Synteza i charakterystyka trzeciorzędowej biblioteki amidów peptydów

Summary

Abstract

Peptydomimetyki są doskonałym źródłem ligandów białkowych. Oligomeryczny charakter tych związków umożliwia nam dostęp do dużych bibliotek syntetycznych w fazie stałej przy użyciu chemii kombinatorycznej. Jedną z najlepiej przebadanych klas peptydomimetyki są peptoidy. Peptoidy są łatwe do syntezy i wykazano, że są odporne na proteolizę i przepuszczalne dla komórek. W ciągu ostatniej dekady zidentyfikowano wiele użytecznych ligandów białkowych poprzez badania przesiewowe bibliotek peptoidów. Jednak większość ligandów zidentyfikowanych na podstawie bibliotek peptydów nie wykazuje wysokiego powinowactwa, z rzadkimi wyjątkami. Może to być częściowo spowodowane brakiem centrów chiralnych i ograniczeń konformacyjnych w cząsteczkach peptoidów. Niedawno opisaliśmy nową syntetyczną drogę dostępu do peptydowych trzeciorzędowych amidów (PTA). PTA to nadrodzina peptydomimetyków, która obejmuje między innymi peptydy, peptoidy i peptydy N-metylowane. W przypadku łańcuchów bocznych zarówno na atomach azotu α-węglowych, jak i w łańcuchu głównym, konformacja tych cząsteczek jest znacznie ograniczona przez przeszkodę steryczną i szczep allilowy 1,3. (Rysunek 1) Nasze badanie sugeruje, że te cząsteczki PTA są wysoce ustrukturyzowane w roztworze i mogą być używane do identyfikacji ligandów białkowych. Wierzymy, że cząsteczki te mogą być w przyszłości źródłem ligandów białkowych o wysokim powinowactwie. W tym miejscu opisujemy metodę syntezy łączącą moc strategii podziału i puli oraz submonomerów w celu syntezy biblioteki jednoskładnikowych (OBOC) próbki PTA.

Introduction

Peptydomimetyki to związki, które naśladują strukturę naturalnych peptydów. Zostały zaprojektowane tak, aby zachować bioaktywność przy jednoczesnym przezwyciężeniu niektórych problemów związanych z naturalnymi peptydami, w tym przepuszczalności komórek i stabilności przed proteolizą^1-3. Ze względu na oligomeryczny charakter tych związków, duże biblioteki syntetyczne mogą być łatwo dostępne za pośrednictwem monomerycznych lub submonomerycznych ścieżek syntezy^4-7. Jedną z najczęściej badanych klas peptydomimetyki są peptoidy. Peptoidy są oligomerami N-alkilowanych glicyn, które można łatwo syntetyzować przy użyciu strategii sub-monomerów ^8,9. Wiele użytecznych ligandów białkowych udało się zidentyfikować na podstawie badań przesiewowych dużych bibliotek syntetycznych peptoidów pod kątem docelowych białek ^1,10-14. Niemniej jednak "trafienia" zidentyfikowane w bibliotekach peptydów rzadko wykazują bardzo wysokie powinowactwo do celów białkowych^1,10-14,22. Jedną z głównych różnic między peptydami a naturalnymi peptydami jest to, że większość peptydów na ogół nie ma zdolności do tworzenia struktury drugorzędowej z powodu braku centrów chiralnych i ograniczeń konformacyjnych. Aby rozwiązać ten problem, w ciągu ostatniej dekady opracowano wiele strategii, w dużej mierze koncentrujących się na modyfikacji łańcuchów bocznych zawartych na atomach azotu w łańcuchu głównym^15-22. Niedawno opracowaliśmy nową drogę syntezy w celu wprowadzenia naturalnych łańcuchów bocznych aminokwasów do szkieletu peptydu w celu wytworzenia peptydowych trzeciorzędowych amidów²³.

Peptydowe trzeciorzędowe amidy (PTA) to super rodzina peptydomimetyków, która obejmuje, ale nie ogranicza się do peptydów (R₂ = H), peptydów (R₁ = H) i N-metylowanych peptydów (R₁ ≠ H, R₂ = Me). (Patrz rysunek 1) Nasza droga syntezy wykorzystuje naturalnie występujące aminokwasy jako źródło chiralności i łańcuchów bocznych na α-węglu oraz dostępne na rynku aminy pierwszorzędowe, aby zapewnić N-podstawienia. W związku z tym można badać większą przestrzeń chemiczną niż w przypadku prostych peptydów, peptoidów lub peptydów N-metylowanych. Widma dichroizmu kołowego wykazały, że cząsteczki PTA są wysoce ustrukturyzowane w roztworze. Charakterystyka jednego z kompleksów PTA-białko wyraźnie pokazuje, że do wiązania wymagane są ograniczenia konformacyjne PTA. Niedawno odkryliśmy również, że niektóre cząsteczki PTA mają lepszą przepuszczalność komórek niż ich peptoidalne i peptydowe odpowiedniki. Uważamy, że te biblioteki PTA mogą być dobrym źródłem ligandów o wysokim powinowactwie do celów białkowych. W tym artykule szczegółowo omówimy syntezę próbki jednoskładnikowej biblioteki PTA z jedną kulką (OBOC) wraz z niektórymi ulepszonymi warunkami sprzężenia i rozszczepienia tych związków.

Protocol

1. Podstawy syntezy split-and-pool

Aby efektywnie generować dużą liczbę związków w fazie stałej, synteza typu split-and-pool jest często stosowana jako ogólna strategia. Jak pokazano na rysunku 4, koraliki z macki są najpierw dzielone na trzy części. Każda porcja jest poddawana reakcji z innym odczynnikiem, generując pierwszą pozostałość na kulkach. Po pierwszej reakcji wszystkie trzy porcje są łączone razem, mieszane, a następnie ponownie dzielone na trzy porcje. Każda porcja ponownie zareaguje z innym odczynnikiem, generując drugą pozostałość na kulkach. Po dwóch krokach dzielenia i pulowania generowanych jest dziewięć związków.

W syntezie submonomerów, kulki są najpierw dzielone na kilka części, aby reagować z różnymi bromokwasami w obecności odczynnika sprzęgającego. Po umyciu rozpuszczalnikiem wszystkie kulki zostaną zebrane razem i wymieszane, a następnie ponownie podzielone na kilka porcji, aby reagować z różnymi aminami pierwszorzędowymi. Po aminacji wszystkie kulki są łączone razem i dokładnie myte, kompletując pełny monomer na każdym koraliku. Proces ten można powtarzać aż do osiągnięcia pożądanej różnorodności.

2. Przygotowanie bromku kwasu z naturalnych aminokwasów

W syntezie submonomerów, synteza każdego monomeru jest podzielona na dwa oddzielne etapy: 1. sprzężenie kwaśnego bromku i 2. aminacja z pierwszorzędowymi aminami (Rysunek 2). W celu syntezy trzeciorzędowego amidu peptydowego z naturalnych aminokwasów zostaną przygotowane bromki kwasu chiralnego z łańcuchami bocznymi na węglu alfa. Tutaj opisujemy metodę przekształcania naturalnego aminokwasu w odpowiadający mu bromek kwasu z wysoką wiernością stereo. Jako przykładu używamy alaniny; Inne aminokwasy, w tym seryna, treonina, kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, asparagina, glutamina, glicyna, walina, izoleucyna, fenyloalanina mogą być również przekształcane w bromokwasy w podobnych warunkach. Należy pamiętać, że niektóre aminokwasy z grupami funkcyjnymi, takimi jak fenol, guanidyna i amina, muszą być chronione przed transformacją. Układ reakcji pokazano na rysunku 3.

Środki ostrożności: Do następujących reakcji z udziałem HBr, NaNO₂ i innych/toksycznych chemikaliów, potrzebne są odpowiednie środki bezpieczeństwa, takie jak okulary ochronne, fartuch laboratoryjny i rękawice odporne na chemikalia. Wszystkie reakcje powinny być przeprowadzane w dygestoriach przez doświadczonego chemika.

1. Dodaj 370 ml wody do 630 ml 48% roztworu HBr, aby przygotować 1 l, 30% roztwór HBr. Dodać 500 ml glikolu etylenowego do 1 litrowego pojemnika do kąpieli; dodać suchy lód, aby utrzymać temperaturę na poziomie -10 °C. Uwaga: 48% roztwór HBr jest silnie kwaśny i, należy obchodzić się z nim ostrożnie. Przeczytaj kartę charakterystyki przed użyciem.
2. Dodać D-alaninę (8,9 g, 0,1 mola) i KBr (11,9 g, 0,1 mola) do kolby okrągłodennej o pojemności 250 ml z trzema szyjkami i mieszadłem magnetycznym. Dodaj 100 ml i 30% HBr przygotowany w poprzednim kroku. Umieścić kolbę w kąpieli z glikolu etylenowego przygotowanej w kroku 2.1 i utrzymywać temperaturę na poziomie -10 °C. Przez długą igłę z dna kolby przez 10 minut przez pęcherzyki bąbelkować argon, jak pokazano na rysunku 3. Wymieszaj roztwór za pomocą mieszadła magnetycznego z prędkością 300 obr./min.
3. Rozpuścić NaNO₂ (8,28 g, 0,12 mola) w zlewce o pojemności 100 ml z 20 ml wody. Dodaj roztwór do wkraplacza wyrównującego ciśnienie lejka i uszczelnij kroplomierz przegrodą. Powoli włączyć zawór zakraplacza i pozwolić, aby roztwór NaNO₂ wpadł do kolby. Kontroluj zawór, aby dostosować szybkość kapania do około 2 kropli na sekundę. Utrzymuj mieszanie z prędkością 300 obr./min i utrzymuj bulgotanie argonu z dna kolby. Kolba powinna być przechowywana w kąpieli glikolu etylenowego w temperaturze -10 °C do czasu dodania całego_NaNO2. Ostrzeżenie: Ten etap wytwarza ciepło i gaz podczas dodawania roztworu NaNO₂. Szybkość kapania powinna być dokładnie kontrolowana, a cały system powinien być otwarty przez wylot argonu.
4. Mieszaj jeszcze przez 3 godziny i pozwól, aby temperatura rozgrzała się z -10 °C do temperatury pokojowej. Powstały roztwór powinien być przezroczysty do jasnożółtego; jeśli kolor jest zbyt ciemny, należy zastosować próżnię, aby usunąć nadmiar tlenków azotu i ewentualny Br₂ powstający podczas reakcji.
5. Ekstrahować produkt z roztworu za pomocą 3 x 35 ml eteru dietylowego za pomocą lejka ekstrakcyjnego. Połącz fazę organiczną i umyj ją nasyconą solanką. Fazę organiczną można również umyć niewielką ilością NaHCO₃ przed myciem solanką, aby usunąć kolor, jeśli jest ciemny. Suszyć fazę organiczną na Na_2SO4 przez 6 godzin.
6. Odfiltrować Na₂SO₄ i odparować rozpuszczalnik w próżni, surowy produkt powinien być otrzymany w postaci klarownego do jasnożółtego oleju. Produkt surowy może być dalej oczyszczany przez destylację w temperaturze 115 °C, 3 mm Hg lub przez kolumnę krzemionkową z octanem heksonu etylu w proporcji 3:1.
7. Czysty produkt otrzymuje się w postaci klarownego oleju, 6,6 g (wydajność 74%), gęstość = 1,69 g/ml, [α]D20 = +24° (metanol), ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 4,41 (q, J = 7,0 Hz, 1H), 1,86 (d, J = 7,0 Hz, 3H). W przypadku kwasu (S)-2-bromopropanowego-d₄ (przygotowanego z d 4-L-alaniny) czysty produkt otrzymuje się w postaci klarownego oleju o wydajności 78%, gęstości = 1,72 g/ml, [α]D20 = -19° (metanol). ¹H NMR, nie obserwuje się znaczącego sygnału H. ESI-MS^- [M-1]^- = 155,1 (oczekiwane 154,97). Dla kwasu (S)-2-bromo-4-metylopentanowego (otrzymanego z L-leucyny przy użyciu tej samej procedury) otrzymuje się czysty produkt w postaci klarownego oleju, wydajność 89%, [α]D20 = +37° (metanol), ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 4,30 (t, J = 7,7 Hz, 1H), 1,94 (dd, J = 10,8, 3,9 Hz, 2H), 1,81 (tt, J = 13,2, 6,5 Hz, 1H), 0,96 (dd, J = 18,2, 6,6 Hz, 7 godzin). W przypadku kwasu (S)-2-bromo-3-fenylopropanowego (przygotowanego z L-fenyloalaniny przy użyciu tej samej procedury) czysty produkt otrzymuje się w postaci jasnożółtego oleju, o wydajności 72%, [α]D20 = +17° (metanol), ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7,38 – 7,19 (m, 5H), 4,42 (dd, J = 8,1, 7,3 Hz, 1H), 3,47 (dd, J = 14,2, 8,2 Hz, 1H), 3,25 (dd, J = 14,2, 7,2 Hz, 1H).

3. Znakowanie izotopowe alaniny za pomocą aminotransferazy

W kombinatorycznej syntezie bibliotecznej, szczególnie w syntezie jednoskładnikowej (OBOC), ilość związku, którą można uzyskać z każdego koralika, jest stosunkowo mała. (Zazwyczaj od 1 pmol do 10 nmol). Dodatkowo spektrometria mas jest szeroko stosowana do identyfikacji i charakterystyki końcowego związku ze względu na jego wysoką czułość. Aby zastosować spektrometrię mas do określenia bezwzględnej stereochemii w centrach chiralnych końcowych produktów PTA, enancjomery kwasu bromo powinny być znakowane izotopowo przed użyciem. Tutaj opisujemy metodę użycia transaminazy i D₂O do znakowania L-alaniny.

1. Rozpuścić L-alaninę (300 mg, 3,36 mmol) w 10 ml_D2Ow probówce z polietylenu o pojemności 50 ml. Dodać α-ketoglutaran (10 mg, 0,068 mmol) jako kosubstrat. Rozgrzej probówkę do 37 °C i ustaw pD na 8,5-8,7 za pomocą 1 M NaOD. Uwaga: pD określa się za pomocą pasków testowych pH. Tradycyjny pH-metr wyposażony w elektrodę szklaną selektywną dla H⁺ może dawać nieprawidłowy odczyt dla D⁺.
2. Dodać aminotransferazę alaninową (0,1 mg, EC 2.6.1.2 z serca świni, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) do roztworu pD 8,5 - 8,7, 37 °C przygotowanego w poprzednim etapie. Umieścić probówkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C i inkubować ją przez noc z łagodnym wstrząsaniem, preferowane jest 10 do 30 obr./min.
3. Po całonocnej inkubacji pobrać 0,5 ml roztworu_D2Oi sprawdzić postęp reakcji za pomocą ¹H-NMR. Wszystkie sygnały protonowe alaniny, δ 3,76 (q, J = 7,2 Hz, 1H), 1,46 (d, J = 7,3 Hz, 3H), ¹H NMR 400 MHz, powinny być znacznie stłumione z powodu deuteracji. Ponad 98% protonu powinno zostać zamienione na deuter, jak opisano wcześniej²³. Uwaga: D₂O można częściowo odzyskać przez destylację, jeśli reakcja jest przeprowadzana na dużą skalę (>200 ml D₂O). Zwykle z roztworu można wydestylować od 60% do 80%_D2O.
4. Zamrozić powyższy roztwór ciekłym azotem i liofilizować go za pomocą liofilizatora, aby uzyskać biały deuterowany proszek L-alaniny.

4. Synteza regionu łącznika peptoidalnego

Region linkera nie jest wymagany do syntezy biblioteki PTA. Jednak w celu uniknięcia wysokiego tła w dolnym zakresie mas cząsteczkowych (100-600) spektroskopii mas MALDI i poprawy jonizacji związków, często stosuje się łącznik peptoidowy z wieloma resztami polarnymi. Ten łącznik peptydów może być zsyntetyzowany za pomocą standardowej procedury syntezy peptoidów. Tutaj zsyntetyzujemy pentamer N-metoksyetyloglicyny jako łącznik (jak pokazano na rysunku 5).

1. Pęcznieć 90 μm kulki Tentagel ze łącznikiem RAM (1 g, 0,27 mmol/g) w 10 ml DMF przez 3 godziny w reaktorze strzykawkowym o pojemności 12 ml z łagodnym wstrząsaniem.
2. Opróżnij DMF z reaktora i dodaj 10 ml 20% roztworu DMF piperydyny, aby odbezpieczyć grupę fmoc od łącznika amidowego Lodowiska. Potrząsaj kulkami z 20% roztworem piperydyny przez 30 minut. Przemyć DMF 5x, aby usunąć całą piperydynę.
3. Wyjmij kilka kulek ze strzykawki i przetestuj je za pomocą testu chloranilu. Koraliki powinny zmienić kolor na ciemnobrązowy (dodatni wynik testu chloranilu na obecność aminy pierwszorzędowej), jeśli fmoc zostanie skutecznie odbezpieczony.
4. Przygotować następujące roztwory: 1. 20 ml, 2 M roztwór kwasu bromooctowego/DMF; 2. 20 ml, 2 M roztwór DIC/DMF; 3. 10 ml, 1 M roztwór metoksyloetyloaminy/DMF.
5. Dodać 5 ml 2 M roztworu kwasu bromooctowego/DMF do kulek, delikatnie wstrząsnąć. Następnie dodać 5 ml 2 M roztworu DIC/DMF do kulek; Uszczelnić strzykawkę tłokiem i umieścić ją na wytrząsarce. Wstrząsaj przez 10 minut.
6. Dokładnie umyj koraliki za pomocą DKZ. Dodać 2 ml 1 M roztworu metoksyetyloaminy/DMF przygotowanego z kroku 4.4 do kulek. Uszczelnić strzykawkę tłokiem i potrząsać nią na wytrząsarce przez 30 minut.
7. Umyj koraliki za pomocą DMF 5x. Sprawdź kilka koralików za pomocą testu chloranilu, jeśli jest pozytywny (koraliki zmieniają kolor na niebieski), a następnie przejdź do następnego kroku. W przeciwnym razie powtórz krok 4.6.
8. Powtórz kroki od 4.5 do 4.7, 4x, aby zakończyć pentamer.

5. Synteza biblioteki PTA z kwasami (R)- i (S)-2-bromopropionowymi

Tutaj opisujemy syntezę małej biblioteki PTA z teoretyczną różnorodnością 9 261 związków przy użyciu 1 g kulek z kroku 4.8. Należy pamiętać, że koralik z macki 90 μm zawiera około 2,9 miliona koralików na gram; W związku z tym redundancja biblioteki wyniesie 2,9 x 10⁶ / 9 261 = 312 kopii. Jako kwasy użyjemy kwasu bromooctowego, (R)-2-bromopropanu i znakowanego izotopowo kwasu (S)-2-bromopropanowego-d₄ jako kwasów oraz 7 różnych amin (A1 ~ A7, szczegóły na rysunku 5). Do przeprowadzenia syntezy zostaną wykorzystane reaktory strzykawkowe oraz kolektor próżniowy.

1. Dodać 10 ml DCM:DMF w stosunku 1:1 do strzykawki z kroku 4.8; użyć pipety o pojemności 1 000 μl ze ściętą końcówką pipety, aby równomiernie rozdzielić wszystkie kulki 1 g na trzy reaktory strzykawkowe o pojemności 5 ml. Oznacz je jako B (kwas bromooctowy), R ((R)-2-bromopropanowy) i S ((S)-2-bromopropanowy kwas-d₄). Umyć wszystkie 3 strzykawki za pomocą DCM 3x, a strzykawki oznaczone literami R i S umyć bezwodnym THF 3x, umyć strzykawkę oznaczoną literą B za pomocą DMF 3x.
2. Strzykawka R i S. Sprzężenie BTC kwasu bromopropanowego.
   1. Przygotuj świeży roztwór BTC/THF. Dodaj około 200 mg BTC do fiolki w okapie wyciągowym, zamknij ją nakrętką. Zważ ilość BTC w fiolce. Obliczyć potrzebną ilość rozpuszczalnika i dodać bezwodny THF do fiolki, aby uzyskać roztwór o stężeniu 20 mg/ml BTC/THF.
   2. Przygotuj mieszaninę kwasów bromo i BTC. Dodać oddzielnie kwas (R)-2-bromopropanowy (89 μl, 0,95 mmol) i kwas (S)-2-bromopropanonowy-d₄ (89 μl, 0,95 mmol) w dwóch małych fiolkach. Do każdej fiolki dodać 5 ml powyższego roztworu o stężeniu 20 mg/ml BTC/THF. Zamknąć obie fiolki i umieścić je w zamrażarce w temperaturze -20 °C na 20 minut.
   3. Dodać 1,125 μl, 2:1 THF/DIPEA (750 μl THF, 375 μl DIPEA, 2,2 mmol) oddzielnie do strzykawki R i S. Wymieszaj kulki z końcówką pipety. Pozwól im siedzieć przez 5 minut.
   4. Wziąć dwie schłodzone mieszaniny kwasów bromo/BTC z kroku 5.2.2, dodać 2,4,6-trimetylopirydynę (356 μl, 2,7 mmol) do każdej fiolki. Natychmiast utworzą się białe osady. Nanieść odpowiednią zawiesinę bezpośrednio na podstawowe kulki (strzykawka R i S w kroku 5.2.3) tak szybko, jak to możliwe, a następnie umieścić je na wytrząsarce, aby wstrząsały poniżej 120 obr./min przez 2 godziny.
      Uwaga: Roztwór w reaktorach strzykawkowych powinien być bladożółtawą zawiesiną przez cały czas trwania reakcji. Ciemniejszy kolor wskazuje na nadmierne ciepło uwalniane podczas początkowego dodawania roztworu chlorku kwasowego. Można to rozwiązać poprzez dalsze schładzanie lub rozcieńczenie mieszaniny kwasów bromo/BTC.
3. Strzykawka B. Sprzężenie kwasu bromooctowego z DIC
   1. Przygotować świeży 20 ml, 2 M roztwór kwasu bromooctowego/DMF. Przygotować 20 ml 2 M roztwór DIC/DMF.
   2. Dodać 2 ml 2 M roztworu kwasu bromooctowego/DMF do strzykawki B, delikatnie wstrząsnąć. Dodać 2 ml 2 M roztworu DIC/DMF do strzykawki B, delikatnie wstrząsnąć.
   3. Umieścić strzykawkę B na tej samej wytrząsarce co strzykawka R i S, wstrząsać nią przez 2 godziny. Należy zauważyć, że reakcja sprzęgania kwasu bromooctowego / DIC odbywa się w ciągu 30 minut; wydłużony czas reakcji jest dla wygody syntezy dzielonej i puli.
4. Po 2 godzinach wyjąć strzykawkę R, S i B z shakera. Dokładnie umyć wszystkie trzy strzykawki za pomocą DCM 5x. Następnie umyć DMF 5x. Należy pamiętać, że strzykawki R i S nie można umyć DMF przed uprzednim umyciem DCM lub THF.
5. Zebrać wszystkie kulki ze strzykawek R, S i B w jednym reaktorze strzykawkowym o pojemności 12 ml. Umyj wszystkie koraliki za pomocą DMF 5x.
6. Dodać 10 ml 1:1 DCM:DMF do strzykawki; użyć pipety o pojemności 1 000 μl ze ściętą końcówką pipety, aby równomiernie podzielić wszystkie kulki na 7 oddzielnych strzykawek o pojemności 2 ml i oznaczyć je jako A1-A7.
7. Aminacja. Przygotować 10 ml, 2 M roztwory aminy pierwszorzędowej/DMF dla każdej z 7 amin wymienionych na rysunku 5. Dodać 5 ml każdego roztworu aminy do odpowiedniej strzykawki A1-A7. Inkubować wszystkie 7 strzykawek w inkubatorze o temperaturze 60 °C, wstrząsając przez noc.
8. Po inkubacji dokładnie umyj wszystkie kulki DMF. Weź kilka kulek z każdej strzykawki i sprawdź za pomocą testu chloranilu. Jeśli koraliki zmienią kolor na zielony (dodatni) w ciągu 3 minut, przejdź do następnego kroku. Jeśli wynik jest ujemny, powtórzyć krok 5.7 dla strzykawek z wynikiem ujemnym.
9. Powtórz kroki od 5.1 do 5.8 2x, aby zakończyć trymer. Krok opcjonalny: Po każdym cyklu zalecamy sprawdzenie jakości syntezy za pomocą spektroskopii mas, jak opisano poniżej. Wszystkie 9 261 związków jest teraz syntetyzowanych na koralikach z macki jako biblioteka OBOC.
10. Potwierdzenie spektroskopem mas PTAs.
    PTA są oligomerami o wysokiej strukturze i posiadają wiele wspólnych cech peptydów N-metylowanych. Jednym z najczęstszych problemów syntezy peptydów N-metylowanych w fazie stałej jest degradacja kwasów podczas rozszczepiania TFA. Aby zahamować degradację kwasów, rozszczepienie cząsteczek takich jak cyklosporyna ze stałego nośnika jest często przeprowadzane w niskiej temperaturze. Porównaliśmy różne warunki rozszczepiania różnych cząsteczek PTA od stałego podłoża. Odkryliśmy, że ogólnie rzecz biorąc, niska temperatura i zmniejszone stężenie TFA mogą skutecznie hamować degradację kwasów i dostarczać czystsze związki.
    1. Przygotować 10 ml roztworu 1:1 TFA/DCM w probówce o pojemności 15 ml. Zamknij probówkę i wstaw ją do zamrażarki o temperaturze -20 °C na 20 minut.
    2. Umyj koraliki, które mają zostać rozcięte, za pomocą DCM 5x. Potrząsaj koralikami w DCM przez 15 minut i ponownie umyj koraliki za pomocą DCM 5x.
    3. Opróżnić DCM ze strzykawki. Użyj mikroskopu świetlnego i pipety ze ściętą końcówką, aby przenieść każdy pojedynczy koralik na 96-dołkową płytkę, po jednym koraliku na dołek.
    4. Przykryj płytkę 96-dołkową szkiełkiem nakrywkowym. Wstaw talerz do zamrażarki w temperaturze -20 °C na 15 minut.
    5. Pobrać schłodzony roztwór TFA/DCM w stosunku 1:1 z kroku 5.10.1 i dodać 20 μl do każdej studzienki zawierającej kulkę. Włożyć szkiełko nakrywkowe z powrotem i umieścić 96-dołkową płytkę na shakerze w lodówce w temperaturze -20 °C.
    6. Wstrząsaj przez 20 minut. Wyjmij płytkę 96-dołkową i zdejmij szkiełko nakrywkowe. Wysusz TFA/DCM z każdej studzienki, wdmuchując na nią powietrze lub argon. Jeśli rozszczepionych zostanie więcej niż 10 kulek, można użyć speedvaca do wysuszenia TFA/DCM z całej płytki. Należy pamiętać, że w tym momencie nie wszystkie związki są odcinane od kulek, ale rozszczepione związki powinny być więcej niż wystarczające do przeprowadzenia analizy spektroskopii mas.
    7. Dodać 20 μl roztworu ACN:H₂O w proporcji 6:4, aby rozpuścić rozszczepione związki z każdej studzienki. Umieścić 0,6 μl każdego roztworu związku razem z 0,6 μl matrycy CHCA MALDI na płytce MALDI.
    8. Użyj spektrometrii mas MALDI, aby określić masę cząsteczkową i sekwencję (MS/MS) każdego związku.

6. Test chloranilu

1. Do każdego testu należy przygotować świeże następujące odczynniki. Roztwór A: 2% chloranilu (CAS: 118-75-2) w DMF. Roztwór B: 2% aldehyd octowy (CAS: 75-07-0) w DMF.
2. Przed badaniem zmieszać 100 μl roztworu A ze 100 μl roztworu B w probówce o pojemności 1,5 ml; wrzucić kulki i delikatnie wstrząsnąć. Jeśli kulki zmienią kolor na niebieski w ciągu 5 minut, oznacza to obecność aminy drugorzędowej na powierzchni kulek. Aminy pierwszorzędowe dają ciemnobrązowy kolor zamiast zmieniać kolor na niebieski.

Results

Tutaj pokazujemy trzy reprezentatywne widma MALDI z trymera PTA z linkerem. Jak pokazano na rysunku 6A, po rozszczepieniu w temperaturze pokojowej przy użyciu 50% roztworu TFA/DCM obserwuje się znaczną degradację. Na rysunku 6A piki 593 i 484 odpowiadają odpowiednio łącznikowi i trimerowi PTA, pokazują, że cała cząsteczka została z powodzeniem zsyntetyzowana na kulce, ale uległa degradacji podczas rozszczepienia. Po rozszczepieniu w warunkach niskiej temperatury, jak opisano powyżej, ilo...

Discussion

Peptydowe trzeciorzędowe amidy (PTA) to nadrodzina oligomerów peptydomimetycznych. Oprócz dobrze przebadanych peptydów, peptydów i peptydów N-metylowanych, duża część związków z tej rodziny pozostaje niedostatecznie zbadana, głównie z powodu braku syntetycznej metody dostępu do ogólnych peptydów N-alkilowanych. Tutaj opisujemy skuteczną metodę syntezy PTA z chiralnymi blokami budulcowymi pochodzącymi z aminokwasów. Wcześniej informowaliśmy o użyciu nowej trasy submonomerów do syntezy bibliotek cząsteczek PTA²³...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4,6 trimetylopirydyna	ACROS	161950010	CAS:108-75-8
2-morfolinoetanamina	Sigma-Aldrich	06680	CAS:2038-03-1
48% roztwór wodny HBr	ALFA AESAR	AA14036AT	CAS:10035-10-6
Aldehyd octowy	Sigma-Aldrich	402788	CAS:75-07-0
Acetonitryl	Fisher	SR015AA-19PS	CAS: 75-05-8
Bezwodny tetrahydrofuran (THF)	EMD	EM-TX0277-6	CAS: 109-99-9
Benzyloamina	Sigma-Aldrich	185701	CAS: 100-46-9
Węglan bis(trichlorometylu) (BTC)	ACROS	258950050	CAS: 32315-10-9
Kwas bromooctowy	ACROS	106570010	CAS:79-08-3
Chloranil	Sigma-Aldrich	23290	CAS:118-75-2
Cykloheksanometylamina	Sigma-Aldrich	101842	CAS:3218-02-8
D2O	Izotop Cambridge	DLM-4-99.8-1000	CAS:7789-20-0
D-Alanina	Anaspec	61387-100	CAS:338-69-2
Dichlorometan (DCM)	Fisher	BJ-NS300-20	CAS: 75-09-2
Dimetyloformamid (DMF)	Fisher	BJ-076-4	CAS: 68-12-2
Glikol etylenowy	Dąb	44710	CAS: 107-21-1
Izopentyloamina	Sigma-Aldrich	W321907	CAS: 107-85-7
KBr	ACROS	424070025	CAS: 7758-02-3
L-Alanina	Anaspec	61385-100	CAS:56-41-7
3-metoksypropyloamina	Sigma-Aldrich	M25007	CAS:5332-73-0
2-metoksyetyloamina	Sigma-Aldrich	143693	CAS:109-85-3
N-(3-aminopropylo)-2-pirolidynon	136565 Sigma-Aldrich		CAS:7663-77-6
N,N'-diizopropylokarbodimid (DIC)	ACROS	115211000	CAS:693-13-0
N,N-diizopropyloetyloamina (DIPEA)	Sigma-Aldrich	D125806	CAS:7087-68-5
NaNO2	ACROS	424340010	CAS:7631-99-4
NAOD 40% roztwór w wodzie	ACROS	200058-506	CAS:7732-18-5
Piperydyna	ALFA AESAR	A12442-AE	CAS: 110-89-4
Piperonyloamina	Sigma-Aldrich	P49503	CAS: 2620-50-0
Propylamina	Sigma-Aldrich	240958	CAS: 107-10-8
Kwas trifluorooctowy	Sigma-Aldrich	299537	CAS: 76-05-1
&alfa;-Kwas cyjano-4-hydroksycynamonowy	Sigma-Aldrich	39468	CAS: 28166-41-8
&alfa;-ketoglutaran	ALFA AESAR	AAA10256-22	CAS: 328-50-7
Żywica tentagel z łącznikiem	RINK Rapp-Polymere	S30023
Transaminaza alaninowa	Roche	10105589001	AKA: Inkubator transaminotransferazy glutaminiano-pirogronianowej (GPT)
	New Brunswick Scientific	Innova44
NMR	Bruker	400 MHz
Spektrometr masowy MALDI	Applied Biosystems	4800 MALDI-TOF/TOF
Liofilizator	SP Scientific	VirTis stacjonarny
	INTAVIS Kolumna	reakcyjna	3 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml
Kolektor próżniowy	Promega	A7231	Vac-Man