Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Rejestrowanie potencjałów czynnościowych pojedynczych neuronów od swobodnie poruszających się gołębi na trzech etapach uczenia się

11.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51283

⸱

2 czerwca 2014

 ,  , 
1Faculty of Psychology, Department of Biopsychology, Ruhr-University Bochum

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Uczenie się nowych powiązań bodziec-reakcja angażuje szeroki zakres procesów neuronalnych, które ostatecznie znajdują odzwierciedlenie w zmianie wydajności skoków poszczególnych neuronów. Tutaj opisujemy protokół behawioralny pozwalający na ciągłą rejestrację aktywności pojedynczego neuronu, podczas gdy zwierzęta nabywają, wygaszają i ponownie nabywają warunkową reakcję w ciągu jednej sesji eksperymentalnej.

Streszczenie

Podczas gdy temat uczenia się wzbudził ogromne zainteresowanie zarówno wśród behawiorystów jak i neuronów, tylko stosunkowo niewielu badaczy zaobserwowało aktywność pojedynczego neuronu, gdy zwierzęta nabywają reakcję warunkową instrumentalnie lub gdy ta reakcja jest wygaszona. Ale nawet w tych przypadkach okresy obserwacji zwykle obejmują tylko jeden etap uczenia się, tj. przyswajanie lub wygaszanie, ale nie oba (wyjątki obejmują protokoły wykorzystujące uczenie odwrócone; patrz Bingman i wsp.1 dla przykładu). Jednak nabywanie i wymieranie pociągają za sobą różne mechanizmy uczenia się i dlatego oczekuje się, że będą im towarzyszyć różne typy i/lub loci plastyczności neuronalnej.

W związku z tym, opracowaliśmy paradygmat behawioralny, który wprowadza trzy etapy uczenia się w jednej sesji behawioralnej i który jest dobrze przystosowany do jednoczesnego rejestrowania potencjałów czynnościowych pojedynczych neuronów. Zwierzęta są szkolone w jednointerwałowym zadaniu wymuszonego wyboru, które wymaga mapowania każdej z dwóch możliwych reakcji wyboru na prezentację różnych nowych bodźców wizualnych (akwizycji). Po osiągnięciu wcześniej zdefiniowanego kryterium wydajności, jedna z dwóch odpowiedzi wyboru nie jest już wzmacniana (wygaśnięcie). Po pewnym spadku poziomu wydajności, prawidłowe reakcje są ponownie wzmacniane (reakcjonacja). Używając nowego zestawu bodźców w każdej sesji, zwierzęta mogą wielokrotnie przechodzić proces nabywania-wymierania-ponownego nabywania. Ponieważ wszystkie trzy etapy uczenia się zachodzą podczas jednej sesji behawioralnej, paradygmat ten jest idealny do jednoczesnej obserwacji gwałtownego wzrostu wydajności wielu pojedynczych neuronów. Używamy gołębi jako systemów modelowych, ale zadanie to można łatwo dostosować do każdego innego gatunku zdolnego do uczenia się warunkowej dyskryminacji.

Wprowadzenie

Uczenie się nowych powiązań bodziec-reakcja-wynik angażuje szeroki zakres procesów plastyczności neuronalnej. Procesy te są ostatecznie odzwierciedlone w zmieniającej się wydajności skoków poszczególnych neuronów. Prawdopodobnie jednym z najczęściej stosowanych paradygmatów uczenia się jest warunkowanie strachu Pawłowa prowadzone na gryzoniach. W tym otoczeniu nabycie i wygaśnięcie reakcji warunkowej odbywa się w ciągu kilkudziesięciu prób2. Szybki rozwój uwarunkowanego strachu może być korzystny, ponieważ pozwala na prowadzenie dużej liczby zwierząt w krótkim czasie. Również nabycie i wyginięcie można zaobserwować w ciągu kilkudziesięciu prób w ciągu jednego dnia u zwierząt naiwnych3,4 lub rozłożonych na 2 do 3 dni2,5-8. Jednak spostrzeżenia uzyskane na temat zmian aktywności neuronalnej podczas uczenia się w tych eksperymentach niekoniecznie mają zastosowanie poza domeną warunkowania strachu. Na przykład zachowanie ukierunkowane na cel, napędzane przez pozytywne wzmocnienie, jest bardziej adekwatnie modelowane przez instrumentalne, a nie Pawłowskie procedury warunkowania i może częściowo zależeć od różnych substratów neuronalnych9,10. Również warunkowanie strachu rozwija się tak szybko, że reakcje neuronalne na CS można zaobserwować tylko przez kilkadziesiąt prób, co nakłada poważne ograniczenia na analizę zmian aktywności neuronalnej podczas uczenia się.

Niestety, nabycie i wyginięcie reagującego instrumentanta trwa zwykle wiele dni. Jest to szkodliwe dla badań neurofizjologicznych, ponieważ niezwykle trudno jest rejestrować aktywność pojedynczych komórek przez więcej niż kilka godzin. Ze względu na duże podobieństwo przebiegów zewnątrzkomórkowo zarejestrowanych potencjałów czynnościowych, problematyczne jest twierdzenie, że skoki zarejestrowane jednego dnia są generowane z tej samej komórki, co skoki o podobnych przebiegach zarejestrowane w następnym11,12, szczególnie w obszarach o dużej gęstości komórek, takich jak hipokamp.

Aby rozwiązać te problemy, opracowaliśmy nowatorski paradygmat behawioralny, wykorzystujący 3 warunki uczenia się podczas jednej eksperymentalnej sesji jednego dnia. Wymaga to, aby zwierzę doświadczalne było gotowe do przeprowadzenia setek prób w różnych warunkach, przy cienkim harmonogramie wzmacniania. Gołębie pocztowe (Columbia livia forma domestica) są klasycznymi organizmami modelowymi w psychologii eksperymentalnej13-17. Ptaki te są w stanie dokonywać złożonych dyskryminacjiwzrokowych18, potrafią elastycznie dostosowywać zachowanie do zmieniających się sytuacji związanych ze wzmocnieniem19,20 i są wyjątkowo zapalonymi pracownikami, wykonując 1000 prób przy minimalnej ilości wzmocnienia. Te cechy sprawiają, że są one szczególnie odpowiednie do eksperymentów opisanych poniżej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Oświadczenie etyczne

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z niemieckimi wytycznymi dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt w nauce. Procedury zostały zatwierdzone przez krajową komisję etyki stanu Nordrhein-Westfalen w Niemczech.

Przegląd systemu

Komora testowa do warunkowania instrumentalnego

Komora operantowa (Rysunek 1) ma wymiary 34 cm x 34 cm x 50 cm. Trzy półprzezroczyste klawisze odpowiedzi (4 cm x 4 cm, umieszczone około 20 cm nad poziomem podłogi) są wpuszczone w tylną ścianę komory. Bodźce są wyświetlane na płaskim ekranie LCD zamontowanym za klawiszami odpowiedzi. Dwie żarówki o mocy 2 W znajdujące się w ścianach bocznych zapewniają słabe oświetlenie. Komora jest umieszczona w kabinie wygłuszającej w celu zamaskowania dźwięków zewnętrznych. Głośniki stale emitują biały szum. Pokarm (ziarno) jest dostarczany przez zasobnik na karmę znajdujący się poniżej środkowego klawisza. Sprzęt eksperymentalny jest sterowany za pomocą autorskiego kodu MATLAB21. Zwierzęta są stale monitorowane za pomocą kamery cyfrowej przymocowanej do przedniej ściany komory.

Mikroprzedmioty wykonane na zamówienie

Mikroprzesuwy zawierające 16 przewodów elektrod są budowane na zamówienie w naszym laboratorium; konstrukcja opiera się na pracach Bilkeya i współpracowników22,23, a czytelnika odsyłamy do tych artykułów w celu uzyskania szczegółowego opisu. Zmodyfikowaliśmy ich projekt, aby umożliwić zastosowanie większej liczby elektrod (16 zamiast 8; druty nikromowe 25 µm) i łączymy przewody elektrod za pomocą przewodzącego kleju srebrowego z gniazdem wzmacniacza przedwzmacniacza (headstage). Dodatkowo stosujemy pozłacanie końcówek elektrod w celu obniżenia impedancji i uzyskania lepszego stosunku sygnału do szumu (przyłożenie -3 V przez ~3 sec; impedancje powinny spaść do <100 kΩ).

Po zmontowaniu mikronapędu elektrody są przycinane do pożądanej długości, a ich końcówki są czyszczone w kąpieli ultradźwiękowej (Tergazyme w wodzie destylowanej) przez 20 min i płukane przez kolejne 20 min w wodzie destylowanej. Pozłacanie końcówek elektrod powinno odbyć się bezpośrednio przed implantacją. Do uziemienia stosujemy srebrną elektrodę kulistą umieszczoną nad boczną częścią móżdżku. Specyfikacja materiałów znajduje się w tabeli Materiały dołączonej do niniejszego artykułu.

Ważnym problemem podczas pracy ze zwierzętami poruszającymi się swobodnie są artefakty ruchowe. Stwierdziliśmy, że artefakty ruchowe w naszych układach wynikają głównie z a) wysokiej impedancji elektrod (>500 kΩ) oraz b) niedoskonałego połączenia styków między wtyczką (implantem) a gniazdem (modułem głowicowym) podczas ruchu zwierzęcia. Różnorodne dostępne komercyjnie mikrołącza nie zapewniają satysfakcjonujących rezultatów przy rejestracji z ptaków poruszających się swobodnie, ponieważ kontakt mechaniczny między wtyczką a gniazdem szybko ulega pogorszeniu wskutek gwałtownych ruchów gołębi (kołysanie głową, dziobanie). Najlepsze połączenie mechaniczne między implantem a modułem głowicowym uzyskano dzięki zestawom wtyczek głowicowych firmy Ginder Scientific. Zespoły wtyczka-gniazdo te posiadają 18 styków i są do siebie mocno przytwierdzone za pomocą nakrętki pierścieniowej.

Konfiguracja do rejestracji elektrofizjologicznej

Układ elektrofizjologiczny składa się z następujących elementów: 1) specjalnie zbudowanej przedwzmacniaczowej głowicy o wzmocnieniu jedności (wzmacniacz operacyjny), 2) 15 modułów wzmacniaczy różnicowych umieszczonych w dwóch jednostkach montowanych w szafie rack (odpowiednio DPA-2FS i EPMS-07; npi electronic GmbH, Niemcy), 3) 16-kanałowego przetwornika analogowo-cyfrowego (power 1401 mark I). Surowe sygnały są wzmacniane 1,000x i filtrowane pasmowo (500-5,000 Hz, filtr 1ego rzędu), digitalizowane z częstotliwością próbkowania 16-20 kHz i zapisywane za pomocą oprogramowania Spike2 wersja 7.06a do późniejszej obróbki offline. Czasy zdarzeń (takie jak początek bodźca lub poszczególne dziobania klawisza przez zwierzę) są rejestrowane za pomocą zbudowanego w laboratorium pudełka wejścia/wyjścia portu równoległego (patrz Rose et al.21) i przekazywane do przetwornika AD w celu zapisania wraz z danymi neurofizjologicznymi (patrz Rysunek 1). Obróbka offline została opisana szczegółowo poniżej.

Schemat układu akwizycji danych behawioralnych i neuronalnych; obejmuje kontrolę behawioralną, moduł IO oraz przetwornik ADC.
Rysunek 1. Przegląd systemu. Przepływ informacji został zaznaczony kolorowymi strzałkami. Komputer 1 kontroluje sprzęt odpowiedzialny za wyjścia behawioralne (wyświetlanie bodźców za pomocą płaskiego monitora, światło pokojowe, dozownik pokarmu, światło dozownika, klawisze reakcji) i przesyła znaczniki czasowe zdarzeń do przetwornika A/D. Komputer 2 przechowuje sygnały neurofizjologiczne otrzymane z przetwornika A/D oraz znaczniki czasowe zdarzeń otrzymane z Komputera 1. Fotografia po lewej stronie przedstawia komorę warunkującą wewnątrz wyciszonej kabiny. Jej elementy to: 1) obudowa wyciszająca, 2-4) klawisze reakcji, 5) dozownik pokarmu, 6) światło dozownika, 7) światło pokojowe, 8) kamera obserwacyjna.

Zadanie dyskryminacyjne oparte na wymuszonym wyborze w jednym przedziale (SIFC)

Dla przejrzystości opiszemy tutaj końcowe zadanie SIFC, a poniżej wyjaśnimy kroki niezbędne do przeszkolenia zwierząt w tym zadaniu.

Zadanie SIFC przedstawiono na ryc. 2. Po upływie odstępu między próbami (ITI) klawisz centralny jest podświetlony na zielono przez maksymalnie 5 s („faza inicjalizacji”). Natychmiast po trzeciej reakcji zwierzęcia w ciągu 5 s, na klawiszu centralnym przez 2 s prezentowany jest jeden z kilku bodźców próbnych („faza próbna”; przykładowe bodźce pokazano na wstawce do ryc. 2). Po 2 s klawisz centralny jest ponownie podświetlony na zielono i zwierzę musi zareagować raz jeszcze, zanim podświetlone zostaną dwa klawisze boczne („faza potwierdzenia”). W zależności od rodzaju bodźca wyświetlonego w fazie próbnej, zwierzę musi skierować pojedynczą reakcję do klawisza lewego lub prawego („faza wyboru”). Jeśli wybierze prawidłowy kierunek, dostęp do nagrody (ziarna) jest przyznany na 2 s. Zatem rdzeń zadania polega na reakcji lewym klawiszem wyboru po prezentacji jednego konkretnego bodźca na klawiszu centralnym oraz reakcji prawym klawiszem wyboru po prezentacji innego bodźca. Powodem, dla którego faza próbna jest obramowana fazą inicjalizacji i potwierdzenia, jest utrzymanie głowy zwierzęcia przed klawiszem centralnym podczas prezentacji bodźca próbnego.

Gdy zwierzę opanuje to zadanie dla jednej pary bodźców (zwanych dalej bodźcami „znanymi”, FS), w każdej nowej sesji prezentowana jest mu nowa para bodźców (NS), a zwierzę musi nauczyć się, który z dwóch nowych bodźców wymaga reakcji poprzez naciśnięcie lewego lub prawego klawisza wyboru. Para FS jest nadal prezentowana podczas tych eksperymentów, aby służyć jako odpowiednia warunkiem kontrolna. Właściwe wykonanie zadania końcowego zależy w kluczowej mierze od gotowości zwierząt do przeprowadzenia >1 000 prób przy ogólnym prawdopodobieństwie wzmocnienia <0,5. W poniższych akapitach opisano procedurę treningową, w której stopień złożoności zadania jest stopniowo zwiększany, aż zwierzę osiągnie poziom SIFC; jednocześnie prawdopodobieństwo wzmocnienia oraz liczba prób na sesję muszą zostać zwiększone, aby zapewnić konsekwentnie wysoką sprawność w zadaniu końcowym.

1. Trenowanie zwierząt

  1. Ograniczenie pokarmu
    1. Zważ zwierzęta po co najmniej dwóch tygodniach swobodnego dostępu do pokarmu. Przyjmij tę wagę jako masę przy swobodnym karmieniu. Ogranicz dostęp do pokarmu przez kolejne 1-2 tygodnie, aż zwierzęta osiągną 85% swojej masy przy swobodnym karmieniu.
    2. Kluczowe jest, aby gołębie zachowały zdrowy wygląd fizyczny i normalną aktywność przez cały czas trwania eksperymentu. W tym celu uważnie monitoruj wygląd i wagę zwierząt przez cały okres treningu behawioralnego i testów. Zważ zwierzęta przed i po każdej sesji eksperymentalnej, aby ocenić dobowe spożycie pokarmu. W razie potrzeby dostarcz dodatkowy pokarm, aby zapobiec dalszemu spadkowi masy ciała. Zapewnij nieograniczony dostęp do pokarmu w weekendy.
  2. Autokształtowanie
    Autokształtowanie służy do habituacji zwierzęcia do komory eksperymentalnej oraz wypracowania reakcji warunkowej.
    1. Zaprezentuj 5-sekundowy bodziec wizualny (dalej nazywany bodźcem inicjującym, IS) na klawiszu środkowym. Natychmiast po zakończeniu IS lub po pojedynczym dziobnięciu klawisza reakcji (zależnie od tego, co nastąpi pierwsze), wyłącz podświetlenie klawisza i podaj nagrodę pokarmową (2-sekundowa aktywacja podajnika pokarmu).
    2. Utrzymuj ITI znacznie dłużej niż czas prezentacji próbki, aby ułatwić uczenie się24. Użyj wartości 120 sec dla ITI i przeprowadź 40 prób dziennie. Później ponownie wykorzystaj IS jako bodziec inicjujący, potwierdzający i wyboru w zadaniu końcowym (patrz Rysunek 2). Ta faza treningu zajmie zwierzętom około jednego tygodnia.
    3. Gdy zwierzę będzie reagować niezawodnie (w >85% prób), stopniowo zmniejszaj ITI do 10 sec oraz czas prezentacji próbki do 2 sec. Jednocześnie zwiększ liczbę reakcji wymaganych do wzmocnienia do 3 (stały stosunek 3, FR 3). Dodatkowo zwiększ całkowitą liczbę prób na dzień. Dobierz parametry tak, aby zwierzę było trenowane każdego dnia przez około 1 hr. Ta faza treningu potrwa mniej więcej 2 tygodnie.
    4. Powtórz kroki 1.2.1 – 1.2.3 dla lewego i prawego klawisza reakcji, aż osobniki będą niezawodnie reagować na IS na wszystkich 3 klawiszach. Przeplataj próby z aktywacją lewego, prawego i środkowego klawisza w sposób losowy.
    5. Teraz zaprezentuj najpierw IS na środku, a następnie, pod warunkiem wystąpienia reakcji, na jednym z klawiszy bocznych (pomiń wzmocnienie za reakcję na klawisz środkowy). Losowo zmieniaj aktywowane klawisze boczne z próby na próbę. Prerywaj próby, w których osobnik nie zareaguje na klawisz środkowy po 5 sec. Powtarzaj do momentu, aż zwierzę będzie wykonywać zadanie niezawodnie (~3 dni).
    6. Wprowadź 2 nowe bodźce, które w zadaniu końcowym będą służyć jako FS (przykłady znajdują się na wstawce na Rysunku 2). Powtórz kroki 1.2.1 – 1.2.3 z tymi bodźcami. Reakcja zostanie wypracowana szybciej niż w przypadku pierwszego bodźca, zazwyczaj w ciągu 4 dni.

Schemat sekwencyjny eksperymentu dla czasu reakcji na bodziec, obejmujący fazy przygotowawcze i szczegóły czasu trwania.
Rysunek 2. Ilustracja paradygmatu behawioralnego.Po ITI trwającym 5 sec, klawisz centralny jest podświetlony na zielono przez maksymalnie 5 sec (inicjalizacja). Jeśli zwierzę zareaguje 3x w ciągu tych 5 sec, jeden z 4 bodźców próbnych zostaje zaprezentowany w tej samej pozycji. Po stałym czasie prezentacji próbki wynoszącym 2 sec, podczas którego zwierzę musi zareagować przynajmniej raz, centralny klawisz dziobania jest ponownie podświetlony na zielono (potwierdzenie). Po kolejnym dziobnięciu, 2 klawisze boczne są podświetlone na zielono. Podmiot wskazuje swój wybór, reagując raz na jeden z klawiszy bocznych. Podczas nabywania i ponownego nabywania, po poprawnych odpowiedziach następuje 2 sec dostępu do pożywienia wraz z aktywacją światła karmidła lub sama aktywacja światła karmidła. W przypadku odpowiedzi błędnej, światła w pomieszczeniu są wyłączane na 3 sec. Podczas wygaszania, zarówno poprawne, jak i błędne odpowiedzi na bodziec wygaszający pozostają bez konsekwencji. Wstawka przedstawia przykład par bodźców nowych i znanych.

  1. Trening zadania wymuszonego wyboru z jednym interwałem (SIFC) dla bodźców znanych
    1. Ustal pełną sekwencję inicjacji, próbki, potwierdzenia i wyboru: w każdej próbie prezentuj najpierw IS (FR 3), następnie jeden z dwóch FS (stały czas trwania 2 sec), a potem ponownie IS (FR 1). Zastosuj schemat wyboru z podpowiedzią: w każdej próbie podświetlaj tylko ten klawisz wyboru, który jest prawidłowy dla danego FS. Ta faza treningu powinna trwać około 1 tygodnia.
    2. Gdy obiekt wykazuje stabilne wyniki (>85% reakcji na odpowiedni klawisz boczny), wprowadź próby wolnego wyboru (oba klawisze boczne podświetlone podczas fazy wyboru). Jeśli zwierzę reaguje na prawidłową stronę, zapewnij dostęp do pokarmu przez 2 sec. Nieprawidłowe reakcje są następowane karą w postaci przerwy czasowej (zgaszenie świateł w pomieszczeniu na 2 sec). Jeśli w ciągu 3 sec nie zostanie udzielona żadna odpowiedź, zakończ próbę i zrestartuj ITI. Zwierzęta zazwyczaj opanowują te podelementy zadania w ciągu 2 tygodni.
    3. Stopniowo zwiększaj odsetek prób wolnego wyboru podczas kolejnych sesji z 20% do 100%.
    4. Jeśli obiekt osiąga >90% poprawnych odpowiedzi w próbach wolnego wyboru, zmniejsz prawdopodobieństwo nagrody za poprawne reakcje do 0,5, jednocześnie zwiększając liczbę prób na sesję do 1 000. Nie zmieniaj parametrów codziennie/w każdej sesji, lecz dobieraj je elastycznie w zależności od poziomu wyników obiektu w zakresie pominięć inicjacji oraz procentu poprawnych odpowiedzi. Ta faza treningu będzie trwać około 4 tygodni.
    5. Gołębie mają tendencję do odmawiania reakcji na nieznane bodźce. Dlatego, gdy zwierzę stabilnie wykona >1 000 prób, przeprowadź kształtowanie reakcji (autoshape) na duży zestaw bodźców wizualnych (patrz Sekcja 1.2). Jednak nie eksponuj wcześniej bodźców wizualnych przeznaczonych do późniejszego wykorzystania jako bodźce nowe w końcowym paradygmacie, a jedynie jednolitych wyświetlaczy kolorystycznych.
  2. Końcowe zadanie wymuszonego wyboru z jednym interwałem z bodźcami nowymi w różnych warunkach wzmocnienia
    1. Rozgrzewka
      Pozwól obiektowi wykonać 50 prób z samym FS. Ustaw prawdopodobieństwo nagrody dla tych bodźców na <1 (np. 0,5–0,8) podczas wszystkich faz, aby zapobiec przedwczesnemu nasyceniu, a tym samym brakowi motywacji do reakcji.
    2. Etap nabywania
      Losowo przeplataj próby z prezentacją FS i NS. Przypisz różne klawisze reakcji jako poprawne dla dwóch NS i wzmacniaj każdą poprawną reakcję. Obliczaj procent poprawnych odpowiedzi jako średnią kroczącą z ostatnich 120 prób. Nabywanie uznaje się za zakończone, gdy wyniki dla każdego z NS przekroczą 85%, ale nie wcześniej niż po wykonaniu minimum 150 prób.
    3. Etap wygaszania
      Zaprzestań wzmacniania poprawnych i karania niepoprawnych reakcji na losowy NS (bodziec wygaszania). Rozpocznij fazę ponownego nabywania, gdy poprawność reakcji na bodziec wygaszania spadnie poniżej 60% i zwierzę przejdzie łącznie co najmniej 150 prób w tej fazie.
    4. Etap ponownego nabywania
      Ponownie wzmacniaj poprawne i karaj niepoprawne reakcje na bodziec wygaszania, analogicznie jak podczas etapu nabywania. Zakończ sesję, gdy wyniki dla tego bodźca przekroczą 85%, a zwierzęta wykonają łącznie co najmniej 150 prób w tej fazie.

2. Elektrofizjologia

  1. Implantacja elektrod
    Operacja implantacji odbywa się po tym, jak zwierzęta wielokrotnie (3-4x) ukończyły cały cykl nabywania-wygaszania-ponownego nabywania reakcji, a szczegółowy opis procedury znajduje się w innym źródle25.
    1. Umieścić 5-6 mikowkrętów ze stali nierdzewnej w czaszce w celu zakotwiczenia uchwytu głowowego z cementu dentystycznego wraz z mikronapędem.
    2. Wykonać kraniotomię bezpośrednio nad interesującym obszarem mózgu, następnie ostrożnie rozciąć oponę twardą i opuścić elektrody do pożądanej pozycji.
    3. Przed zakotwiczeniem mikronapędu do uchwytu głowowego, nałożyć wazelinę wokół kaniuli prowadzącej; zapobiegnie to otoczeniu rurki prowadzącej przez cement dentystyczny.
    4. Jako elektrodę uziemiającą zastosować izolowaną elektrodę z srebrnej kulki umieszczoną pod czaszką nad móżdżkiem.
    5. Podawać zwierzętom leki przeciwbólowe (Carprofen, 10 mg/kg, wstrzykiwane dwa razy dziennie) przez trzy dni po operacji. Pozostawić zwierzęta w celu rekonwalescencji na co najmniej 2 tygodnie.
  2. Rejestracja sygnałów podczas wykonywania zadania przez zwierzęta
    1. W każdej sesji należy użyć nowej pary bodźców nowatorskich i przesunąć elektrody o co najmniej 125 µm (pół obrotu śruby napędowej) przed rozpoczęciem. Jeśli nie zaobserwowano potencjałów czynnościowych o wystarczającym stosunku sygnału do szumu, należy przerwać sesję, umieścić zwierzę w klatce domowej i spróbować ponownie następnego dnia.
    2. Ułożyć kabel głowicy w taki sposób, aby nie zakłócał on naturalnego zachowania ptaków podczas dziobania i żerowania. Można to osiągnąć poprzez przymocowanie kabla kilkoma elastycznymi paskami do górnej części komory warunkowania i przyzwyczajenie ptaków do przymocowanego kabla przez kilka godzin.
    3. Jeśli jest dostępny, należy użyć komutatora, aby zapewnić ptakom większą swobodę ruchu.
  3. Analiza sygnałów offline
    1. Wszystkie kanały przefiltrować pasmowo od 500 do 5 000 Hz z ostrym spadkiem charakterystyki offline w programie Spike2. Wyodrębnić kolce (spikes) przy użyciu progów amplitudy i posortować je ręcznie, wykorzystując analizę głównych składowych.
    2. Wyniki sortowania sprawdzić za pomocą napisanego specjalnie kodu MATLAB (dostępnego w MATLAB Central File Exchange, File ID #37339). Dobrze odizolowana pojedyncza jednostka (Rysunek 3) powinna spełniać wszystkie poniższe kryteria: a) wyraźnie oddzielony klaster w przestrzeni głównych składowych, b) brak oznak wielu jednostek przy nałożeniu i wyrysowaniu wszystkich zarejestrowanych przebiegów w formie mapy ciepła (Rysunek 3A), c) symetrycznie rozłożone amplitudy szczytowe przebiegów (Rysunek 3B), d) stabilna rejestracja podczas całej sesji, o czym świadczy niezmienna amplituda kolców (Rysunek 3C), e) brak lub bardzo niewielka liczba zdarzeń kolców występujących w okresie refrakcji poprzedniego kolca (Rysunek 3D) oraz stosunek sygnału do szumu (SNR) wynoszący co najmniej 2 (SNR definiuje się tutaj jako różnicę między minimum a maksimum uśrednionego przebiegu kolca, podzieloną przez przyciętą szerokość pasma szumu (2,5th i 97,5th percentyle rozkładu wartości z pierwszego koszyka wszystkich przebiegów)). SNR jednostki pokazanej na Rysunku 3 wynosi 3,9.
    3. Przejrzeć surowe kanały offline w poszukiwaniu artefaktów związanych z ruchem. Odrzucić kanały w razie potrzeby.
    4. Artefakty elektryczne występujące podczas kluczowego dziobania mogą w rzadkich przypadkach zostać pomylone z właściwymi przebiegami kolców. Przetestować rejestrację pod kątem zanieczyszczeń, badając histogram czasu liczby kolców w stosunku do każdego zarejestrowanego kluczowego dziobania (peri-peck time histogram, PPTH, Rysunek 3E). Artefakty wywołane dziobaniem objawiają się jako szczyt w histogramie blisko (±50 msec) czasu 0. W ramach dodatkowej kontroli należy oddzielnie wyrysować przebiegi wszystkich domniemanych zdarzeń kolców zarejestrowanych w przedziale ±20 msec od kluczowego dziobania i porównać je z przebiegami kolców wykrytymi poza tym oknem (Rysunek 3F).

Analiza sygnałów neuronalnych; częstotliwość wyładowań, amplituda; wykresy przedstawiające zmienność danych w czasie, częstotliwość.
Rycina 3. Metryki jakości izolacji jednostek. A) Mapa ciepła wartości czas-napięcie wszystkich przebiegów impulsów. B) Rozkłady maksymalnych (czerwony), minimalnych (zielony) i szumowych (niebieski) wartości napięcia wszystkich przebiegów impulsów. Rozkłady są wyraźnie oddzielone, co wskazuje na doskonałą izolację jednostek. C) Spontaniczna częstotliwość wyładowań (czerwona, obliczona z 2-sekundowych segmentów we wszystkich odstępach między próbami) oraz amplitudy impulsów (od szczytu do szczytu) jako funkcja czasu trwania sesji. Obie krzywe zostały wygładzone za pomocą funkcji prostokątnej (szerokość: 50 punktów danych). D) Rozkład odstępów między impulsami (ISI) dla tej jednostki. Szerokość koszyka: 10 msec (wstawka: 1 msec). Bardzo krótkie odstępy są niemal nieobecne (<0,1% odstępów poniżej 4 msec). E) PSTH wyzwalany uderzeniami w klawisz. Liczba zdarzeń blisko uderzenia w klawisz (±20 msec) jest zaznaczona na czerwono. F) Wszystkie 157 przebiegów impulsów zarejestrowane w przedziale ±20 msec od zdarzeń uderzenia w klawisz. Przebiegi te są zgodne z ogólnym kształtem przebiegu pokazanym na panelu A.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zachowanie

Rysunek 4A przedstawia wyniki behawioralne zwierzęcia w jednej przykładowej sesji. Poziom wykonania zadania przez zwierzę osiąga kryterium dla NS 2 w ciągu 180 prób (45 prezentacji bodźca) i wynosi blisko 100% dla NS 1 od samego początku. Taka strategia – najpierw odpowiadanie tym samym klawiszem na oba nowe bodźce, a następnie dostosowanie odpowiedzi dla jednego z bodźców – jest obserwowana niemal tak często, jak początkowe losowe odpowiadanie na oba NS. W tej sesji l...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje złożone zadanie behawioralne odpowiednie dla jednoczesnych nagrań pojedynczej jednostki. Opisaliśmy zadanie SIFC dla gołębi, ale można je łatwo dostosować do gryzoni, wymagając szturchania nosem lub naciskania dźwigni zamiast dziobania i zastępując wzrokowe bodźcami węchowymi, słuchowymi lub dotykowymi.

Być może najbardziej krytycznymi krokami podczas procedury treningowej są: 1) stopniowe zmniejszanie prawdopodobieństwa nagrody i 2) zwiększanie liczby prób. Jeśli chodzi o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez granty Niemieckiej Fundacji Badawczej (DFG) dla MCS (FOR 1581, STU 544/1-1) i OG (FOR 1581, SFB 874). Strona internetowa DFG znajduje się pod adresem http://www.dfg.de/en/index.jsp. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu. Autorzy dziękują Thomasowi Seidenbecherowi za dostarczenie nam protokołu pozłacania, a także Tobiasowi Otto za pomoc w ustawieniu elektrofizjologicznego sprzętu rejestrującego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Drut oporowy (do stosowania jako elektrody)California Fine Wire, Grover Beach, CA, USAStablohm 675; druty nichromowe powlekane formvarem (średnica zewnętrzna 25 i mikro; m)
MikrozłączaGinder Scientific, Nepean, Ontario, KanadaGS18PLG-220 (wtyczka) & GS18SKT-220 (gniazdo do budowy sceny czołowej)
KaniuleHenke Sass Wolf, Tuttlingen, Niemcy0,4 x 20 mm / 27 Gx3/4"
Złoty roztwór do powlekaniaNeuralynx, Bozeman, MT, USASIFCO Process Gold Non-Cyanide, Code 5355
Roztwór do kąpieli ultradźwiękowejAlconox, Inc., Nowy Jork, USA1304Tergazyme
Klej przewodzącyHenkel LoctiteLOCTITE 3888 Wypełnione srebrem, przewodzące, adhezyjne
ze stali nierdzewnejJ.I. Morris, Southbridge, MA, USAF0CE125 miniaturowe wkręty samogwintujące, długość korpusu 1/8 cala
Światłoutwardzalny cement dentystycznyvan der Ven Dental, Duisburg, NiemcyOmniceram Evo Flow A2
Unit światłoutwardzalnyvan der Ven Dental, Duisburg, NiemcyJovident Excelled 215 Curing Light (bezprzewodowa jednostka utwardzania światłem LED)
Wzmacniacze filtrównpi electronic GmbH, NiemcyDPA-2FS
Przetwornik A/DCambridge Electronic Design, Cambridge, Wielka BrytaniaPower 1401
Oprogramowanie Spike2Cambridge Electronic Design, Cambridge, Wielka BrytaniaWersja 7.06a
MATLABThe Mathworks, Natick, MA, USAR2012a

Bibliografia

  1. Bingman, V. P., Gasser, B. A., Colombo, M. Responses of pigeon (Columba livia) wulst neurons during acquisition and reversal of a visual discrimination task. Behav Neurosci. 122, 1139-1147 (2008).
  2. Herry, C., Ciocchi, S., Senn, V., Demmou, L., Müller, C., Lüthi, A. Switching on and off fear by distinct neuronal circuits. Nature. 454, 600-606 (2008).
  3. Quirk, G. J., Repa, C., LeDoux, J. E. Fear conditioning enhances short-latency auditory responses of lateral amygdala neurons: parallel recordings in the freely behaving rat. Neuron. 15, 1029-1039 (1995).
  4. Quirk, G. J., Armony, J. L., Ledoux, J. E. Components of Tone-Evoked Spike Trains in Auditory Cortex and Lateral Amygdala. Neuron. 19, 613-624 (1997).
  5. Maren, S. Auditory fear conditioning increases CS-elicited spike firing in lateral amygdala neurons even after extensive overtraining. Eur J Neurosci. 12, 4047-4054 (2000).
  6. Milad, M. R., Quirk, G. J. Neurons in medial prefrontal cortex signal memory for fear extinction. Nature. 420, 713-717 (2002).
  7. Hobin, J. A., Goosens, K. A., Maren, S. Context-dependent neuronal activity in the lateral amygdala represents fear memories after extinction. J Neurosci. 23, 8410-8416 (2003).
  8. Maren, S., Hobin, J. A. Hippocampal regulation of context-dependent neuronal activity in the lateral amygdala. Learn Mem. 14, 318-324 (2007).
  9. Knapska, E., et al. Differential involvement of the central amygdala in appetitive versus aversive learning. Learn Mem. 13, 192-200 (2006).
  10. Harloe, J. P., Thorpe, A. J., Lichtman, A. H. Differential endocannabinoid regulation of extinction in appetitive and aversive Barnes maze tasks. Learn Mem. 15, 806-809 (2008).
  11. Gray, C. M., Maldonado, P. E., Wilson, M., McNaughton, B. Tetrodes markedly improve the reliability and yield of multiple single-unit isolation from multi-unit recordings in cat striate cortex. J Neurosci Methods. 63, 43-54 (1995).
  12. Lewicki, M. S. A review of methods for spike sorting: the detection and classification of neural action potentials. Network. 9, (1998).
  13. Skinner, B. F. 34;Superstition" in the pigeon. J Exp Psychol. 121, 273-274 (1948).
  14. Herrnstein, R. J. Relative and absolute strength of response as a function of frequency of reinforcement. J Exp Anal Behav. 4, 267-272 (1961).
  15. Brown, P. L., Jenkins, H. M. Auto-shaping of the pigeon's key-peck. J Exp Anal Behav. 11, 1-8 (1968).
  16. Epstein, R., Kirshnit, C. E., Lanza, R. P., Rubin, L. C. 34;Insight" in the pigeon: antecedents and determinants of an intelligent performance. Nature. 308, 61-62 (1984).
  17. Mazur, J. E. Varying initial-link and terminal-link durations in concurrent-chains schedules: a comparison of three models. Behav Processes. 66, 189-200 (2004).
  18. Herrnstein, R. J., Loveland, D. H. Complex visual concept in the pigeon. Science. 146, 549-551 (1964).
  19. Stüttgen, M. C., Yildiz, A., Güntürkün, O. Adaptive criterion setting in perceptual decision making. J Exp Anal Behav. 96, 155-176 (2011).
  20. Stüttgen, M. C., Kasties, N., Lengersdorf, D., Starosta, S., Güntürkün, O., Jäkel, F. Suboptimal criterion setting in a perceptual choice task with asymmetric reinforcement. Behav Processes. 96, 59-70 (2013).
  21. Rose, J., Otto, T., Dittrich, L. The Biopsychology-Toolbox: a free, open-source Matlab-toolbox for the control of behavioral experiments. J Neurosci Methods. 175, (2008).
  22. Bilkey, D. K., Muir, G. M. A low cost, high precision subminiature microdrive for extracellular unit recording in behaving animals. J Neurosci Methods. 92, 87-90 (1999).
  23. Bilkey, D. K., Russell, N., Colombo, M. A lightweight microdrive for single-unit recording in freely moving rats and pigeons. Methods. 30, 152-158 (2003).
  24. Gallistel, C. R., Gibbon, J. Time, rate, and conditioning. Psychol Rev. 107, 289-344 (1993).
  25. Starosta, S., Güntürkün, O., Stüttgen, M. C. Stimulus-response-outcome coding in the pigeon nidopallium caudolaterale. PLoS One. 8, (2013).
  26. McNaughton, B. L., O'Keefe, J., Barnes, C. A. The stereotrode: a new technique for simultaneous isolation of several single units in the central nervous system from multiple unit records. J Neurosci Methods. 8, 391-397 (1983).
  27. Hill, D. N., Mehta, S. B., Kleinfeld, D. Quality metrics to accompany spike sorting of extracellular signals. J Neurosci. 31, 8699-8705 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rejestracja pojedynczych neuron wuczenie si go bizadanie dyskryminacji wizualnejnabywanie wygaszanie ponowne nabywanieelektrofizjologiasortowanie impuls wanaliza g wnych sk adowychparadygmat behawioralnyplastyczno neuronalna
Rejestrowanie potencjałów czynnościowych pojedynczych neuronów od swobodnie poruszających się gołębi na trzech etapach uczenia się
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.