Artykuł metodologiczny

Demonstracja wielolekoopornej mikromacierzy amplifikacyjnej Mycobacterium tuberculosis

DOI:

10.3791/51256

⸱

25 kwietnia 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Akonni Biosystems, Inc.

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikromacierz amplifikacyjna łączy asymetryczną amplifikację PCR i hybrydyzację mikromacierzy w jednej komorze, co znacznie usprawnia pracę z mikromacierzą dla użytkownika końcowego. Uproszczenie przepływu pracy z mikromacierzami jest niezbędnym pierwszym krokiem do stworzenia diagnostyki opartej na mikromacierzach, która może być rutynowo używana w środowiskach o niższych zasobach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uproszczenie przepływu pracy z mikromacierzami jest niezbędnym pierwszym krokiem do stworzenia diagnostyki opartej na mikromacierzach MDR-TB, która może być rutynowo stosowana w środowiskach o niższych zasobach. Mikromacierz amplifikacyjna łączy asymetryczną amplifikację PCR, wybór wielkości docelowej, etykietowanie celu i hybrydyzację mikromacierzy w jednym roztworze i w jednej komorze mikroprzepływowej. Zademonstrowano metodę przetwarzania wsadowego z 9-pleksową asymetryczną mieszanką główną i mikromacierzą elementów żelowych o niskiej gęstości do genotypowania wielolekoopornych prątków gruźlicy (MDR-TB). Opisany tutaj protokół można ukończyć w ciągu 6 godzin i zapewnić prawidłowe genotypowanie z co najmniej 1000 odpowiedników komórkowych genomowego DNA. Możliwe jest włączenie etapów mycia na chipie, co spowoduje, że metoda i system amplikonu będą całkowicie zamknięte. Zakres multipleksowania za pomocą mikromacierzy amplifikacyjnej jest ostatecznie ograniczony przez liczbę par starterów, które można połączyć w pojedynczy miks główny i nadal osiągać pożądane wskaźniki czułości i swoistości, a nie przez liczbę sond, które są unieruchomione w macierzy. Podobnie, całkowity czas analizy może zostać skrócony lub wydłużony w zależności od konkretnego zamierzonego zastosowania, pytania badawczego i pożądanych granic wykrywalności. Niemniej jednak ogólne podejście znacznie usprawnia przepływ pracy z mikromacierzami dla użytkownika końcowego poprzez zmniejszenie liczby ręcznie intensywnych i czasochłonnych etapów przetwarzania oraz zapewnia uproszczoną ścieżkę biochemiczną i mikroprzepływową do przełożenia diagnostyki opartej na mikromacierzach na rutynową praktykę kliniczną.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wczesne wykrywanie przypadków i szybkie leczenie są uważane za najskuteczniejsze strategie kontroli w celu zmniejszenia transmisji Mycobacterium tuberculosis (MTB)1, a obecnie istnieje szeroki konsensus w społeczności gruźlicy, że potrzebny jest test w miejscu opieki nad pacjentem (POC) lub w pobliżu POC, aby jednocześnie zdiagnozować gruźlicę i oporność na leki (DR). Technologie takie jak GeneXpert firmy Cepheid i inne testy amplifikacji kwasów nukleinowych skracają czas do postawienia diagnozy u wielu pacjentów z gruźlicą i zapewniają szybki odczyt wskazujący na oporność na ryfampicynę lub wybrane mutacje nadające oporność na inne leki pierwszego lub drugiego rzutu2. Chociaż testy amplifikacji kwasów nukleinowych w czasie rzeczywistym i izotermiczne mają na celu identyfikację mutacji oporności na leki, które prowadzą do MDR-TB, spektrum mutacji, które wykrywają, jest często niewystarczające do zaprojektowania zindywidualizowanego schematu leczenia odpowiadającego profilowi oporności pacjenta na leki oraz ograniczeń technicznych związanych z przesłuchami optycznymi lub złożonością amplifikacji i raportowania chemii3-7 Może ograniczać liczbę wykrywanych loci lub mutacji. W związku z tym potrzebne są technologie detekcji o większej zdolności multipleksowania, aby wyeliminować znane luki w diagnostyce MDR-TB POC.

Mikromacierze i zatwierdzone przez WHO testy sondy linii Hain mogą rozwiązać problem diagnozowania MDR-TB8-29 w odpowiedzi na pytanie "wiele genów, wiele mutacji". Niestety, te oparte na hybrydyzacji, multipleksowane platformy detekcyjne wykorzystują wieloetapowe, skomplikowane i otwarte protokoły amplikonowe, które wymagają znacznego szkolenia i biegłości w technikach molekularnych. Mikromacierz wzmacniająca30 została zaprojektowana w celu rozwiązania niektórych z tych problemów związanych z przepływem pracy i operacjami. Upraszczające zasady przepływu polegają na amplifikacji, hybrydyzacji i wykrywaniu celów kwasu nukleinowego w jednej komorze mikroprzepływowej. Użytkownik wprowadza główną mieszankę kwasu nukleinowego i amplifikacji do komory fluidycznej z pipetą i uruchamia protokół cykli termicznych. W przypadku przedstawionej tutaj metody przetwarzania wsadowego mikromacierze są następnie myte w roztworze zbiorczym, suszone i obrazowane. Badanie to demonstruje funkcjonalność mikromacierzy amplifikacyjnej przy użyciu testu mikromacierzy MDR-TB dla rpoB (30 mutacji), katG (2 mutacje), inhA (4 mutacje), rpsL (2 mutacje), embB (1 mutacja), IS1245, IS6110 oraz wewnętrznej kontroli amplifikacji i hybrydyzacji. Dla każdej interesującej mutacji dołączona jest co najmniej jedna dopasowana para sond mikromacierzowych (typu dzikiego (WT) i mutanta pojedynczego nukleotydu (MU)). Oczyszczone kwasy nukleinowe z wielolekoopornej M. tuberculosis pochodzą z TDR Tuberculosis Strain Bank31. Mikromacierze elementów żelowych są wytwarzane na podłożach szklanych przez kopolimeryzację, zasadniczo tak, jak opisano w innym miejscu32, z wyjątkiem tego, że w mieszaninie polimeryzacyjnej używamy 4% monomeru i 0,05 mM każdej sondy. Przed użyciem matryce są otoczone uszczelką o pojemności 50 ml. Po cyklach termicznych, hybrydyzacji i myciu, mikromacierze amplifikacyjne są obrazowane na przenośnym analizatorze Akonni. Skorygowane tło, zintegrowane intensywności sygnału są uzyskiwane z surowych obrazów .tif przy użyciu algorytmu stałego okręgu. Szum dla każdego elementu żelowego jest obliczany jako trzykrotność odchylenia standardowego lokalnego tła punktowego. Cele genowe są zwykle uważane za wykrywalne dla wartości stosunku sygnału do szumu (SNR) ≥3. W celu określenia obecności lub braku określonej mutacji w każdym genie lub kodonie, na podstawie wartości SNR oblicza się współczynnik dyskryminacji jako (WT-MU)/(WT+MU). Współczynniki dyskryminacji <0 wskazują na mutację oporności na leki w locus, podczas gdy współczynniki >0 wskazują na sekwencję typu dzikiego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dla laboratoriów, które stosują uniwersalne środki ostrożności PCR, bardziej efektywne jest dołączenie kilku mikromacierzy amplifikacyjnych i uszczelek na podłoże i jednoczesne mycie wszystkich mikromacierzy amplifikacyjnych w pojemniku zbiorczym, jak opisano tutaj. Dostępne są formaty materiałów eksploatacyjnych do wykonywania etapów mycia mikromacierzy po amplifikacji w całkowicie szczelnym, zamkniętym teście amplikonowym, jak podano w innym miejscu30,33.

1. Konfiguracja

  1. Ekstrahować i oczyszczać kwasy nukleinowe z próbki w odpowiednich warunkach bezpieczeństwa biologicznego przy użyciu wybranej metody. Wymogiem jest, aby kwasy nukleinowe miały wystarczającą czystość do asymetrycznej, multipleksowej amplifikacji PCR.
  2. Przygotuj miejsce pracy, przecierając powierzchnie i sprzęt roztworami odkażającymi.
  3. Umieść odczynniki do amplifikacji na lodzie lub zimnym bloku.
  4. Oznacz sterylną probówkę do mikrofugi o pojemności 1,5 ml dla głównej mieszanki amplifikacji i oznacz sterylną probówkę do mikrofugi o pojemności 0,2 ml dla każdej próbki.
  5. Po rozmrożeniu odczynników należy na krótko zmieszać i zebrać zawartość na dno probówki za pomocą impulsowego wirowania w mini-wirówce. Nie należy wirować polimerazy Taq. Delikatnie przesuń probówkę, aby wymieszać, a następnie pulsacyjnie wiruj w mini-wirówce.
  6. Przygotować wzorcową mieszaninę amplifikacji, wykorzystując objętości reakcji dla każdej próbki przedstawione w tabeli 1. Aby uwzględnić możliwe niedokładności pipetowania, należy przygotować co najmniej o jedną objętość reakcyjną więcej niż całkowita liczba przetwarzanych próbek. Należy zauważyć, że mieszanka główna zawiera dodatkową polimerazę Taq, poza tym, co jest dostarczane z buforem muliplex PCR. Kontrolę amplifikacji/inhibicji należy dodać do mieszanki głównej dopiero po połączeniu wszystkich innych odczynników i powrocie podstawowych probówek z odczynnikiem do przechowywania.
pkt. .
OdczynnikNa objętość próbki (μl)Finał [ ]
Bufor Mulitplex PCR z HotStar Taq Plus251x
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)0,550,6 mg/ml
Formamid3.87,6 proc
Dodatkowa polimeraza Taq0,8jednostek/μl (łącznie 4 jednostki)
Mieszanka gruntująca MDR-TBgodz. 15.75-
Nie zawiera RNaz H2O2.1-
Kontrola wzmocnienia/hamowania15,0 fg/μl
łącznyRozdział 49

Tabela 1. Kompozycja głównego miksu mikromacierzy amplifikacyjnej MDR-TB.

  1. Zmieszaj mieszankę wzorcową i zbierz zawartość na dno probówki za pomocą impulsowego wirowania w mini-wirówce.
  2. Połączyć 49 μl mieszanki wzorcowej i 1 μl DNA M. tuberculosis z każdą probówką z próbką z kroku 1.4 powyżej. W przypadku zewnętrznej kontroli bez matrycy (NTC) należy użyć 1 μl wody klasy biologii molekularnej zamiast próbki DNA M. tuberculosis. Po zakończeniu wiruj i pulsacyjnie obracaj rurkę (rurki).

2. Mikrotablice wzmocnienia obciążenia

  1. Dodaj 48 μl każdej głównej mieszanki/próbki na środek odpowiednich mikroukładów, uważając, aby nie dotknąć samej mikromacierzy.
  2. Umieść szkiełko nakrywkowe na uszczelce mikromacierzy i uszczelnij, uważając, aby nie uwięzić żadnych pęcherzyków powietrza w komorze mikromacierzy. Pęcherzyki powietrza mogą negatywnie wpływać na wydajność wzmocnienia i mogą powodować artefakty lub szumy w późniejszym obrazie mikromacierzy.

3. Jazda na rowerze termicznym

  1. Po załadowaniu wszystkich mikromacierzy próbką, umieść podłoża na termocyklerze z płaskim blokiem. Upewnij się, że opcja podgrzewanej pokrywy jest wyłączona. Sprzęt pozyskany od Akonni Biosystems będzie już wstępnie zakwalifikowany do użytku. W przeciwnym razie bardzo ważne jest sprawdzenie, czy termocykler płaski zapewnia równomierne, spójne ogrzewanie na wszystkich podłożach mikromacierzy.
  2. Otwórz oprogramowanie termocyklera, wybierz odpowiedni program, wprowadź "50 μl" jako objętość reakcji i rozpocznij przebieg. Opisany tutaj protokół cykli termicznych składa się z:
    Termiczne kroki rowerowe
    188 °CCzas trwania: 5 min
    cyfra arabska88 °C30 sekund
    355 °C1 min
    465 °C30 sekund
    5Powtarzaj kroki (2-4) przez 50 cykli
    665 °CCzas trwania: 3 min
    755 °C3 godz
  3. Całkowita liczba cykli termicznych i czas podtrzymania po amplifikacji wynoszący 55 °C są niezależnymi zmiennymi, które użytkownik może modyfikować w zależności od potrzeb lub potrzeb danego eksperymentu. Ponieważ mieszanka główna MDR-TB tworzy asymetryczne (głównie jednoniciowe) amplikony, zwykle pomocne jest uwzględnienie większej liczby cykli termicznych, niż można by wykorzystać w przypadku konwencjonalnego, wykładniczego protokołu amplifikacji PCR.
  4. Po zakończeniu programu cykli termicznych i hybrydyzacji zakończ program, usuń mikromacierze wzmacniające, zamknij oprogramowanie i wyłącz cykler termiczny.

4. Prać i suszyć

  1. Do jednoczesnego mycia do 24 podłoży należy przygotować co najmniej 250 ml 1x SSPE – 0,1% buforu do płukania Triton X-100 oraz dwa pojemniki z co najmniej 250 ml wody dejonizowanej lub klasy Milli-Q każdy. Bufor do mycia można przygotować z wyprzedzeniem.
  2. Ostrożnie wyjmij szkiełko nakrywkowe i uszczelkę z każdej komory mikromacierzy amplifikacyjnej za pomocą kleszczyków z płaskim końcem. Ten krok jest punktem, w którym istnieje największe ryzyko fizycznego uszkodzenia układów elementów żelowych. Stosuj odpowiednie kontrole zanieczyszczenia PCR, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się amplifikowanych kwasów nukleinowych w środowisku pracy.
  3. Umieść podłoża mikromacierzy w uchwycie na szkiełka histologiczne i umieść wszystkie szkiełka w pojemniku do mycia zawierającym bufor do mycia. Przykryj pojemnik pokrywką.
  4. Myć mikromacierze przez 10 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
  5. Zanurz mikromacierze trzy razy każdy w dwóch kolejnych płukaniach wodą dejonizowaną lub klasy Milli-Q i wysusz na powietrzu.

5. Obrazowanie

Asymetryczna mieszanka starterów MDR-TB generuje amplikony znakowane Cy3. Mikromacierze z elementami żelowymi mogą być obrazowane za pomocą dowolnego standardowego imagera do mikromacierzy zdolnego do obrazowania Cy3. Poniższa procedura obrazowania jest specyficzna dla miksu głównego MDR-TB, przenośnego imagera terenowego Dx2100 i oprogramowania do automatycznej analizy dostarczonego przez firmę Akonni.

  1. Upewnij się, że Ethernet z termowizora jest podłączony do komputera.
  2. Włącz wywoływarkę. Włącznik zasilania znajduje się na tylnym panelu instrumentu. Niebieskie diody LED z przodu wywoływarki świecą się, gdy wywoływarka jest włączona.
  3. Włącz komputer.
  4. Na pulpicie komputera kliknij dwukrotnie ikonę oprogramowania, aby uruchomić oprogramowanie do automatycznej analizy obrazu.
  5. Poczekaj, aż oprogramowanie nawiąże połączenie z kamerą imager. Po nawiązaniu połączenia przycisk Analizuj stanie się dostępny, a w lewym dolnym rogu ekranu pojawi się komunikat "Połączenie powiodło się".
  6. Włóż wysuszoną mikromatrycę wzmacniającą tak, aby mikromatryca była skierowana od użytkownika i skierowana w stronę soczewki obiektywu. Jeśli mikromatryca jest nieprawidłowo zorientowana w stosunku do obiektywu i kamery, oprogramowanie do automatycznej analizy nie umieści siatki na obrazie fluorescencyjnym.
  7. Zamknij drzwiczki dostępu. Obraz podglądu będzie dostępny na ekranie komputera.
  8. Z menu rozwijanego wybierz skrypt analizy MDR-TB i wprowadź żądany czas ekspozycji (w milisekundach). Typowym punktem wyjścia dla mikromacierzy amplifikacji elementów żelowych jest 100-500 ms.
  9. Nasycone piksele będą wyświetlane na obrazie podglądu w kolorze czerwonym. Dostosuj czas ekspozycji, aby zminimalizować liczbę nasyconych pikseli w poszczególnych miejscach.
  10. Kliknij przycisk Analizuj, aby uzyskać i przeanalizować obraz fluorescencji. Oprogramowanie automatycznie umieści na obrazie siatkę specyficzną dla testu MDR-TB, wyodrębni zintegrowane wartości intensywności i tła oraz poda wyniki lekooporności i genotypowania. Automatyczna analiza zazwyczaj trwa kilka sekund. W przypadku trudnych obrazów, które zawierają zadrapania, kurz, artefakty fluorescencyjne lub fizyczne uszkodzenia funkcji mikromacierzy, oprogramowanie może potrzebować do 1 minuty na zakończenie analizy.
  11. Po zakończeniu analizy kliknij przycisk Zapisz, wybierz folder docelowy, wpisz nazwę pliku i kliknij przycisk OK. Podstawowe dane mikromacierzy są zapisywane jako plik .xls i w razie potrzeby można je wyeksportować do analiz off-line.
  12. Po zakończeniu analizy wyjmij mikromacierz amplifikacyjną z imagera i kliknij Nowy, aby rozpocząć następną analizę.
  13. Po zakończeniu zbierania danych zamknij oprogramowanie, wyłącz komputer i wyłącz imager.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jakościowa analiza obrazu może dostarczyć wglądu w źródła eksperymentalnego szumu lub zmienności, które są trudne do zidentyfikowania w tabelach danych generowanych przez oprogramowanie do automatycznej analizy obrazów. W związku z tym przydatne może być wizualne upewnienie się, że 1) wszystkie elementy żelu są nienaruszone i nieuszkodzone, 2) globalne tło jest wolne od artefaktów fluorescencyjnych, które mogłyby wpływać na indywidualne wartości stosunku sygnału do szumu (SNR), 3) nie ma dowodów na tworzenie się pęcherzy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zakres multipleksowania za pomocą mikromacierzy amplifikacyjnej jest ostatecznie podyktowany wydajnością asymetrycznego PCR multipleksowego, a nie mikromacierzy. Z naszego doświadczenia wynika, że 10-12 unikalnych par starterów można łatwo multipleksować w formacie mikromacierzy amplifikacyjnej. Konwencjonalne kryteria projektowania starterów i sond mają zatem zastosowanie do nowych testów, z wyjątkiem tego, że należy również wziąć pod uwagę potencjalne interakcje między kwasami nukleinowymi w fazie roztworu a unieruchom...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (NIH) w ramach grantu RC3 AI089106.

MDR-TB kwasy nukleinowe zostały dostarczone przez Fundusz Narodów Zjednoczonych na rzecz Dzieci/Program Rozwoju Organizacji Narodów Zjednoczonych/Bank Światowy/Specjalny Program Badań i Szkoleń w Chorobach Tropikalnych (TDR), Genewa, Szwajcaria.

Dziękujemy dr Tomowi Shinnickowi z U.S. Centers for Disease Control and Prevention za wskazówki dotyczące konkretnych genów i mutacji, które należy uwzględnić w testach prototypowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikromacierze amplifikacyjne MDR-TB, z nałożoną uszczelką i wstępnie przyciętymi szkiełkami nakrywkowymiZestaw Akonni BiosystemsInquire
Multiplex PCR, zawierający 2X bufor PCR z HotStar Taq plusQiagen#206143
polimeraza TaqQiagen#201207
Woda wolna od RNAse#206143 
FormamidThermo Fisher Scientific, Inc.#BP227-500
20 mg mL-1 bezoctanowa albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-Aldrich#3B6917
5X skoncentrowana mieszanka podkładowa MDR-TBAkonni BiosystemsZapytaj
500 fg uL-1 kontrola amplifikacji i inhibicjiAkonni BiosystemsZapytaj
20X SSPEThermo Fisher Scientific, Inc. #BP1328-4
Triton X-100Thermo Fisher Scientific, Inc.#BP151-500
Spray dezynfekujący Aktualne technologie, Inc.
70% alkohol izopropylowyDecon Labs, Inc.#8416
Imager Microray, z oprogramowaniem do automatycznej analizy obrazu i danychAkonni Biosystems100-20011
Termocykler z płaską wkładką blokowąAkonni Biosystems100-10021
Wysokowydajna stacja mycia i uchwyt do suwakówArrayItHTW
Kleszcze preparacyjneThermo Fisher Scientific, Inc.#10-300
Mini wirówkaVWR#3365040
VWR#93000-196
Zestaw kompresora aerografuCentralna pneumatyczna#95630
#BRSPRAY128

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lemaire, J. -F., Casenghi, M. New diagnostics for tuberculosis: fulfilling patient needs first. J. Int. AIDS Soc. 13, 40(2010).
  2. World Health Organization. Tuberculosis diagnostic technology landscape. 42, World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2012).
  3. Notomi, T., Okayama, H., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucl. Acids Res. 28, e63(2000).
  4. Vincent, M., Xu, Y., Kong, H. Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep. 5, 795-800 (2004).
  5. Pritchard, C. G., Stefano, J. E. Amplified detection of viral nucleic acid at subattomole levels using Q beta replicase. Ann. Biol. Clin. 48, 492-497 (1990).
  6. Compton, J. Nucleic acid sequence-based amplification. Nature. 350, 91-92 (1991).
  7. Guatelli, J. C., Whitfield, K. M., et al. Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1874-1878 (1990).
  8. Shi, X. C., Liu, X. Q., Xie, X. L., Xu, Y. C., Zhao, Z. X. Gene chip array for differentiation of mycobacterial species and detection of drug resistance. Chin. Med. J. , 3292-3297 (2012).
  9. Troesch, A., Nguyen, H., et al. Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays. J. Clin. Microbiol. 37, 49-55 (1999).
  10. Caoili, J. C., Mayorova, A., et al. Evaluation of the TB-biochip oligonucleotide microarray system for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 44, 2378-2381 (2006).
  11. Waddell, S., Laing, K., Senner, C., Butcher, P. Microarray analysis of defined Mycobacterium tuberculosis populations using RNA amplification strategies. BMC Genomics. 9, 94(2008).
  12. Fukushima, M., Kakinuma, K., et al. Detection and identification of mycobacterium species isolates by DNA microarray. J. Clin. Microbiol. 41, 2605-2615 (2003).
  13. Park, H., Jang, H., et al. Detection and genotyping of Mycobacterium species from clinical isolates and specimens by oligonucleotide array. J. Clin. Microbiol. 43, 1782-1788 (2005).
  14. Yao, C., Zhu, T., et al. Detection of rpoB, katG and inhA gene mutations in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Chongqing as determined by microarray. Clin. Microbiol. Infect. 16, 1639-1643 (2010).
  15. Sun, A. H., Fan, X. L., et al. Rapid detection of rpoB gene mutations in rif-resistant M. tuberculosis isolates by oligonucleotide microarray. Biomed. Environ. Sci. 22, 253-258 (2009).
  16. Volokhov, D. V., Chizhikov, V. E., Denkin, S., Zhang, Y. Molecular detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Methods Mol. Biol. 465, 395-417 (2009).
  17. Fu, L., Shinnick, T. M. Understanding the action of INH on a highly INH-resistant Mycobacterium tuberculosis strain using Genechips. Tuberculosis. 87, 63-70 (2007).
  18. Fu, L. M., Shinnick, T. M. Genome-wide exploration of the drug action of capreomycin on Mycobacterium tuberculosis using Affymetrix oligonucleotide GeneChips. J. Infect. 54, 277-284 (2007).
  19. Denkin, S., Volokhov, D., Chizhikov, V., Zhang, Y. Microarray-based pncA genotyping of pyrazinamide-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis. J. Med. Microbiol. 54, 1127-1131 (2005).
  20. Gryadunov, D. A., Mikhailovich, V., et al. Evaluation of hybridisation on oligonucleotide microarrays for analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Clin. Microbiol. Infect. 11, 531-539 (2005).
  21. Tang, X., Morrix, S. L., Langone, J. J., Bockstahler, L. E. Microarray and allele specific PCR detection of point mutations in Mycobacterium tuberculosis genes associated with drug resistance. J. Microbiol. Methods. 63, 318-330 (2005).
  22. Wade, M. M., Volokhov, D., Peredelchuk, M., Chizhikov, V., Zhang, Y. Accurate mapping of mutations of pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 49, 89-97 (2004).
  23. Yue, J., Shi, W., et al. Detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by using a specialized oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 48, 47-54 (2004).
  24. Kim, S. Y., Park, Y. K., et al. Evaluation of the CombiChip Mycobacteria Drug-Resistance detection DNA chip for identifying mutations associated with resistance to isoniazid and rifampin in Mycobacterium tuberculosis. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 54, 203-210 (2006).
  25. Brown, T. J., Herrera-Leon, L., Anthony, R. M., Drobniewski, F. A. The use of macroarrays for the identification of MDR Mycobacterium tuberculosis. J. Microbiol. Methods. 65, 294-300 (2006).
  26. Brossier, F., Veziris, N., Truffot-Pernot, C., Jarlier, V., Sougakoff, W. Performance of the genotype MTBDR line probe assay for detection of resistance to rifampin and isoniazid in strains of Mycobacterium tuberculosis with low- and high-level resistance. J. Clin. Microbiol. 44, 3659-3664 (2006).
  27. Padilla, E., Gonzalez, V., et al. Comparative evaluation of the new version of the INNO-LiPA Mycobacteria and GenoType Mycobacterium assays for identification of Mycobacterium species from MB/BacT liquid cultures artificially inoculated with mycobacterial strains. J. Clin. Microbiol. 42, 3083-3088 (2004).
  28. Barnard, M., Gey van Pittius, N. C., et al. The diagnostic performance of the GenoType MTBDRplus Version 2 line probe assay is equivalent to that of the Xpert MTB/RIF assay. J. Clin. Microbiol. 50, 3712-3716 (2012).
  29. Sekiguchi, J. -I., Nakamura, T., et al. Development and evaluation of a line probe assay for rapid identification of pncA mutations in pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains. J. Clin. Microbiol. 45, 2802-2807 (2007).
  30. Chandler, D. P., Bryant, L., et al. Integrated amplification microarrays for infectious disease diagnostics. Microarrays. 1, 107-124 (2012).
  31. Vincent, V., Rigouts, L., et al. The TDR Tuberculosis Strain Bank: a resource for basic science, tool development and diagnostic services. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 16, 24-31 (2012).
  32. Golova, J. B., Chernov, B. K., et al. Non-volatile copolymer compositions for fabricating gel element microarrays. Anal. Biochem. 421, 526-533 (2012).
  33. Cooney, C. G., Sipes, D., Thakore, N., Holmberg, R., Belgrader, P. A plastic, disposable microfluidic flow cell for coupled on-chip PCR and microarray detection of infectious agents. Biomed. Microdevices. 14, 45-53 (2012).
  34. Lane, S., Evermann, J., Loge, F., Call, D. R. Amplicon secondary structure prevents target hybridization to oligonucleotide microarrays. Biosens. Bioelectron. 20, 728-735 (2004).
  35. El-Hajj, H. H., Marras, S. A. E., et al. Use of sloppy molecular beacon probes for identification of Mycobacterial species. J. Clin. Microbiol. 47, 1190-1198 (2009).
  36. Boehme, C. C., Nabeta, P., et al. Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance. N. Engl. J. Med. 363, 1005-1015 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Asymetryczna PCRMultiplex PCRkomora mikrofluidycznagenotypowanie MDR TBdetekcja mutacji DNAcyklizacja termicznahybrydyzacja mikromacierzyprzemywanie na chipieobrazownik Econ DX 2100

Powiązane artykuły