Diagnostyczne obrazowanie ultrasonograficzne okazało się skuteczne w diagnozowaniu różnych chorób układu oddechowego u ludzi i zwierząt. Demonstrujemy kompleksowy protokół ultrasonograficzny wykorzystywany przez laboratorium dr Zuo do analizy kinetyki membrany, szczególnie w modelach mysich. Jest to również nieinwazyjna technika badawcza, która może dostarczyć ilościowych informacji na temat funkcji mięśni oddechowych myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Diagnostyczne obrazowanie ultrasonograficzne funkcji membrany myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Analiza funkcji mięśni szkieletowych układu oddechowego gryzoni, szczególnie przepony, jest zwykle wykonywana poprzez izolowanie pasków mięśniowych za pomocą inwazyjnych procedur chirurgicznych. Chociaż jest to skuteczna metoda oceny aktywności przepony in vitro, wiąże się z operacją nieprzeżytkową. Zastosowanie nieinwazyjnego obrazowania ultrasonograficznego jako procedury in vivo jest korzystne, ponieważ nie tylko zmniejsza liczbę uśmiercanych zwierząt, ale nadaje się również do monitorowania postępu choroby u żywych myszy. W związku z tym nasza metoda obrazowania ultrasonograficznego może prawdopodobnie pomóc w opracowaniu nowych terapii, które łagodzą uszkodzenia mięśni wywołane różnymi chorobami układu oddechowego. W szczególności w diagnostyce klinicznej obturacyjnych chorób płuc obrazowanie ultrasonograficzne może być stosowane w połączeniu z innymi standardowymi testami w celu wykrycia wczesnego początku zmęczenia mięśni przepony. W obecnym protokole opisujemy, jak dokładnie ocenić kurczliwość przepony w modelu mysim za pomocą techniki diagnostycznego obrazowania ultrasonograficznego.
Wprowadzenie
Ostatnio, techniki diagnostycznego obrazowania ultradźwiękowego zostały zastosowane do mysich modeli nadciśnienia naczyniowego i raka trzustki1,2. Jednak techniki te nie były szeroko stosowane w testach funkcji mięśni oddechowych gryzoni. W związku z tym opracowaliśmy diagnostyczną metodę obrazowania ultrasonograficznego jako cenne narzędzie do podłużnej oceny ruchomości przepony in vivo u myszy.
Istnieje kilka zalet obrazowania ultrasonograficznego. Na przykład jest nieinwazyjny, bezpieczny, przenośny i pozwala na pomiary w czasie rzeczywistym przy stosunkowo niskich kosztach3. W szczególności niektóre urządzenia ultrasonograficzne o niskiej częstotliwości były w stanie wykryć uwięzienie powietrza, kliniczną cechę przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (POChP) z łagodnym lub ciężkim ograniczeniem przepływu powietrza4. W związku z tym diagnostyczne obrazowanie ultrasonograficzne może służyć jako łatwo dostępna i powtarzalna metoda przesiewowa do monitorowania zaburzeń oddychania w czasie rzeczywistym.
Techniki diagnostycznego obrazowania ultrasonograficznego są często stosowane u większych zwierząt lub ludzi. Jednak przeprowadzono ograniczoną liczbę badań obrazowania ultrasonograficznego na modelach mysich, co prawdopodobnie wynika z wyzwań związanych z wykonywaniem ultradźwięków na małych obiektach. Obecny protokół przedstawia nowatorską procedurę pomiaru funkcji membrany u myszy. Ponadto, chociaż przeprowadzono kilka badań na gryzoniach dotyczących funkcji przepony, większość wyników uzyskano poprzez wyizolowanie pasków mięśniowych bezpośrednio od zwierzęcia poddanego eutanazji5-7. Z kolei zastosowanie metody diagnostycznego obrazowania ultrasonograficznego in vivo do analizy aktywności przepony zmniejszyłoby liczbę zwierząt uśmiercanych w celach doświadczalnych. Co więcej, długoterminowe leczenie skoncentrowane na zwiększeniu kurczliwości przepony można dokładnie ocenić za pomocą ultradźwięków w modelach gryzoni bez poświęcania zwierząt.
W naszym laboratorium opracowaliśmy skuteczną metodę wizualizacji i analizy aktywności przepony myszy za pomocą ultrasonografu, która pomaga zrozumieć funkcję membrany in vivo, unika metod inwazyjnych dla zwierząt i pomaga w rozwoju terapii dysfunkcji oddechowych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone i zakończone zgodnie z przepisami i wytycznymi Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Stanowego Ohio (IACUC).
1. Znieczulenie myszy
- Ustaw czysty stół zabiegowy z podgrzewaną podkładką izotermiczną owiniętą ręcznikiem chirurgicznym. Poduszka grzewcza powinna być utrzymywana w temperaturze od 30 °C do 34 °C, aby ustabilizować temperaturę ciała zwierzęcia przy jednoczesnym zmniejszeniu potencjalnego stresu zwierzęcia.
- Umieść mysz w komorze indukcyjnej znieczulenia o następujących parametrach: przepływ tlenu ustawiony na 1,5 l/min i parownik izofluranowy ustawiony na 3,5%. Całkowita sedacja powinna nastąpić w ciągu 1-2 minut. Jeśli komora indukcyjna nie jest dostępna, można użyć słoika dzwonowego z siatką drucianą umieszczoną na dnie, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu zwierząt z izofluranem.
- Natychmiast wyjmij mysz z komory indukcyjnej, gdy zostanie całkowicie znieczulona (osiągane, gdy mysz traci dobrowolną funkcję motoryczną). Przyłóż stożek do nosa zwierzęcia w celu utrzymania znieczulenia. Natężenie przepływu tlenu powinno być zmniejszone do około 0,5 l/min, a parownik izofluranu powinien być ustawiony w zakresie od 1,5 do 2,5%.
- Nałóż niewielką ilość maści okulistycznej bezpośrednio na rogówkę, aby zmniejszyć suchość oczu8. Ponadto podczas znieczulenia mysz powinna utrzymywać brak odruchu wycofania pedału, błony śluzowe powinny pozostać koloru różowego, a oddech powinien wydawać się stabilny.
2. Przygotowanie do procedury diagnostycznego obrazowania ultrasonograficznego
- Przytrzymaj każdą nogę myszy na podgrzewanym stole zabiegowym za pomocą usuwalnego kleju, takiego jak taśma chirurgiczna.
- Za pomocą elektrycznej maszynki do golenia usuń włosy z brzusznej powierzchni ciała między brzuchem a połową klatki piersiowej. Nałóż krem do depilacji, aby dodatkowo usunąć pozostałe włosy, które nie zostały przycięte maszynką do golenia. Po 2-3 minutach zetrzyj krem wilgotnym gazikiem.
- Usuń nadmiar włosów za pomocą gaziku zwilżonego wodą i oczyść ogolony obszar 70% alkoholem lub równoważnym środkiem antyseptycznym. Sonda ultradźwiękowa zostanie zastosowana w tym obszarze, aby uwidocznić funkcję membrany. Miejscowy środek przeciwbólowy może być podawany zwierzętom doświadczającym niewielkiego podrażnienia skóry z powodu depilacji.
3. Protokół diagnostycznego obrazowania ultrasonograficznego
- Włącz urządzenie ultrasonograficzne i wyreguluj moc wyjściową (jeśli to konieczne) w aparacie w procentach, aby uzyskać optymalną rozdzielczość.
- Ustaw ultrasonograf w trybie B (jasność), M (ruch) lub oba te tryb przed obrazowaniem, co pozwala na prawidłową wizualizację skurczu przysłony myszy.
- Nałóż niewielką ilość żelu ultradźwiękowego na górną część brzucha myszy i wmasuj żel w kierunku jamy klatki piersiowej.
- Umieść przetwornik ultradźwiękowy w tym obszarze i skieruj go w górę w kierunku serca. Wyreguluj sondę, aż do uzyskania optymalnej rozdzielczości obrazu. Uwaga: w przypadku tego protokołu idealnym do użycia jest przetwornik z matrycą mikrowypukłą lub liniowym przetwornikiem z matrycą fazowaną ze względu na niewielką powierzchnię i doskonałą rozdzielczość osiową9; częstotliwość musi być dostosowana w całym paśmie, a do tych eksperymentów można wykorzystać zakres 6,5-12 MHz.
- Naciśnij przycisk zamrażania, aby tymczasowo zapisać obrazy przysłony i view wybrane skurcze.
- Zapisz nagranie jako pętlę cine, która pozwala na późniejsze pomiary przepony przesunięcia, a także częstości oddechów. Uwaga: klatki obrazów można zapisać w pamięci komputera lub na zewnętrznym dysku twardym w celu przyszłej analizy9.
- Precyzyjnie zmierz głębokość ruchu przepony od rozluźnienia do skurczu za pomocą suwmiarki elektronicznej, która jest częścią oprogramowania ultrasonograficznego.
- Przekonwertuj plik cine loop na plik MPEG i określ częstość oddechów, zliczając liczbę skurczów przepony w okresie nagrywania. Alternatywnie, liczba skurczów na minutę (częstość oddechów) może być policzona na podstawie obrazu trybu M.
4. Rekonwalescencja zwierząt po znieczuleniu
- Mysz powinna całkowicie wyzdrowieć ze znieczulenia w ciągu 1 godziny. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą w mostku.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Typowy obraz USG przepony myszy przedstawiono na Rysunku 1A. Zarejestrowano maksymalne pionowe przemieszczenie przepony myszy. Odległość tę obliczono, precyzyjnie mierząc głębokość ruchu przepony od stanu rozluźnienia do skurczu, korzystając z elektronicznego suwmiarki będącej częścią oprogramowania USG. Tabela 1 przedstawia pomiary odległości skurczów przepony u trzech różnych myszy. Po przekonwertowaniu pliku pętli cine do formatu MPEG, częstotliwość oddychania określono poprzez policz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Obecny protokół eksperymentalny rozwija diagnostyczne techniki obrazowania ultrasonograficznego specyficzne dla aktywności przepony w modelu mysim za pomocą nieinwazyjnego podejścia in vivo . Ustawienia aparatu anestezjologicznego są wartościami przybliżonymi, które mogą być nieznacznie dostosowane dla każdego zwierzęcia, ponieważ poszczególne myszy mogą różnie reagować na znieczulenie. Aby zapobiec niewłaściwemu podawaniu znieczulenia, ważne jest regularne monitorowanie parametrów życiowych myszy, w tym tętna, ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca jest wspierana przez granty OU General Fund G110 i Research Excellence Fund of Biomedical Research oraz OSU-HRS Fund 013000. Autorzy pragną podziękować Lauren Chen za pomoc w przygotowaniu tego manuskryptu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Weterynaryjny cyfrowy ultradźwiękowy system obrazowania diagnostycznego | Edan | DUS 3 VET | Parametry ultrasonografii obejmują: częstotliwość 6,5 MHz, głębokość 29 mm. Uwaga: Do tego protokołu można użyć równoważnego aparatu ultradźwiękowego |
| mikrowypukły | Edan | C611 | Lub równoważny |
| GE Logiq i jednostka przenośna (HCU) | GE Healthcare | GE Logiq i jednostka przenośna (HCU) | Lub równoważna |
| sonda liniowa GE 12 MHz | GE Healthcare | 12L-RS | Lub równoważna |
| Parownik do znieczulenia weterynaryjnego | Webster Veterinary | Serial #: W422021 | Isoflurane był używany wyłącznie z tym waporyzatorem (lub jego odpowiednikiem). Do znieczulenia wstępnego zmontowano specjalnie wykonaną komorę indukcyjną do znieczulenia. Znieczulenie podtrzymujące przeprowadzono przy użyciu stożka nosowego |
| Isothesia (Isoflurane, USP) | Butler Schein | 29405 250ML PVL | Lub równoważnego |
| kanistra pochłaniającego znieczulenie Enviro-pure | Surgivet Smiths Medical PM, Inc. | Część #: 32373B10 | Lub równoważny |
| Żel do transmisji ultradźwięków | HM Sonic | N/A | Lub odpowiednik |
| Maść weterynaryjna | Puralube Puralube | NDC 17033-211-38 | Lub równoważna |
| podkładka izotermiczna Deltaphase | Braintree Scientific Inc. | 39DP | Lub równoważny |
| Depilator | Nair | N/A | Lub równoważny |
| Elektryczna maszynka do golenia | Remington | HC-5015 | Lub równoważny |
| Taśma chirurgiczna | 3M Micropore | 1530-1 | Lub odpowiednik |
| Gąbki z gazy | Dynarex | 3262 | Lub równoważny |
Bibliografia
- Snyder, C. S., et al. Complementarity of ultrasound and fluorescence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 9, 106(2009).
- Franchi, F., et al. Non-invasive assessment of cardiac function in a mouse model of renovascular hypertension. Hypertension Research: Official Journal of the Japanese Society of Hypertension. , (2013).
- Coatney, R. W. Ultrasound imaging: principles and applications in rodent research. ILAR Journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 42, 233-247 (2001).
- Morenz, K., et al. Detection of air trapping in chronic obstructive pulmonary disease by low frequency ultrasound. BMC Pulmonary Medicine. 12, 8(2012).
- Gilliam, L. A., Moylan, J. S., Ann Callahan, L., Sumandea, M. P., Reid, M. B. Doxorubicin causes diaphragm weakness in murine models of cancer chemotherapy. Muscle & Nerve. 43, 94-102 (2011).
- Ferreira, L. F., Campbell, K. S., Reid, M. B. Effectiveness of sulfur-containing antioxidants in delaying skeletal muscle fatigue. Medicine and Science in Sports and Exercise. 43, 1025-1031 (2011).
- Zuo, L., Clanton, T. L. Reactive oxygen species formation in the transition to hypoxia in skeletal muscle. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 289, 207-216 (2005).
- Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. J. Vis. Exp. , (2010).
- Hedrick, W. R., Hykes, D. L., Starchman, D. E. Ultrasound Physics and Instrumentation. , 4th edn, Elsevier Mosby. 445 (2005).
- von Sarnowski, B., Khaw, A. V., Kessler, C., Schminke, U. Evaluation of a microconvex array transducer for the ultrasonographic examination of the intrathoracic segments of the supraaortic arteries. Journal of Neuroimaging: Official Journal of the American Society of Neuroimaging. 20, 246-250 (2010).
- Stocksley, M. Abdominal Ultrasound. , Cambridge University Press. 7-8 (2001).
- Kremkau, F. W., Taylor, K. J. Artifacts in ultrasound imaging. Journal of Ultrasound in Medicine: Official Journal of the American Institute of Ultrasound in Medicine. 5, 227-237 (1986).
- Kremkau, F. W. Diagnostic Ultrasound: Principles and Instruments. Saunders Elsevier. , 7th edn, 521 (2006).
- Laing, F. C., Kurtz, A. B. The importance of ultrasonic side-lobe artifacts. Radiology. 145, 763-768 (1982).
- Abu-Zidan, F. M., Hefny, A. F., Corr, P. Clinical ultrasound physics. Journal of Emergencies, Trauma, and Shock. 4, 501-503 (2011).
- Gargani, L. Lung ultrasound: a new tool for the cardiologist. Cardiovascular Ultrasound. 9, 6(2011).
- Sanders, R. C., Winter, T. Clinical Sonography A Practical Guide. , 4th edn, Lippincott Williams & Wilkins. 632 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
