Artykuł metodologiczny

Podłużny pomiar sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej w modelach 3D guzów przy użyciu mikroreologii śledzenia cząstek

11.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51302

⸱

10 czerwca 2014

 ,  ,  , 
1Department of Physics, University of Massachusetts Boston

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Mikroreologia śledząca cząstki może być wykorzystana do nieniszczącego ilościowego i przestrzennego mapowania zmian właściwości mechanicznych macierzy zewnątrzkomórkowej w modelach 3D nowotworów.

Streszczenie

Wykazano, że mikrośrodowisko mechaniczne działa jako kluczowy regulator zachowania i sygnalizacji wzrostu guza, który sam w sobie jest przebudowywany i modyfikowany jako część zestawu złożonych, dwukierunkowych interakcji mechanowrażliwych. Podczas gdy opracowanie biologicznie istotnych modeli 3D guzów ułatwiło mechanistyczne badania nad wpływem reologii macierzy na wzrost guza, odwrotny problem mapowania zmian w środowisku mechanicznym wywołanych przez nowotwory pozostaje wyzwaniem. W tym miejscu opisujemy implementację mikroreologii śledzenia cząstek (PTM) w połączeniu z modelami 3D raka trzustki jako część solidnego i wykonalnego podejścia do podłużnego monitorowania zmian fizycznych w mikrośrodowisku guza, in situ. Opisana tutaj metodologia integruje system przygotowania modeli 3D in vitro osadzonych w modelowym rusztowaniu macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) kolagenu typu I z fluorescencyjnie znakowanymi sondami równomiernie rozmieszczonymi do pomiarów mikroreologicznych zależnych od położenia i czasu w całej próbce. Guzy in vitro są platerowane i badane w warunkach równoległych przy użyciu wielodołkowych płytek obrazowych. Opierając się na ustalonych metodach, filmy z ruchami sondy śledzącej są przekształcane za pomocą uogólnionej relacji Stokesa Einsteina (GSER) w celu zgłoszenia złożonego, zależnego od częstotliwości modułu ścinania lepkosprężystego, G*(ω). Ponieważ podejście to opiera się na obrazowaniu, charakterystyka mechaniczna jest również mapowana na duże pola przestrzenne światła przechodzącego, aby jednocześnie zgłaszać zmiany jakościowe w wielkości i fenotypie guza 3D. Przedstawiono reprezentatywne wyniki pokazujące kontrastującą odpowiedź mechaniczną w podregionach związanych z zlokalizowaną degradacją matrycy wywołaną inwazją, a także kalibracją systemu, dane walidacyjne. Przedstawiono również niepożądane wyniki typowych błędów eksperymentalnych i rozwiązywanie tych problemów. Format posiewu 3D z 96 dołkami zaimplementowany w tym protokole sprzyja korelacji pomiarów mikroreologicznych z terapeutycznymi testami przesiewowymi lub obrazowaniem molekularnym w celu uzyskania nowych informacji na temat wpływu leczenia lub bodźców biochemicznych na mikrośrodowisko mechaniczne.

Wprowadzenie

Z rosnącej ilości dowodów w literaturze jasno wynika, że komórki nowotworowe, podobnie jak w przypadku niezłośliwych komórek nabłonkowych ssaków, są bardzo wrażliwe na mechaniczne i biofizyczne właściwości otaczającej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i innych składników mikrośrodowiska1-9. Eleganckie badania mechanistyczne dostarczyły informacji na temat roli sztywności zewnątrzkomórkowej jako złożonego mechanowrażliwego partnera sygnalizacyjnego, który reguluje złośliwe zachowanie wzrostu i morfogenezę2,3,10,11. Prace te zostały ułatwione w szczególności dzięki opracowaniu trójwymiarowych modeli nowotworów in vitro, które przywracają biologicznie istotną architekturę tkanek i mogą być hodowane w materiałach rusztowań o regulowanej mechanice i obrazowane za pomocą mikroskopii optycznej12-19. Jednak druga strona tego mechanoregulacyjnego dialogu między guzem a mikrośrodowiskiem, za pomocą którego komórki rakowe z kolei modyfikują reologię swojego otoczenia, pozostaje nieco trudniejsza do zbadania. Na przykład podczas procesów inwazji komórki na obrzeżach guza mogą przechodzić przejście nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT) i zwiększać ekspresję metaloproteaz macierzy (MMP), które powodują lokalną degradację ECM20-22, co z kolei wpływa na mechanowrażliwe zachowanie wzrostu innych proksymalnych komórek nowotworowych. Poprzez różnorodne procesy biochemiczne komórki rakowe nieustannie dostosowują lokalną sztywność swojego środowiska w górę i w dół, aby dopasować się do różnych procesów w różnym czasie. Opisana tutaj metodologia jest motywowana potrzebą narzędzi analitycznych, które raportują lokalne zmiany sztywności i podatności ECM podczas wzrostu, które można zintegrować z modelami 3D guzów i skorelować podłużnie ze zmianami biochemicznymi i fenotypowymi bez przerywania hodowli.

W poszukiwaniu odpowiedniej techniki do wdrożenia w tym kontekście, mikroreologia śledzenia cząstek (PTM) wyłania się jako mocny kandydat. Metoda ta, zapoczątkowana pierwotnie przez Masona i Weitza23,24, wykorzystuje ruch sond znacznikowych osadzonych w złożonym płynie do raportowania zależnego od częstotliwości zespolonego lepkosprężystego modułu ścinania, G * (ω) w skalach długości mikronów. To ogólne podejście zostało opracowane z wieloma wariantami dostosowanymi do różnych zastosowań w miękkiej materii skondensowanej, koloidach, biofizyce i fizyce polimerów25-31. PTM ma pewne zalety w porównaniu z innymi metodami, ponieważ odczyty lokalnej lepkosprężystości są dostarczane przez nieniszczące obrazowanie wideo biochemicznie nieaktywnych sond znacznikowych, które są włączane w czasie przygotowywania hodowli i pozostają na miejscu przez dłuższe okresy wzrostu. Jest to przeciwieństwo złotego standardu pomiarów za pomocą reometru oscylacyjnego z naciskiem na ścinanie masowe, który z konieczności wymaga zakończenia hodowli i podaje masową makroskopową reologię próbki, a nie pomiary punktowe w złożonym mikrośrodowisku 3D guza. Rzeczywiście, wiele badań zilustrowało użyteczność interpretacji pomiarów ruchów sondy znacznikowej w lub wokół komórek rakowych lub nienowotworowych w celu pomiaru deformacji związanych z migracją komórek32, naprężeń mechanicznych wywołanych przez rozszerzającą się sferoidę33, reologii wewnątrzkomórkowej34,35 oraz do mapowania naprężeń mechanicznych i odkształceń w tkankach inżynieryjnych36 oraz związku między wielkością porów a prędkością inwazji37. Można zastosować inne techniki odpowiednie dla mikroreologii, takie jak mikroskopia sił atomowych (AFM), ale przede wszystkim do sondowania punktów na powierzchni próbki, a także mogą stwarzać problemy ze sterylnością hodowli, które komplikują pomiary podłużne38.

Tutaj opisujemy kompleksowy protokół obejmujący metody wzrostu sferoid nowotworowych 3D nadających się do transferu do ECM z wbudowanymi sondami fluorescencyjnymi do śledzenia cząstek wideo i metodami analizy dla niezawodnego mapowania zmian przestrzennych w mikroreologii w czasie w hodowli. W obecnym wdrożeniu modele 3D nowotworów są hodowane w formacie wielodołkowym w celu włączenia pomiarów mikroreologicznych do innych tradycyjnych testów (np. cytotoksyczności), którym ten format sprzyja. W tej reprezentatywnej ilustracji tej metodologii hodujemy in vitro sferoidy 3D przy użyciu komórek PANC-1, ustalonej linii komórkowej raka trzustki, o której wiadomo, że tworzy sferoidy39, ale wszystkie pomiary opisane w niniejszym dokumencie mają szerokie zastosowanie do badania guzów litych przy użyciu różnych linii komórkowych odpowiednich do hodowli 3D. Ponieważ metoda ta jest z natury oparta na obrazowaniu, idealnie nadaje się do jednoczesnej rejestracji danych mikroreologicznych o wysokiej rozdzielczości z dużymi polami widzenia światła przechodzącego, które zgłaszają zmiany we wzroście, migracji i fenotypie komórek. Implementacja PTM zintegrowanego w ten sposób z mikroskopią światła przechodzącego zakłada powtarzalne pozycjonowanie stolika mikroskopu, które jest zwykle dostępne w zmotoryzowanych, komercyjnych mikroskopach biologicznych epifluorescencji szerokokątnej. Opracowany poniżej protokół może być zaimplementowany za pomocą dowolnego rozsądnie wyposażonego automatycznego fluorescencyjnego mikroskopu biologicznego. Jest to metoda z natury wymagająca dużej ilości danych, która wymaga pozyskania gigabajtów danych z cyfrowej mikroskopii wideo do przetwarzania w trybie offline.

W poniższym protokole, Protokół 1 odnosi się do początkowego przygotowania sferoid guza, które jest tutaj opisane przy użyciu nakładki na agarozę, ale może być zastąpione różnymi innymi metodami, takimi jak techniki wiszącej kropli40 lub hodowli rotacyjnej41. Protokół 2 opisuje proces osadzania sferoid w rusztowaniu kolagenowym, chociaż alternatywnie, guzy 3D in vitro mogą być hodowane przez enkapsulację lub osadzanie ponownie zawieszonych komórek w ECM12,15, a nie pojedyncze, wstępnie uformowane, nieprzylegające sferoidy. Kolejne protokoły opisują procedury uzyskiwania pomiarów mikroreologicznych z rozdzielczością czasową poprzez odpowiednio pozyskiwanie i przetwarzanie danych z mikroskopii wideo. Przetwarzanie danych jest opisane za pomocą MATLAB, wykorzystując procedury open source dla PTM zbudowane na algorytmach pierwotnie opisanych przez Crockera i Griera42, które zostały również szeroko opracowane dla różnych platform oprogramowania (patrz http://www.physics.emory.edu/~weeks/idl/).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla sferoid nowotworowych

  1. Wymieszaj 10 ml wody klasy do hodowli komórkowych z 0,1 g agarozy, aby uzyskać 1% roztwór agarozy.
  2. Podgrzać roztwór agarozy do temperatury powyżej 70 °C (około 14 sekund w standardowej kuchence mikrofalowej lub przy użyciu płyty grzewczej) przed podaniem 40 μl roztworu agarozy do studzienki na 96-dołkowej płytce.
  3. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę podczas pobierania komórek przy użyciu standardowych technik.
  4. Użyj hemytometru, aby określić stężenie komórek w zawiesinie.
  5. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową do 1000 komórek/ml i dodać 100 μl tego rozcieńczenia do studzienki zawierającej utwardzone złoże agarozy.
  6. Umieścić próbkę na wytrząsarce na noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  7. Usunąć próbkę z wytrząsarki i dodać 100 μl pożywki do hodowli komórkowych.
  8. Inkubuj sferoidy, aż do osiągnięcia pożądanej średnicy. Na przykład po 9 dniach sferoida będzie miała średnicę około 450 μm. W tym czasie do studzienek można dodać świeże pożywki wzrostowe, ale należy unikać aspiracji, ponieważ spowoduje to usunięcie sferoidy.

2. Przygotowanie sferoid 3D Guz osadzonych w ECM

  1. Przygotuj stanowisko pracy z potrzebnymi materiałami w okapie z przepływem laminarnym.
  2. Przygotować rozcieńczoną mieszaninę fluorescencyjnych sond znacznikowych modyfikowanych karboksylanem o średnicy 1 μm, dodając 2 części sond podstawowych (2% ciał stałych) do 25 części sterylnej wody.
  3. Wyjmij butelkę z 3,1 mg/ml kolagenu bydlęcego z lodówki i umieść ją na lodzie.
  4. Porcję 125 μl kolagenu do pustej fiolki o pojemności 2 ml.
  5. Dodać 50 μl rozcieńczonego roztworu sondy znacznikowej do fiolki zawierającej kolagen i krótko odwirować, aby rozprowadzić sondy.
  6. Dodać 235 μl odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowych zawierającej czerwień fenolową (która zmieni kolor na żółty) o łączną objętość 410 ml i krótko przemieszać przed wyjęciem 205 ml (połowa całkowitej objętości) i umieszczeniem jej w nowej fiolce o pojemności 2 ml. Fiolka 1 będzie zawierała sferoid guza, a fiolka 2 będzie mieszaniną kontrolną.
  7. Dodać ~ 2 μl 1 M NaOH do fiolki 1, aby przywrócić roztwór do neutralnego pH (pożywka hodowlana zawierająca czerwień fenolową powinna powrócić do czerwieni). Należy pamiętać, że spowoduje to, że mieszanina zacznie się utwardzać, jeśli nie będzie trzymana na lodzie. Krótko zmieszać, a następnie natychmiast wrócić do stojaka na lód.
    UWAGA: Sferoida jest ledwo widoczna gołym okiem po 9 dniach hodowli, a jej usunięcie ze złoża agarozy jest delikatnym zadaniem. Korzystanie z mikroskopu preparacyjnego może być pomocne dla niektórych użytkowników. Utrzymanie integralności sferoidy podczas przenoszenia ma kluczowe znaczenie.
  8. Za pomocą końcówki pipety z szeroką szyjką delikatnie usuń 40 μl pożywki ze studzienki zawierającej sferoidę guza. Zachowaj te 40 μl podczas wykonywania następnego kroku.
  9. Sprawdź studnię, aby zobaczyć, czy sferoida została usunięta w poprzednim kroku. Jeśli tak, dodaj 40 μl zawierające sferoidę do fiolki 1. Jeśli nie, umieść 40 μl z powrotem w studzience i powtórz poprzedni krok.
  10. Delikatnie wymieszać fiolkę 1 (nie ryzykować wirowania, może to spowodować uszkodzenie sferoidy) przed przeniesieniem mieszaniny w porcjach 60 μl do trzech oddzielnych dołków na 96-dołkowej płytce. Po dodaniu mieszaniny sprawdź każdą studzienkę pod mikroskopem, aby określić, która studzienka zawiera sferoidę.
  11. Dodać ~2 μl 1 M NaOH i 40 μl pożywki do hodowli komórkowych do fiolki 2 i odwirować przed porcjowaniem 60 μl tej mieszaniny do pustego dołka na płytce 96-dołkowej i etykietowaniem jako kontrolą.
  12. Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C do utwardzania przez co najmniej 1 godzinę.

3. Skonstruuj siatkę punktów próbkowania i nagraj film w każdym punkcie

  1. Przenieść płytkę z próbką z inkubatora na stolik mikroskopowy. Odczekać 10 minut, aby próbka zrównoważyła się z temperaturą pokojową, jeżeli podgrzewany stage nie jest dostępny.
  2. Obserwuj próbkę za pomocą soczewek obiektywowych o małej mocy, aby upewnić się, że jest nienaruszona i gotowa do obrazowania. Określ położenie guza w studni.
  3. Zdecyduj, ile punktów próbkowania chcesz pobrać. Zazwyczaj 20 punktów próbkowania w każdym dołku, rozmieszczonych w koncentrycznych pierścieniach wokół sferoidy, daje odpowiednio szczegółowe wyniki.
  4. Przesuń stolik do każdej żądanej pozycji i użyj oprogramowania do łączenia mikroskopów, aby zarejestrować współrzędne x i y (lub zarejestrować współrzędne ręcznie, jeśli oprogramowanie do łączenia jest niedostępne).
  5. Przełącz mikroskop na soczewkę obiektywu o dużej mocy (zwykle 100X) i wybierz odpowiednią kostkę filtrującą dla długości fali wzbudzenia sond znacznikowych. Użyj listy punktów utworzonych w kroku 3.4, aby przejść do pierwszego punktu w siatce.
  6. Dostosuj ostrość, aby znaleźć dno studzienki, a następnie przesuń w górę, aby znaleźć pole widzenia (fov) zawierające kilka ostrych sond śledzących.
  7. Obserwuj histogram intensywności i dostosuj intensywność i czas ekspozycji, aby uzyskać jak największy zakres dynamiki, jednocześnie upewniając się, że obraz nie zostanie nasycony.
  8. Uzyskaj sekwencję wideo z szybkością 20-30 ms na klatkę (zaleca się około 800 klatek lub 16-24 sekundy, aby zapewnić wystarczające statystyki do solidnych obliczeń MSD, zrównoważone potrzebą zminimalizowania czasu akwizycji w każdym punkcie siatki przestrzennej) i zapisz z odpowiednią konwencją. Podczas nagrywania nie dotykaj mikroskopu ani stołu.
  9. Powtórz kroki od 3.6 do 3.9 dla każdego punktu próbkowania w siatce.
  10. Powtórz kroki od 3.3 do 3.10 dla każdego dołka w eksperymencie.

4. Analizuj dane wideo, aby obliczyć właściwości reologiczne w każdym punkcie próbkowania

  1. Skopiuj wszystkie dane wideo do folderu analizy (prawdopodobnie na innym komputerze).
  2. Importuj dane obrazu do MATLAB lub innego oprogramowania analitycznego.
    UWAGA: Obszerna dokumentacja dotycząca zestawu przyjętych tutaj procedur śledzenia cząstek MATLAB jest dostępna pod adresem http://people.umass.edu/kilfoil. Zaleca się użycie niestandardowej funkcji wywoływania w celu zautomatyzowania przetwarzania wielu plików w różnych pozycjach.
  3. Skalibruj oprogramowanie, analizując kilka klatek wideo, aby odpowiednio określić parametry wyboru i odrzucenia (rozmiar, pasmo przepustowe itp.) w celu identyfikacji pozycji środkowej sondy. Obszerne tło tych kluczowych kroków zostało opisane przez Crockera i Griera.
  4. Użyj oprogramowania, aby automatycznie określić pozycję każdej sondy dla wszystkich klatek wideo, a następnie połączyć te pozycje w trajektorie.
  5. Użyj danych trajektorii, aby obliczyć średnie kwadratowe przemieszczenie (MSD) w funkcji czasu opóźnienia, upewniając się, że zastosowano odpowiedni współczynnik kalibracji przestrzennej (μm na piksel) dla konkretnej soczewki obiektywu, dowolnego łączenia pikseli itp. (zwykle przenoszonych w metadanych).
  6. Oblicz G*(używając uogólnionej relacji Stokesa-Einsteina z uwzględnieniem granic stosowalności GSER dla określonej próbki24,28,43. Alternatywnie, użytkownicy mogą chcieć interpretować właściwości ECM bezpośrednio z MSD, po prostu porównując skalowanie prawa potęgowego, wartości plateau, wskaźniki niejednorodności lub inne parametry.
  7. Powtórz kroki od 4.2 do 4.6 dla każdego pola widzenia w eksperymencie.
  8. Współrejestruj dane o położeniu z kroku 3.4 z modułami lepkosprężystości przy określonej częstotliwości będącej przedmiotem zainteresowania. W zależności od producenta używanego mikroskopu, etap ten może być ułatwiony przez niestandardową procedurę, która odczytuje metadane mikroskopu lub dane dotyczące położenia mogą być ręcznie zestawione w tabeli.
  9. Użyj funkcji interpolacji 3D, aby wygenerować przestrzenną mapę reologiczną ECM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zweryfikować poprawność pomiarów G*(ω) w lokalnych pozycjach w obrębie złożonego modelu mikrośrodowiska guza, przeprowadzono dwa wstępne eksperymenty walidacyjne. Po pierwsze, dążono do walidacji pomiarów w odniesieniu do „złotego standardu”, jakim jest objętościowa reometria ścinania oscylacyjnego. Przygotowano identyczne próbki matrycy kolagenowej (bez komórek) o stężeniu 1,0 mg/ml kolagenu. Próbki te badano za pomocą reometru objętościowego (TA Instruments AR-G2, stosując geometrię równoległych płyt o śre...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym protokole wprowadzamy solidną i szeroko stosowaną strategię śledzenia wzdłużnego lokalnych zmian sztywności ECM w modelach 3D nowotworów. Przewidujemy, że ta metodologia może zostać przyjęta przez biologów nowotworów i biofizyków zainteresowanych mechanowrażliwym zachowaniem związanym z przebudową macierzy podczas procesów wzrostu i inwazji guza. Precyzyjna kwantyfikacja kinetyki degradacji matrycy może być szczególnie cenna dla osób badających aktywność metaloproteaz macierzy, oksydazy lizylowej lub innych istotny...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Z wdzięcznością dziękujemy za udostępnienie kodu śledzenia cząstek MATLAB na otwartym kodzie źródłowym dostarczonego przez Marię Kilfoil (http://people.umass.edu/kilfoil/), wraz z wcześniejszym kodem IDL i obszerną dokumentacją dostarczoną przez Johna C. Crockera i Erica R. Weeksa. Prace te były możliwe dzięki finansowaniu z National Cancer Institute (NCI/NIH), K99CA155045 and R00CA155045 (PI: JPC).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kolagen bydlęcy typu 1BD Biosciences, San Jose, Kalifornia354231
PANC-1Hodowla komórek typu amerykańskiego, Manassas, VACRL1469lub inny odpowiedni typ komórki
Mikrosfery fluorescencyjneLife Technologies, Carlsbad, CA906906
MatrigelBD Biosciences, Bedford, MA354230
AgarozaFisher Bioodczynniki, Waltham, MAC12H18O9
NaOHFisher Bioreagents, Waltham, MANC0480985
96-dołkowe płytki obrazoweCorning Inc., Corning, NY3904
DMEMHyclone, Waltham, MASH30243.01lub odpowiednie podłoża do hodowli komórkowych
Mikroskop Zeiss AxioObseverZeiss, Oberkochen, Niemcyzawiera szybką kamerę i oprogramowanie do obrazowania
Oprogramowanie MATLABThe Mathworks, Natick, MA

Bibliografia

  1. Bissell, M. J., et al. Tissue structure, nuclear organization, and gene expression in normal and malignant breast. Cancer Res. 59, 1757-1763 (1999).
  2. Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, and metastasis: the force journey of a tumor cell. Cancer metastasis reviews. 28, 113-127 (2009).
  3. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell. 8, 241-254 (2005).
  4. Bershadsky, A. D., Balaban, N. Q., Geiger, B. Adhesion-dependent cell mechanosensitivity. Annual review of cell and developmental biology. 19, 677-695 (2003).
  5. Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474, 179-183 (2011).
  6. Ingber, D. E. Tensegrity-based mechanosensing from macro to micro. Prog Biophys Mol Biol. 97, 163-179 (2008).
  7. Peyton, S. R., Ghajar, C. M., Khatiwala, C. B., Putnam, A. J. The emergence of ECM mechanics and cytoskeletal tension as important regulators of cell function. Cell Biochem Biophys. 47, 300-320 (2007).
  8. Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J Cell Sci. 116, 2377-2388 (2003).
  9. Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signaling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 287-309 (2006).
  10. Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. A tense situation: forcing tumour progression. Nat Rev Cancer. 9, 108-122 (2009).
  11. Assoian, R. K., Klein, E. A. Growth control by intracellular tension and extracellular stiffness. Trends Cell Biol. 18, 347-352 (2008).
  12. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat Methods. 4, 359-365 (2007).
  13. Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nature reviews. Cancer. 5, 675-688 (2005).
  14. Ulrich, T. A., Jain, A., Tanner, K., MacKay, J. L., Kumar, S. Probing cellular mechanobiology in three-dimensional culture with collagen-agarose matrices. Biomaterials. 31, 1875-1884 (2010).
  15. Abu-Yousif, A. O., Rizvi, I., Evans, C. L., Celli, J. P., Hasan, T. PuraMatrix encapsulation of cancer cells. J. Vis. Exp. (34), e1692(2009).
  16. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
  17. Celli, J. P., Rizvi, I., Evans, C. L., Abu-Yousif, A. O., Hasan, T. Quantitative imaging reveals heterogeneous growth dynamics and treatment-dependent residual tumor distributions in a three-dimensional ovarian cancer model. J Biomed Opt. 15, 051603-051610 (2010).
  18. Rizvi, I., et al. Synergistic Enhancement of Carboplatin Efficacy with Photodynamic Therapy in a Three-Dimensional Model for Micrometastatic Ovarian Cancer. Cancer Res. 70, 9319-9328 (2010).
  19. Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels. J. Vis. Exp. (42), e2089(2010).
  20. Kenny, H. A., Lengyel, E. MMP-2 functions as an early response protein in ovarian cancer metastasis. Cell Cycle. 8, (2009).
  21. Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin. J Clin Invest. 118, 1367-1379 (2008).
  22. Lee, J. M., Dedhar, S., Kalluri, R., Thompson, E. W. The epithelial-mesenchymal transition: new insights in signaling, development, and disease. J Cell Biol. 172, 973-981 (2006).
  23. Mason, T. G., Weitz, D. A. Optical Measurements of Frequency-Dependent Linear Viscoelastic Moduli of Complex Fluids. Physical Review Letters. 74, 1250(1995).
  24. Mason, T. G., Ganesan, K., van Zanten, J. H., Wirtz, D., Kuo, S. C. Particle Tracking Microrheology of Complex Fluids. Physical Review Letters. 79, 3282-3285 (1997).
  25. Crocker, J. C., et al. Two-Point Microrheology of Inhomogeneous Soft Materials. Physical Review Letters. 85, 888(2000).
  26. Valentine, M. T., et al. Investigating the microenvironments of inhomogeneous soft materials with multiple particle tracking. Physical Review E. 64, 061506(2001).
  27. Helfer, E., et al. Microrheology of Biopolymer-Membrane Complexes. Physical Review Letters. 85, 457(2000).
  28. Levine, A. J., Lubensky, T. C. One- and Two-Particle Microrheology. Physical Review Letters. 85, 1774(2000).
  29. Jonas, M., Huang, H., Kamm, R. D., So, P. T. Fast fluorescence laser tracking microrheometry, II: quantitative studies of cytoskeletal mechanotransduction. Biophys J. 95, 895-909 (2008).
  30. Celli, J., et al. Viscoelastic properties and dynamics of porcine gastric mucin. Biomacromolecules. 6, 1329-1333 (2005).
  31. Pelletier, V., Gal, N., Fournier, P., Kilfoil, M. L. Microrheology of microtubule solutions and actin-microtubule composite networks. Phys Rev Lett. 102, 188303(2009).
  32. Bloom, R. J., George, J. P., Celedon, A., Sun, S. X., Wirtz, D. Mapping local matrix remodeling induced by a migrating tumor cell using three-dimensional multiple-particle tracking. Biophys J. 95, 4077-4088 (2008).
  33. Gordon, V. D., et al. Measuring the mechanical stress induced by an expanding multicellular tumor system: a case study. Exp Cell Res. 289, 58-66 (2003).
  34. Li, Y., Schnekenburger, J., Duits, M. H. Intracellular particle tracking as a tool for tumor cell characterization. J Biomed Opt. 14, 064005(2009).
  35. Tseng, Y., Kole, T. P., Wirtz, D. Micromechanical Mapping of Live Cells by Multiple-Particle-Tracking Microrheology. Biophysical Journal. 83, 3162-3176 (2002).
  36. Gjorevski, N., Nelson, C. M. Mapping of Mechanical Strains and Stresses around Quiescent Engineered Three-Dimensional Epithelial Tissues. Biophysical Journal. 103, 152-162 (2012).
  37. Yang, Y. L., Motte, S., Kaufman, L. J. Pore size variable type I collagen gels and their interaction with glioma cells. Biomaterials. 31, 5678-5688 (2010).
  38. Ludwig, T., Kirmse, R., Poole, K., Schwarz, U. S. Probing cellular microenvironments and tissue remodeling by atomic force microscopy. Pflugers Archiv : European journal of physiology. 456, 29-49 (2008).
  39. Sipos, B., et al. A comprehensive characterization of pancreatic ductal carcinoma cell lines: towards the establishment of an in vitro research platform. Virchows Archiv : an international journal of pathology. 442, 444-452 (2003).
  40. Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol Med. 140, 141-151 (2007).
  41. Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Semin Cancer Biol. 15, 365-377 (2005).
  42. Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of Digital Video Microscopy for Colloidal Studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179, 298-310 (1996).
  43. Savin, T., Doyle, P. S. Static and Dynamic Errors in Particle Tracking Microrheology. Biophysical Journal. 88, 623-638 (2005).
  44. Evans, C. L., et al. Killing hypoxic cell populations in a 3D tumor model with EtNBS-PDT. PLoS ONE. 6, e23434(2011).
  45. Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111, 29-40 (2002).
  46. Celli, J. P., et al. Helicobacter pylori moves through mucus by reducing mucin viscoelasticity. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 14321-14326 (2009).
  47. Bansil, R., Celli, J. P., Hardcastle, J. M., Turner, B. S. The Influence of Mucus Microstructure and Rheology in Helicobacter pylori Infection. Frontiers in immunology. 4, 310(2013).
  48. Furst, E. M. Applications of laser tweezers in complex fluid rheology. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 10, 79-86 (2005).
  49. Gosse, C., Croquette, V. Magnetic Tweezers: Micromanipulation and Force Measurement at the Molecular Level. Biophysical Journal. 82, 3314-3329 (2002).
  50. Dembo, M., Wang, Y. -L. Stresses at the Cell-to-Substrate Interface during Locomotion of Fibroblasts. Biophysical Journal. 76, 2307-2316 (1999).
  51. Franck, C., Maskarinec, S. A., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Three-dimensional traction force microscopy: a new tool for quantifying cell-matrix interactions. PLoS ONE. 6, e17833(2011).
  52. Celli, J. P., Petrovic, L., Massdodi, I., Rizvi, I., Hasan, T. Overcoming therapeutic resistance in pancreatic cancer is not a simple mix of PDT and chemotherapy: Evaluation of PDT-chemotherapy combinations in 3D tumor models. Proc SPIE. , 85680R-85680R (2013).
  53. Glidden, M. D., et al. Image-Based Quantification of Benzoporphyrin Derivative Uptake, Localization, and Photobleaching in 3D Tumor Models, for Optimization of PDT Parameters. Theranostics. 2, 827-839 (2012).
  54. Celli, J. P., et al. An imaging-based platform for high-content, quantitative evaluation of therapeutic response in 3D tumour models. Scientific reports. 4, 3751-3710 (2014).
  55. Celli, J. P. Stromal interactions as regulators of tumor growth and therapeutic response: A potential target for photodynamic therapy. Israel journal of chemistry. 52, 757-766 (2012).
  56. Garber, K. Stromal depletion goes on trial in pancreatic cancer. J Natl Cancer Inst. 102, 448-450 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tr jwymiarowe modele nowotwor wrak trzustkirusztowanie kolagenowefluorescencyjne sondy ledz ceuog lniona relacja Stokesa Einsteinamodu cinania lepkospr ystegomonitorowanie pod u nemechaniczne mikro rodowisko

Powiązane artykuły