Składanie i charakterystyka bioresponsywnego robota z DNA Origami

Podsumowanie

Origami DNA to potężna metoda wytwarzania precyzyjnych obiektów w nanoskali poprzez programowanie samoorganizacji cząsteczek DNA. Tutaj opisujemy protokół składania robota reagującego biologicznie z origami DNA, jego oczyszczania i barwienia ujemnego do obrazowania pod mikroskopem elektronowym transmisyjnym (TEM).

Streszczenie

Nanorobot DNA to puste sześciokątne urządzenie nanometryczne, zaprojektowane tak, aby otwierać się w odpowiedzi na określone bodźce i prezentować ładunek ukryty w środku. Zarówno bodźce, jak i ładunek mogą być dostosowane do konkretnych potrzeb. W tym miejscu opisujemy protokół wytwarzania nanorobotów DNA z wykorzystaniem techniki origami DNA. Procedura rozpoczyna się od zmieszania krótkich jednoniciowych zszywek DNA z mieszanką podstawową, która jest następnie dodawana do długiego, okrągłego, jednoniciowego rusztowania DNA w obecności składanego buforu. Standardowy termocykler jest zaprogramowany tak, aby stopniowo obniżać temperaturę reakcji mieszania, aby ułatwić wyżarzanie zszywek do rusztowania, które jest siłą prowadzącą za składaniem nanorobota. Po zakończeniu 60-godzinnej reakcji fałdowania nadmiar zszywek jest usuwany za pomocą filtra odśrodkowego, a następnie poddawany jest wizualizacji za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (AGE). Pomyślne wyprodukowanie nanorobota jest weryfikowane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), z użyciem mrówczanu uranu jako barwienia ujemnego.

Wprowadzenie

Zastosowania nanotechnologii kwasów nukleinowych są zdumiewające. Wykonalność parowania zasad Watsona-Cricka, a także łatwość i stosunkowo niski koszt syntezy na dużą skalę niestandardowych oligonukleotydów² spowodowały eksplozję zastosowań³ i badań w dziedzinie nanotechnologii DNA. Strukturalna nanotechnologia DNA, oparta na nieruchomym złączu Seeman^4,5 jako podstawowym elemencie budulcowym, wykorzystuje DNA jako samoorganizującą się jednostkę elementarną do budowy dowolnych kształtów^6-8.

Niedawny^{rozwój techniki} origami 9 z rusztowaniem DNA pozwala na budowę złożonych nano-architektur 2D/^{3D 10-12} z sub-nanometrową precyzją i jest efektywną drogą do budowania nowych funkcjonalnych obiektów o rosnącej złożoności i zadziwiającej różnorodności. Proces budowy opiera się na długim rusztowaniu jednoniciowym DNA, zwykle pochodzącym z genomu wirusa, który można złożyć poprzez hybrydyzację setek krótkich jednoniciowych oligonukleotydów DNA zwanych zszywkami. Wysoka rozdzielczość strukturalna uzyskana za pomocą tej techniki jest bezpośrednim wynikiem naturalnych wymiarów podwójnej helisy DNA, podczas gdy powtarzalność wytwarzania jest wynikiem dostosowania krótkich sekwencji jednoniciowych zszywek w celu ułatwienia maksymalnej osiągalnej komplementarności wiązań wodorowych. Dzięki zastosowaniu rampy do wyżarzania w niskiej temperaturze osiąga się zaprojektowaną nanostrukturę o najniższej energii, preferowaną termodynamicznie, charakteryzującą się wysoką wydajnością i wiernością. Łatwa implementacja reguł projektowania skrzyżowań w kodzie komputerowym umożliwiła opracowanie narzędzi CAD, takich jak caDNAno¹³, które niezwykle upraszczają zadanie projektowania dużych, złożonych struktur zawierających setki połączonych skrzyżowań.

Poprzednio opisaliśmy projekt nanorobota DNA za pomocą narzędzia caDNAno^14,15. Tutaj przedstawiamy produkcję i wizualizację, za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), nanorobota, pustego w środku sześciokątnego nanourządzenia 3D o wymiarach 35 x 35 x 50 nm³, zaprojektowanego do przechodzenia poważnej zmiany konformacyjnej w odpowiedzi na z góry określone bodźce i prezentowania określonego ładunku, takiego jak białka lub oligonukleotydy kwasu nukleinowego, sekwestrowane w środku. Podczas gdy w pustym podwoziu dostępnych jest 12 stacji załadunkowych, rzeczywista liczba ładunków przewożonych różni się w zależności od wielkości ładunku. Cząsteczki ładunku obejmują zarówno małe cząsteczki DNA, jak i enzymy, przeciwciała i nanocząstki złota o długości fali 5-10 nm. Ładunek może być jednorodny lub niejednorodny, tak że każdy nanorobot zawiera mieszaninę różnych cząsteczek. Wykrywanie odbywa się za pomocą dwóch podwójnych spiralnych bramek blokujących do wykrywania białek, kwasów nukleinowych lub innych substancji chemicznych, w oparciu o technologie aptasensor^16,17 lub przemieszczenia nici DNA¹⁸. Najnowsze osiągnięcia w zakresie protokołów wyboru aptamerów^19-21 umożliwiają projektowanie nanorobotów reagujących na coraz szerszy zakres cząsteczek i typów komórek.

Wcześniejsza praca pokazała nanorobota przenoszącego specyficzne przeciwciało, które po związaniu się ze swoim antygenem może przekazywać zarówno hamujący, jak i płodny sygnał do wnętrza określonych typów komórek w mieszanej populacji^{komórek 15}. Ekscytującą cechą tych nanourządzeń jest ich zdolność do wykonywania jeszcze bardziej złożonych zadań i sterowania logicznego dzięki wprowadzeniu różnych podtypów nanorobotów w jednej populacji. Niedawno zademonstrowaliśmy konkretne podtypy nanorobotów działających jako pozytywne lub negatywne regulatory, kontrolujące populację efektorów zawierających aktywną cząsteczkę ładunku²².

Protokół przedstawiony tutaj opisuje wytwarzanie, oczyszczanie i obrazowanie nanorobota z sekwencjami czujników aptamerowych, które selektywnie wiążą się z PDGF, aby ułatwić otwarcie nanorobota^15,22. Opisany proces wytwarzania jest podobny do procesu wytwarzania nanorobotów początkowo opisanego przez Douglasa i wsp.¹⁵ ze zmianami mającymi na celu skrócenie całkowitego czasu trwania procesu, przy jednoczesnym zwiększeniu wydajności i wskaźników oczyszczania.

Protokół

1. Przygotowanie mieszanki basenowej Staples

1. Zamów liofilizowane zszywki nanorobota DNA na 96-dołkowych płytkach, jak podano w Tabeli 1 (patrz Materiały) i znormalizuj do 10 nmol. Szczegółowy opis konstrukcji i architektury nanorobota DNA można znaleźć w Ben-Ishay et al.¹⁴ oraz Douglas i wsp.^{Rozdział 15}).
2. Rozpuść każdą zszywkę w ultraczystej czystości wolnej od DNaz/RNaz do stężenia 100 μM. W przypadku zszywek znormalizowanych do 10 nmol należy rozpuścić w 100 μl ultraczystej wody.
3. Zebrać razem 20 μl każdej zszywki za pomocą pipety wielokanałowej i sterylnego zbiornika na roztwór o pojemności 55 ml.
   Uwaga: Ponieważ kształt nanorobota składa się z 254 pasm zszywek (w tym sekwencji rdzenia, krawędzi, uchwytów i prowadnic, tabela 1), stężenie każdej ze zszywek w puli zszywek wynosi 394 nM. Usunięcie zszywek z puli zszywek lub dodanie ich w różnych ilościach może znacznie zmniejszyć wydajność lub w inny sposób spowodować powstanie niespakowanych agregatów.

2. Przygotowanie mieszaniny reakcji wytwarzania

1. Do standardowej mieszaniny reakcyjnej należy użyć 40 μl jednoniciowego DNA o genomie wirusa M13mp18, co odpowiada 4 pmol DNA rusztowania (roztwór podstawowy 100 nM, patrz Materiały). Końcowe stężenie rusztowania w mieszaninie produkcyjnej wynosi 20 nM, objętość końcowa 200 μl.
   1. Dostosuj ilość DNA rusztowania do konkretnych potrzeb, jednak końcowe stężenie DNA rusztowania w mieszaninie reakcyjnej należy utrzymać na stałym poziomie 20 nM.
2. Dodaj zszywki, aby osiągnąć stosunek rusztowania do zszywek wynoszący odpowiednio od 1 do 10. W przypadku stężenia DNA rusztowania 20 nM, końcowe stężenie każdej z 254 zszywek wynosi 200 nM. Dla końcowej objętości reakcyjnej 200 μl dodać 102 μl mieszaniny poolu zszywek (sekcja 1.2).
   1. W tym czasie dodaj określone sekwencje bramek oddzielnie do mieszaniny reakcji fałdowania. Oligonukleotydy te są zamawiane oddzielnie i wymagają oczyszczania metodą HPLC. Upewnij się, że oligonukleotydy bramki są obecne w stosunku 1:10 rusztowania do sekwencji bramki, tj. 200 nM każdego oligonukleotydium dla stężenia rusztowania 20 nM. Aby uzyskać objętość reakcji fałdowania 200 μl, dodać 0,4 μl dla każdego z czterech oligonuligów bramek przy stężeniu podstawowym 100 μM.
3. Dodać 10x bufor TAE, aby osiągnąć końcowe stężenie 1x TAE (40 mM Tris-Acetate, 1 mM EDTA). Aby uzyskać objętość reakcji fałdowania 200 μl, dodać 20 μl 10x TAE.
4. Dodać 1 M MgCl₂ do końcowego stężenia 10 mM. Aby uzyskać objętość reakcji składania 200 μl, dodać 2 μl z 1 M MgCl₂.
5. Dodać 36 μl ultraczystej wody wolnej od DNaz/RNaz, aby osiągnąć końcową objętość 200 μl.
6. Wirować i podwielokrotność próbek 100 μl do fiolek PCR.
   Uwaga: Zapoznaj się ze specyfikacją termocyklera dotyczącą maksymalnych objętości reakcji, które należy zastosować. Zmniejszenie objętości w celu spełnienia tych limitów nie zmniejszy uzyskanych plonów. Objętości reakcji powyżej określonego maksimum zagrozi wydajności.

3. Temperatura wyżarzania Rampa reakcji produkcyjnej

1. Zaprogramuj termocykler w następujący sposób:
   1. Rampa od 85 °C do 60 °C z prędkością 5 min/°C.
   2. Rampa od 60 °C do 4 °C z szybkością 75 min/°C.
   3. Utrzymywać w temperaturze 4 °C przez czas nieokreślony.
2. Po zakończeniu produkcji należy przechowywać próbki w temperaturze -20 °C.

4. Usuwanie nadmiaru zszywek

1. Dodać 100 μl mieszaniny reakcyjnej fałdowania do 0,5 ml filtra odśrodkowego o MWCO 100 kDa. Zachowaj próbkę 10 μl nanorobotów do wstępnego oczyszczenia do późniejszej analizy.
2. Wirować przez 10 minut przy 9 600 x g.
3. Dodać 400 μl buforu składanego (1x TAE, 10 mM MgCl₂).
4. Powtórz kroki 4.2 i 4.3 jeszcze dwa razy.
5. Wirować przez 5 minut przy 9 600 x g.
6. Odzyskaj koncentrat, umieszczając filtr do góry nogami w czystej probówce do mikrowirówki i wiruj przez 1 minutę przy 9 600 x g. Końcowe objętości mogą się różnić w zależności od początkowej objętości mieszaniny reakcyjnej, która została włożona do filtra. Zazwyczaj uzyskuje się 25-60 μl końcowej objętości skoncentrowanej próbki nanorobota.
7. Zmierzyć stężenie DNA w próbkach za pomocą spektrofotometru przy długości fali 260 nm. Do obliczania stężeń molowych próbek nanorobotów należy użyć masy cząsteczkowej 5,3 μg/pmol.
   Uwaga: Molowy współczynnik ekstynkcji dla dsDNA, 50 μg/OD_260, jest wystarczający dla większości zastosowań. 48 μg/OD₂₆₀ uwzględnia rozciąganie ssDNA polityminy na zszywkach Edges.

5. Analiza elektroforezy w żelu agarozowym składanych nanorobotów

1. Preparat 0,5x TBE (45 mM Tris-Boran, 1 mM EDTA), 2% żelu agarozowego uzupełnionego 10 mM MgCl₂ (na podstawie Ernesto Castro i wsp.^{(art. 21}):
   1. Przygotować 0,5 x bufor TBE, rozcieńczając 6,25 ml 10 x bufor podstawowy TBE w 118,75 ml ddH₂O.
   2. Rozpuścić 2,5 g agarozy w 125 ml 0,5 x buforu TBE.
   3. Gotuj w kuchence mikrofalowej, aż agaroza całkowicie się rozpuści.
   4. Dodać 1,25 ml 1 M MgCl₂ do końcowego stężenia 10 mM.
   5. Dodać 7 μl 10 mg/ml bromku etydyny.
   6. Poczekaj, aż roztwór lekko ostygnie i napełnij tackę na żel, zanim żel agarozowy zastygnie. Natychmiast zainstaluj żądany grzebień.
   7. Przygotować 1 l 0,5 x TBE bufor bieżący, dodając 50 ml 10 x TBE buforu podstawowego i 10 ml 1 M MgCl₂ do 940 ml ddH₂O.
   8. Gdy żel stanie się twardy, dodaj bufor do pracy do urządzenia do elektroforezy i umieść urządzenie w łaźni lodowej.
2. Załadować do żelu 1 μg całkowitego DNA nanorobotów przed oczyszczaniem (etap 3.2) i po oczyszczeniu (etap 4.7), wraz z próbką DNA rusztowania i markerem DNA o wielkości 1 kb. Przykład przedstawiono na rysunku 2. Rzeczywiste objętości próbek zależą od stężeń uzyskanych po oczyszczeniu. Każda próbka jest ładowana buforem ładującym w stosunku objętości końcowej 1:6.
3. Ustaw źródło zasilania na 80 V i uruchom żel przez 3 godziny. Uruchom żel w kąpieli wypełnionej lodem i wodą. Nanoroboty rozłożą się i pojawią się jako rozmaz, jeśli żel agarozowy nagrzeje się podczas elektroforezy. Podczas elektroforezy dodaj dodatkowy lód, aby zapobiec nagrzewaniu się urządzenia.
4. Zobacz żel na stole UV (rysunek 2).

6. Ujemne zabarwienie nanorobota z mrówczanem uranu

1. Przygotowanie 2% roztworu podstawowego mrówczanu uranu (na podstawie Castro i wsp.^{(art. 23}):
   1. Odważyć 100 mg proszku mrówczanu uranu do probówki o pojemności 15 ml.
   2. Gotuj ultraczystą wodę wolną od DNaz/RNaz przez 3 minuty w celu odtlenienia.
   3. Dodać 5 ml odtlenionej gorącej wody (~60 °C) do 15 ml probówki zawierającej proszek mrówczanu uranu (z poprzedniego etapu). Szczelnie zamknij pokrywkę, zawiń w folię aluminiową i rygorystycznie wiruj przez 10 minut (przymocuj rurkę do wiru). Roztwór powinien wydawać się mętny z żółtym kolorem.
   4. Przefiltruj roztwór przez filtr strzykawkowy 0,2 μm. Rozwiązanie powinno stać się jasne.
   5. Podaniec 200 μl roztworu do probówek do mikrowirówek.
   6. Wirować z maksymalną prędkością przez 5 minut w wirówce stołowej w celu zebrania próbek na dnie probówki.
2. Załadunek próbki do siatki i barwienie ujemne:
   1. Rozmrozić 200 μl podwielokrotności 2% roztworu mrówczanu uranu (przygotowanego w sekcji 6.1). Dodać 10 μl 0,5 M roztworu NaOH i rygorystycznie wirować przez 3 minuty. Wirować z maksymalną prędkością przez 5 minut za pomocą wirówki stołowej.
   2. Tymczasem kratka jarzeniowo-wyładowcza wykorzystująca powietrze w pomieszczeniu o ciśnieniu 0,2 mbar i 25 mA przez 30 sek.
   3. Dodać 15 μl próbki nanorobota 2 nM po oczyszczeniu (sekcja 4.7) na górną część siatki (przytrzymywanej kleszczami) i pozostawić do wchłonięcia przez 1 minutę. Użyj bibuły filtracyjnej, aby odsączyć nadmiar cieczy, umieszczając siatkę na bibule filtracyjnej. Nie dotykaj powierzchni siatki.
   4. Dodać 10 μl 2% mrówczanu uranu (z kroku 6.2.1) na górną krawędź rusztu (przytrzymując kleszczami).
   5. Szybko użyj bibuły filtracyjnej, aby spuścić nadmiar cieczy, umieszczając siatkę na bibule filtracyjnej. Nie dotykaj powierzchni siatki.
   6. Powtórz kroki 6.2.4 i 6.2.5.
   7. Dodać 10 μl 2% mrówczanu uranu (z kroku 6.2.1) na górną krawędź rusztu (przytrzymując kleszczami). Pozostaw roztwór barwiący na wchłonięcie przez 30 sekund.
   8. Użyj bibuły filtracyjnej, aby spuścić nadmiar cieczy, umieszczając siatkę na bibule filtracyjnej. Nie dotykaj powierzchni siatki.
   9. Pozostaw siatkę do całkowitego wyschnięcia na co najmniej 30 minut, skierowaną stroną do góry na bibule filtracyjnej, przed wstrzyknięciem do TEM.

Wyniki

Reprezentatywne wyniki są pokazane na rysunku 2A. Wszystkie pasy zawierają 1 μg całkowitego DNA, mierzonego za pomocą spektrofotometru (OD₂₆₀). W porównaniu z okrągłym rusztowaniem jednoniciowym DNA (Lane 2), nanoroboty są utrudnione w żelu ze względu na ich wyższą masę cząsteczkową, będącą wynikiem hybrydyzacji zszywek z DNA rusztowania (Lane 3. Czerwona strzałka). Pasma o niskiej masie cząsteczkowej na pasie 3 reprezentuje nadmiar zszywek, które nie związały się z DNA rusztowania (zielona st...

Dyskusja

Opisaliśmy proces wytwarzania, oczyszczania i wizualizacji nanorobota DNA. Po wyprodukowaniu sześciokątnej ramy urządzenia, funkcja nanorobota jest programowana z prostym wprowadzeniem do robota określonych pasm ładunkowych i czujnikowych, które łatwo znajdują wyznaczoną pozycję dzięki komplementarności wiązań wodorowych z dostępnymi jednopasmowymi miejscami dokowania^14,15,22.

Opisany protokół produkcyjny wykorzystuje rampę do powolnego wyżarzania, która jest zwykle używana w naszym...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Woda destylowana wolna od DNaz/RNaz	Gibco	10977
M13mp18 rusztowanie ssDNA	NEB	N4040S
10x TAE	Gibco	15558-042
1 M MgCl2	Ambion	AM9530G
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra 0,5 ml 100K MWCO	Amicon	UFC510024
Agaroza	Bufor TBE Promega	V3125
	Promega	V4251
Bromek etydyny 10  mg/ml roztwór	Sigma Aldrich	E1510
1 kb marker DNA	NEB	N3232S
Barwnik ładujący	NEB	B7021S
mrówczan uranylu	polysciences	24762
siatki TEM powlekane węglem	Usługi naukowe	EFCF400-Cu-50
Termocykler c1000 Touch	Bio-Rad
Glow Discharge K100X	Stół UV Emitech
Żel Doc EZ Imager	Bio-Rad
NanoDrop 2000c	Thermo Scientific
TEM FEI-G12	Tecnai