minut, w temperaturze 31 °C w natlenionym ACSF, z ciągłym, delikatnym bulgotaniem.
2. Leczenie farmakologiczne (jeśli jest to właściwe) i biotynylacja Slice
- Po odzyskaniu umyj plastry 3x we wstępnie podgrzanym (37 °C), natlenionym ACSF, stale bulgoczącym z 95%/5% O2 / CO2 .
- Dodać badane związki i inkubować z ciągłym natlenianiem.
- Dla wygody dodaj 1/10 objętości 10x skoncentrowanego leku i wymieszaj, delikatnie odwracając.
- Delikatnie wstrząśnij talerzami w łaźni wodnej o żądanej temperaturze.
- Po leczeniu farmakologicznym szybko schładzaj plastry, myjąc 3x w lodowatym ACSF.
3. Białka powierzchniowe biotynylanu
- Przygotować 1,0 mg/ml sulfo-NHS-SS-biotyny w lodowatym ACSF bezpośrednio przed etykietowaniem.
- Dodać 0,75 ml sulfo-NHS-SS-biotyny do plastrów i inkubować plastry na lodzie, 45 min.
- Szybko umyj plastry trzy razy lodowatym ACSF, a następnie inkubuj przez 10 minut w lodowatym ACSF na lodzie.
- Umyj plastry trzykrotnie lodowatym buforem do hartowania plastrów i inkubuj z 0,75 ml buforu do hartowania plastrów dwa razy, 25 minut, na lodzie, aby schłodzić wolne od sulfo-NHS-SS-biotyny.
4. Przygotowanie lizatów tkankowych
- Umyj plastry trzy razy w lodowatym ACSF i przenieś każdą kromkę do probówki mikrowirówkowej za pomocą wypolerowanej ogniowo pipety Pasteura.
- Delikatnie granulować plasterek, odwirowując 200 x g, 1 min i ostrożnie odessać pozostały ACSF.
- Dodać 400 μl lodowatego RIPA/PI i rozdrobnić tkankę, pipetując raz w górę i w dół przez pipetę P200.
- Przenieść zdysocjowany plasterek/RIPA do świeżej probówki i inkubować przez 30 minut, w temperaturze 4 °C, obracając, aż do zakończenia lizy.
- Resztki komórkowe granulek przez odwirowanie, 18 000 x g, 15 min, 4 °C.
- Oznaczyć stężenia białka lizalnego za pomocą testu białka BCA, z albuminą surowicy bydlęcej (BSA) jako standardem.
5. Izoluj biotynylowane białka
- Zoptymalizuj stosunek kulek do całkowitego białka.
nuta: Poziomy ekspresji poszczególnych białek mogą się znacznie różnić w różnych regionach mózgu. Dopóki nie zostanie wychwycone całe biotynylowane białko w danej ilości lizatu tkankowego, nie jest możliwe dokładne wykrycie jakichkolwiek potencjalnych zmian w ekspresji powierzchniowej. Dlatego konieczne jest empiryczne określenie optymalnego stosunku kulek do całkowitego białka dla określonego białka / regionu mózgu przed rozpoczęciem nowego badania biotynylacji warstw.- Inkubować 25 μl paciorkowców agarozy streptawidyny z rosnącą ilością lizatu tkankowego (przybliżony zakres 25-200 μg), a następnie postępować zgodnie z opisem poniżej dla etapów wiązania, przemywania i elucji.
- Określ ilościowo powstałe prążki immunoreaktywne i wybierz stosunek kulek do lizatu w liniowym zakresie wiązania, który pozwoli na dokładne określenie ilościowe zwiększonej lub zmniejszonej ekspresji powierzchni białka.
- Przygotuj koraliki paciorkowca i agarozy
- Określić całkowitą objętość ściegu potrzebną dla wszystkich próbek. Przygotować wystarczającą objętość kulki na tę ilość plus jeden dodatkowy (tj. 4 próbki po 25 μl/próbkę = 100 μl kulek + jedna dodatkowa = 125 μl kulek.
- Wiruj bulion Streptawidyny i odpipetuj żądaną objętość. Jeśli używasz pipety P200, odetnij koniec końcówki, aby zapobiec zablokowaniu lub uszkodzeniu ściegu.
- Umyj kulki 3 razy w 0,5-1,0 ml RIPA/PI w celu usunięcia konserwantów, wirując po każdym dodaniu RIPA i zbierając kulki między praniami przez odwirowanie 18 000 x g, 1 min, w temperaturze pokojowej.
- Odessać bufor między płukaniami za pomocą szklanej pipety Pasteura podłączonej do kolby próżniowej. Plastikowa końcówka P200 przymocowana do końca szklanej pipety Pasteura zapewnia dokładniejszą kontrolę podczas zasysania. Nie jest konieczne usuwanie absolutnie całego bufora podczas pierwszych dwóch płukań, ponieważ grozi to zasysaniem kulek do pipety. Po ostatnim umyciu usuń jak najwięcej nadmiaru bufora bez zasysania kulek.
- Dodaj RIPA/PI, aby przywrócić pierwotną objętość kulek, pipetując w górę i w dół w celu ponownego zawieszenia. Unikaj wirowania w tym momencie, ponieważ koraliki przykleją się do ścianki rury.
- Porcje porcji przelać do probówek do mikrowirówek za pomocą P200 z odciętą końcówką. Kilkakrotnie pipetować w górę i w dół między próbkami, aby upewnić się, że kulki pozostają równomiernie zawieszone i rozproszone w probówkach.
- Wiążą biotynylowane białka z kulkami streptawidyny
- Rozprowadzić lizaty komórkowe do probówek zawierających kulki agarozy. W przypadku eksperymentów, w których porównywanych jest wiele próbek, upewnij się, że używasz tej samej ilości białka dla każdej próbki, aby uzyskać dokładne porównania.
- Dodać dodatkowe RIPA/PI, aby doprowadzić do próbek minimalną objętość 200 μl. Gwarantuje to, że próbki będą się odpowiednio mieszać podczas inkubacji, a także ujednolica stężenia białka w próbkach.
- Umieścić probówki w rotatorze probówek i mieszać przez noc w temperaturze 4 °C.
- W oddzielnych probówkach należy dozować ekwiwalent całkowitej objętości lizatu użytej dla każdej próbki. Alternatywnie, jeśli objętość próbki jest duża, zamiast tego można zarezerwować część całkowitej objętości lizatu, aby dostosować się do maksymalnych objętości ładunku żeli SDS-PAGE. Zostaną one wykorzystane do normalizacji ekspresji powierzchniowej do całkowitej ilości białka.
- Dodać równą objętość 2x lub 1/5 objętości 6-krotnego buforu próbki SDS-PAGE i albo inkubować w temperaturze 4 °C, równolegle z próbkami perełek, albo przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu analizy próbek.
6. Elucja i analiza próbek
- Granulki przez odwirowanie 18 000 x g, 2 min, w temperaturze pokojowej.
- Odessać supernatant i przemyć kulki trzykrotnie 0,75 ml RIPA. Aby zminimalizować utratę ściegu, pozostaw niewielką objętość bufora nad kulkami między praniami. Po ostatnim umyciu usuń jak najwięcej RIPA, nie naruszając granulki kulki.
- Elute biotynylowane białka z kulek streptawidyny poprzez redukcję wiązania dwusiarczkowego. Dodać 25 μl 2x bufor redukujący SDS-PAGE, odwirować i obrócić próbki 30 min, temperatura pokojowa.
nuta: Wiele białek błonowych ma wysoką tendencję do agregacji po ugotowaniu w buforze próbki SDS-PAGE, co poważnie pogarsza ich ruchliwość elektroforetyczną. Jeśli tak jest w przypadku badanego białka, należy unikać podgrzewania próbek, a zamiast tego powoli eluować w temperaturze pokojowej. Jeżeli gotowanie jest absolutnie konieczne (np. jeżeli inne białko oceniane równolegle wymaga wrzenia), bufor próbki można uzupełnić 2 M mocznikiem (stężenie końcowe) w celu zminimalizowania agregacji. Chociaż w niektórych przypadkach mocznik skutecznie zmniejsza agregację, często pogarsza wygląd pasma. - Analizuj próbki za pomocą immunoblot.
- Rozmrozić całkowite próbki lizatu i obracać równolegle z próbkami kulek, 30 min, w temperaturze pokojowej.
- Oddziel białka na żelach SDS-PAGE.
- Zidentyfikuj interesujące Cię białka za pomocą immunoblottingu.
- Należy upewnić się, że pasma są wykrywane w liniowym zakresie detekcji w celu prawidłowego określenia ilościowego.
- Aby upewnić się, że odczynnik biotynylacji nie uzyskał dostępu do białek wewnątrzkomórkowych przez uszkodzone/uszkodzone komórki. Najlepszym sposobem na osiągnięcie tego celu jest równoległe przeprowadzanie immunoblottingu dla białka wewnątrzkomórkowego specyficznego dla badanego typu komórki.
- Określ ilościowo gęstości pasm i oblicz względną gęstość powierzchniową białka jako procent całkowitego poziomu ekspresji białka.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Neuronalny transporter dopaminy ulega internalizacji w odpowiedzi na aktywację PKC w liniach komórkowych16-20. Mimo wielu doniesień wykazujących indukowaną przez PKC utratę DAT z powierzchni w różnych liniach komórkowych i systemach ekspresyjnych, potwierdzenie tego znaleziska w hodowlach neuronów dopaminergicznych okazało się trudne21-23. Wykorzystaliśmy skrawki prążkowia mysiego, aby bezpośrednio sprawdzić, czy DAT ulega internalizacji w odpowiedzi na aktywację PKC w dorosłych neuronach dopaminerg...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Pomimo długotrwałej wiedzy, że transport endocytarny krytycznie wpływa na sygnalizację synaptyczną w mózgu, ilościowy pomiar zmian w ekspresji powierzchni białka w dorosłych neuronach okazał się wyzwaniem. W tej pracy przedstawiamy wiarygodne podejście do znakowania białka powierzchniowego ex vivo w ostrych wycinkach mózgu. Preparaty do wycinków mózgu mają długą historię użyteczności w zapisach elektrofizjologicznych, ponieważ utrzymują połączenia synaptyczne i żywotność komórek do kilku godzin po ich przygotow...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych interesów finansowych, które byłyby w konflikcie z tą pracą.
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana przez granty NIH DA15169 i DA035224 dla H.E.M.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| sulfo NHS-SS-biotyna | Pierce | 21331 | |
| Streptawidyna agaroza | Pierce | 20347 | |
| Albumina surowicy bydlęcej bez IgG, bez proteaz | Sigma | A3059 | |
| Wibracyjny mikrotomik sekcyjny | różne | ||
| Kąpiel wodna wytrząsająca | różne | ||
| wkładki z siatką Millicell (8 i Mikro; m wielkość porów) | Millipore | PI8P 012 50 | Można je prać ręcznie i używać ponownie |
Bibliografia
- Conner, S. D., Schmid, S. L. Regulated portals of entry into the cell. Nature. 422, 37-44 (2003).
- Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (2012).
- Leto, D., Saltiel, A. R. Regulation of glucose transport by insulin: traffic control of GLUT4. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13, 383-396 (2012).
- Liu, Y. W., Lukiyanchuk, V., Schmid, S. L. Common membrane trafficking defects of disease-associated dynamin 2 mutations. Traffic. 12, 1620-1633 (2011).
- Li, X., DiFiglia, M. The recycling endosome and its role in neurological disorders. Prog. Neurobiol. , 127-141 (2012).
- Sandvig, K., Pust, S., Skotland, T., van Deurs, B. Clathrin-independent endocytosis: mechanisms and function. Curr. Opin. Cell Biol. 23, 413-420 (2011).
- Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Res. 20, 256-275 (2010).
- Barry, M. F., Ziff, E. B. Receptor trafficking and the plasticity of excitatory synapses. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 279-286 (2002).
- Bredt, D. S., Nicoll, R. A. AMPA receptor trafficking at excitatory synapses. Neuron. 40, 361-379 (2003).
- Kerchner, G. A., Nicoll, R. A. Silent synapses and the emergence of a postsynaptic mechanism for LTP. Nat. Rev. Neurosci. 9, 813-825 (2008).
- Malinow, R., Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annu. Rev. Neurosci. 25, 103-126 (2002).
- Borgland, S. L., Malenka, R. C., Bonci, A. Acute and chronic cocaine-induced potentiation of synaptic strength in the ventral tegmental area: electrophysiological and behavioral correlates in individual rats. J. Neurosci. 24, 7482-7490 (2004).
- Dong, Y., et al. Cocaine-induced potentiation of synaptic strength in dopamine neurons: Behavioral correlates in GluRA(-/-) mice. PNAS. 101, 14282-14287 (2004).
- Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory. Annu. Rev. Neurosci. 29, 565-598 (2006).
- Thomas, M. J., Malenka, R. C. Synaptic plasticity in the mesolimbic dopamine system. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358, 815-819 (2003).
- Sorkina, T., Hoover, B. R., Zahniser, N. R., Sorkin, A. Constitutive and protein kinase C-induced internalization of the dopamine transporter is mediated by a clathrin-dependent mechanism. Traffic. 6, 157-170 (2005).
- Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. Nonclassical, distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization. Nat. Neurosci. 8, 881-888 (2005).
- Loder, M. K., Melikian, H. E. The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines. J. Biol. Chem. 278, 22168-22174 (2003).
- Melikian, H. E., Buckley, K. M. Membrane trafficking regulates the activity of the human dopamine transporter. J. Neurosci. 19, 7699-7710 (1999).
- Daniels, G. M., Amara, S. G. Regulated trafficking of the human dopamine transporter. Clathrin-mediated internalization and lysosomal degradation in response to phorbol esters. J. Biol. Chem. 274, 35794-35801 (1999).
- Sorkina, T., et al. RNA interference screen reveals an essential role of Nedd4-2 in dopamine transporter ubiquitination and endocytosis. J. Neurosci. 26, 8195-8205 (2006).
- Eriksen, J., et al. Visualization of dopamine transporter trafficking in live neurons by use of fluorescent cocaine analogs. J. Neurosci. 29, 6794-6808 (2009).
- Rao, A., Simmons, D., Sorkin, A. Differential subcellular distribution of endosomal compartments and the dopamine transporter in dopaminergic neurons. Mol. Cell Neurosci. 46, 148-158 (2011).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8, 745-752 (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
