Ocena wydajności funkcjonalnej w modelu myszy Mdx

Summary

Podstawową miarą wyników w badaniach klinicznych dotyczących zaburzeń nerwowo-mięśniowych jest ogólna poprawa funkcji mięśni. Dlatego ocena wpływu potencjalnych związków terapeutycznych na wydajność mięśni przed klinicznym badaniem w modelach mysich ma ogromne znaczenie. Poniżej opisujemy kilka testów funkcjonalnych, aby rozwiązać ten problem.

Abstract

Dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD) jest ciężkim i postępującym zaburzeniem zaniku mięśni, na które nie ma lekarstwa. Niemniej jednak kilka potencjalnych związków farmaceutycznych i podejść do terapii genowej przeszło do badań klinicznych. Ponieważ poprawa funkcji mięśni jest najważniejszym punktem końcowym w tych badaniach, duży nacisk położono na ustanowienie wiarygodnych, powtarzalnych i łatwych do wykonania testów funkcjonalnych w celu przedklinicznej oceny funkcji, siły, kondycji i koordynacji mięśni w mysim modelu mdx dla DMD. Dostępne są zarówno testy inwazyjne, jak i nieinwazyjne. Testy, które nie zaostrzają choroby, mogą być wykorzystane do określenia naturalnego przebiegu choroby i skutków interwencji terapeutycznych (np. test siły chwytu kończyn przednich, dwa różne testy zwisania z użyciem drutu lub siatki i bieg rotarod). Alternatywnie, wymuszone bieganie na bieżni może być stosowane w celu przyspieszenia postępu choroby i/lub oceny ochronnego wpływu interwencji terapeutycznych na patologię choroby. Poniżej opisujemy, jak wykonać te najczęściej stosowane testy funkcjonalne w sposób rzetelny i powtarzalny. Korzystanie z tych protokołów w oparciu o standardowe procedury operacyjne umożliwia porównywanie danych między różnymi laboratoriami.

Introduction

Dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD) jest najczęstszym zaburzeniem nerwowo-mięśniowym dotykającym 1:5 000 nowonarodzonych chłopców. Ta ciężka i postępująca choroba zaniku mięśni jest spowodowana mutacjami w genie DMD, które zakłócają otwartą ramę odczytu i uniemożliwiają syntezę funkcjonalnego białka dystrofiny. Włókna mięśniowe pozbawione dystrofiny są podatne na uszkodzenia wywołane wysiłkiem fizycznym. Po wyczerpaniu zdolności regeneracyjnych mięśni i z powodu przewlekłego zapalenia uszkodzonego mięśnia, włókna są zastępowane tkanką łączną i tłuszczem, co w konsekwencji prowadzi do utraty funkcji. Ogólnie rzecz biorąc, pacjenci z DMD tracą zdolność poruszania się kończyn dolnych na początku drugiej dekady. Później dotknięte są również mięśnie ramion i obręczy barkowej, a pacjenci często rozwijają skoliozę piersiowo-lędźwiową z powodu asymetrycznego osłabienia mięśni podtrzymujących rdzeń kręgowy. Wentylacja wspomagana jest zwykle wymagana pod koniec lat nastoletnich lub na początku lat dwudziestych. Niewydolność oddechowa i niewydolność serca prowadzą do śmierci w trzeciej lub czwartej dekadzie¹.

Chociaż gen sprawczy został odkryty ponad 25 lat temu², nie ma dostępnego lekarstwa na DMD. Jednak poprawa opieki zdrowotnej i stosowanie kortykosteroidów wydłużyły oczekiwaną długość życia w świecie zachodnim³. Dzięki wykorzystaniu modeli zwierzęcych, takich jak mysz mdx, poczyniono duże kroki naprzód w kierunku odkrycia potencjalnych strategii terapeutycznych. Mysz mdx jest najczęściej używanym modelem myszy DMD. Ma mutację punktową w eksonie 23 mysiego genu Dmd i w związku z tym brakuje mu dystrofiny⁴. W ciągu ostatnich kilku lat wiele zaproponowanych strategii przekształciło się w badania kliniczne^5-9. W tych badaniach poprawa funkcji mięśni jest pierwszorzędowym punktem końcowym, co podkreśla znaczenie testowania korzyści związków na funkcjonowanie mięśni u myszy na etapie przedklinicznym testów.

Podobnie jak pacjenci z DMD, również włókna mięśniowe ujemne dystrofinami myszy mdx są podatne na uszkodzenia wywołane wysiłkiem fizycznym, a ich funkcja mięśni jest upośledzona w porównaniu do myszy dzikiego typu C57BL/10ScSnJ. Upośledzenie to można ocenić za pomocą różnych testów funkcjonalnych. Niektóre z tych badań są nieinwazyjne i nie ingerują w patologię mięśni (np. siła chwytu kończyn przednich, testy zwisania i bieganie rotarod). Dlatego mogą być wykorzystywane do monitorowania naturalnej historii choroby lub określania wpływu związków na postęp choroby. Aby uzyskać dogłębny obraz wpływu związków na funkcję mięśni u myszy mdx, można zastosować reżim testów funkcjonalnych, który nie zakłóca postępu choroby, składający się ze wszystkich tych testów¹⁰.

Alternatywnie, wymuszone bieganie na bieżni może być użyte do celowego zaostrzenia postępu choroby i przetestowania zdolności ochronnych związków¹¹. Bieżnia może być również używana jako miara wyniku, w której mierzy się czas biegu do wyczerpania¹², lub jako narzędzie do zmęczenia myszy mdx, aby osiągały gorsze wyniki w kolejnym teście funkcjonalnym, zapewniając większe różnice w wydajności między grupami leczenia¹³. Wybierając testy funkcjonalne, należy mieć na uwadze ich wpływ na postęp choroby, zwłaszcza podczas testowania myszy dystroficznych, takich jak mysz mdx ¹⁴.

Tutaj szczegółowo opisujemy, jak przeprowadzić najczęściej używane testy funkcjonalne w niezawodny i powtarzalny sposób w oparciu o dostępne standardowe procedury operacyjne z sieci TREAT-NMD. Kliknij tutaj, aby odwiedzić stronę TREAT-NMD.

Protocol

Opisane tutaj eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt (DEC) Centrum Medycznego Uniwersytetu w Lejdzie (LUMC). Myszy zostały wyhodowane przez ośrodek dla zwierząt LUMC i trzymane w indywidualnie wentylowanych klatkach z 12-godzinnymi cyklami światła i ciemności. Mieli oni ad libitum dostęp do wody i standardowej karmy.

Podczas wykonywania któregokolwiek z opisanych poniżej testów funkcjonalnych, warunki eksperymentalne muszą być ściśle kontrolowane, aby zmniejszyć zmienność. Najlepiej używać myszy dopasowanych do wieku i płci, ponieważ wydajność różni się w zależności od wieku i płci. Myszy należące do tego samego miotu powinny być losowo przydzielane do grup eksperymentalnych. Zwierzęta powinny być badane przez ten sam podmiot, który jest ślepy na grupy doświadczalne. Testy powinny być wykonywane o tej samej porze dnia i w ten sam dzień powszedni, w tym samym pomieszczeniu, aby wyrównać zapachy, hałasy itp.14 Duże różnice między poszczególnymi myszami i punktami czasowymi można zaobserwować dla wszystkich testów funkcjonalnych, dlatego należy użyć 6-8 myszy / grupę eksperymentalną. Wyniki testów funkcjonalnych mogą się również znacznie różnić między różnymi szczepami wsobnymi typu dzikiego. Dlatego eksperymentalne i kontrolne myszy typu dzikiego powinny zawsze mieć odpowiednie tła (w przypadku myszy mdx należy użyć szczepu C57BL/10ScSnJ typu dzikiego). Wszystkie opisane tutaj dane zostały uzyskane z użyciem szczepu C57BL/10ScSnJ typu dzikiego, który od tego momentu nazywamy typem dzikim. Opisane tutaj testy mogą być stosowane podłużnie od co najmniej 1-19 miesiąca życia u myszy mdx i dzikich typów. Testy nie powinny być powtarzane częściej niż raz w tygodniu, aby myszy nie straciły zainteresowania i chęci do wykonania zadania.

1. Test siły chwytu kończyn przednich

Użyj testu siły chwytu kończyn przednich, aby zmierzyć siłę kończyn przednich. Test opiera się na tendencji myszy do instynktownego chwytania siatki, gdy jest zawieszona na ogonie¹⁵ i jest zaadaptowany z DMD_M2.2.001.pdf.

1. Konfiguracja aparatury: Przymocuj siatkę do przetwornika siły, który mierzy maksymalną siłę wywieraną przez mysz na siatkę podczas ciągnięcia. Upewnij się, że ustawienie jest włączone w trybie szczytowego napięcia (T-PK) do ciągnięcia. Jednostki siły można regulować w uncjach siły, gramach siły, funtach siły, kilogramach siły lub niutonach.
   Uwaga: Preferujemy pracę z gramami jako jednostką wartości. Na rynku dostępnych jest wiele mierników, ale tylko przetworniki osiowe dają wiarygodne wyniki, ponieważ na przetworniki siły typu dźwigniowego negatywnie wpływają prawa fizyczne efektu dźwigni. W przypadku prętów o średnicy 1-2 mm można użyć nieelastycznej siatki lub trójkąta.
2. Przed badaniem należy ocenić masę ciała myszy, aby umożliwić normalizację masy ciała.
3. Użyj gramów jako jednostki wartości. Zresetuj miernik na początku każdego nagrania.
4. Wyjmij mysz z klatki, chwytając ogon i przesuwając go poziomo w kierunku siatki.
5. Sprawdź, czy mysz mocno chwyta siatkę obiema przednimi łapami.
6. Odciągnij mysz od siatki, aby jej uchwyt został zerwany; największa siła przyłożona do siatki zostanie pokazana na wyświetlaczu przetwornika, który może być rejestrowany ręcznie lub automatycznie.
7. Weź pod uwagę tylko pociągnięcia, w których mysz wykazuje opór wobec eksperymentatora. Odrzuć środki, w których użyto tylko jednej przedniej łapy lub tylnych kończyn i w których mysz obracała się podczas ciągnięcia.
8. Pozwól myszy pociągnąć za siatkę trzy razy z rzędu, a następnie włóż ją z powrotem do klatki na okres odpoczynku trwający co najmniej jedną minutę. Uwaga: pomiędzy seriami pociągnięć konieczny jest okres odpoczynku, aby mysz mogła się zregenerować i uniknąć wytworzenia nawyków.
9. Następnie pozwól myszy wykonać cztery serie pociągnięć, z których każde następuje krótki okres odpoczynku. W ten sposób mysz przeciągnęła w sumie 15x (3 pociągnięcia x 5 razy = 15 pociągnięć).
10. Określ maksymalną siłę chwytu i znormalizuj masę ciała, biorąc średnią z trzech najwyższych wartości z 15 zebranych wartości.
11. Opcjonalnie: Określ zmęczenie, obliczając spadek między średnią z pierwszych dwóch a dwiema ostatnimi seriami pociągnięć 1 + 2 + 3 = A, 4 + 5 + 6 = B, 10 + 11 + 12 = C i 13 + 14 + 15 = D. Wzór: (C+D)/(A+B) daje wartość 1 dla myszy, które nie są zmęczone. Można to wyrazić w procentach, tak że mysz bez zmęczenia ma wartość 0%, a mysz, której kończyny przednie są całkowicie zmęczone, ma wartość 100%.

2. Wiszące testy

Za pomocą testów wiszących można ocenić równowagę, koordynację i kondycję mięśni. Testy te opierają się na wiedzy, że myszy są chętne do pozostania wiszącymi na drucie lub siatce aż do wyczerpania¹⁶. Istnieją dwa charakterystyczne testy zwisu, w których na początku badania wykorzystuje się tylko dwie kończyny przednie lub wszystkie cztery kończyny, przy użyciu odpowiednio drutu lub siatki. Test wiszący z użyciem drutu i siatki to najdłuższa metoda czasu zawieszenia zaadaptowana odpowiednio z DMD_M.2.1.004.pdf i DMD_M.2.1.005.pdf. Stosowany jest stały limit zawieszenia wynoszący 600 sekund. Większość myszy typu dzikiego może wisieć przez 600 sekund, podczas gdy myszy dystroficzne nie. Aby skrócić czas poświęcany na wykonanie tego testu, ustalono maksymalny czas zawieszenia. Myszy, które wcześniej spadną z drutu lub siatki, otrzymują do dwóch dodatkowych prób. Ma to na celu upewnienie się, że myszy naprawdę nie są w stanie się zawiesić i nie upadają z powodu niezdarności.

1. Próba zwisania z dwiema kończynami
   1. Ustawienie aparatury: Mocno przymocuj wieszak z metalowej tkaniny o grubości 2 mm do półki za pomocą taśmy i trzymaj wieszak około 37 cm nad warstwą pościeli. Uwaga: alternatywnie można użyć metalowego drutu o szerokości 55 cm i grubości 2 mm, który jest szczelnie przymocowany między 2 pionowymi stojakami. Odległość 37 cm jest wystarczająca, aby zachęcić myszy do pozostania w zawieszeniu, ale także wystarczająco niska, aby zapobiec urazom myszy podczas upadku. Przewód nie powinien wibrować ani przemieszczać się podczas testu, ponieważ może to zakłócać działanie myszy.
   2. Trzymaj mysz za ogon i zbliż ją do drutu.
   3. Niech mysz chwyci drut tylko dwiema przednimi łapami i opuść tylne kończyny w taki sposób, aby mysz wisiała tylko z dwiema przednimi łapami na drucie (Rysunek 2B).
   4. Uruchom stoper bezpośrednio po zwolnieniu przycisku myszy. Po uwolnieniu silne myszy próbują złapać drut wszystkimi czterema kończynami i ogonem, co jest dozwolone (ryc. 2C).
   5. Gdy mysz zachowuje się niewłaściwie (np. balansuje na drucie lub celowo zeskakuje z drutu, jak pokazano na rysunkach 2D i 2E), zajmij się tym bezpośrednio, wymieniając mysz na przewodzie bez zatrzymywania timera.
   6. Gdy mysz spadnie z drutu, zatrzymaj minutnik i nagraj czas zawieszenia.
   7. Kiedy myszy będą w stanie wisieć przez 600 sekund, zdejmij je z drutu i włóż z powrotem do klatki. Myszy, które wypadną poniżej tego limitu, otrzymują maksymalnie dwie dodatkowe próby.
   8. Należy zapisać maksymalny czas zawieszenia (tj. najdłuższy czas próby) i wykorzystać go do dalszej analizy.
2. Test wiszący z czterema kończynami
   1. Konfiguracja aparatury: Do tego testu użyj ręcznie wykonanego kwadratu lub pokrywy dużej klatki dla szczura lub królika. Umieść siatkę 25 cm nad miękką ściółką, aby zapobiec zranieniu się myszy po upadku, ale także zniechęcić myszy do celowego zeskakiwania z siatki. Mocno zabezpiecz siatkę, aby eksperymentator nie musiał ręcznie przytrzymywać siatki podczas eksperymentu, ponieważ te ruchy mogą zakłócać działanie myszy.
   2. Umieść mysz na siatce tak, aby chwyciła ją czterema łapami.
   3. Odwróć siatkę tak, aby mysz wisiała i bezpośrednio uruchom stoper.
   4. Sesja testowa kończy się dla myszy, które są w stanie zawiesić się na czas 600 sekund. Daj myszom, które wcześniej wypadną z siatki, maksymalnie dwie dodatkowe próby.
   5. Do dalszej analizy należy wykorzystać maksymalny czas zawieszenia (tj. najdłuższy czas trwania próby).

3. Bieganie Rotarod

Za pomocą testu rotarod można określić siłę mięśni, koordynację, równowagę i kondycję¹⁷.

1. Konfiguracja aparatury: W tym teście myszy muszą biegać na obracającej się rurce. Upewnij się, że stała prędkość jest ustawiona na 5 obrotów na minutę (obr./min) i że prędkość wzrasta od 5 do 45 obr./min w ciągu pierwszych 15 sekund po uruchomieniu. Po tym musi utrzymać swoją prędkość.
2. Umieść myszy na rurze rotarodu, gdy obraca się on z wolną, stałą prędkością 5 obr./min. Jednocześnie można testować pięć myszy.
3. Rozpocznij bieg, gdy wszystkie myszy zostaną ustawione. W ciągu pierwszych 15 sekund prędkość rury przyspiesza od 5 do 45 obr./min, po czym utrzymuje tę prędkość.
4. Monitoruj przebieg. Czas pracy jest w sposób ciągły rejestrowany przez oprogramowanie. Czas pracy zatrzymuje się automatycznie, gdy mysz spadnie z rury, ponieważ aktywuje to pasek czasu umieszczony pod rurką. Zmień położenie myszy, które obracają się w przeciwnym kierunku na rurze podczas biegu, bez zatrzymywania rurki w celu obrócenia się.
5. Zakończ sesję testową dla myszy, które są w stanie biegać przez czas 500 sekund. Daj myszom maksymalnie dwie dodatkowe próby, co pozwoli im poprawić czas biegu, gdy upadną wcześniej.
6. Do dalszej analizy należy wykorzystać maksymalny czas trwania (tj. najdłuższy czas trwania próby).

4. Ćwiczenie na bieżni

Bieżnia może być używana na trzy sposoby jako narzędzie w badaniach przedklinicznych. Po pierwsze, wymuszone bieganie na bieżni może być wykorzystane do zaostrzenia patologii choroby, jak opisano w tym protokole (zobacz również: DMD_M2.1.001.pdf). Po drugie, można ocenić maksymalną zdolność do biegania myszy i wpływ leczenia na to (zobacz metodę pozwalającą myszom biegać aż do wyczerpania DMD_M.2.1.003.pdf). Wreszcie, bieganie na bieżni może być używane przed kolejnym testem funkcjonalnym, aby wyczerpać mysz, aby działała gorzej w drugim teście¹³. Odbywa się to poprzez ćwiczenie myszy dwa lub trzy razy w tygodniu, jak opisano poniżej, po czym bezpośrednio następuje jeden z testów funkcjonalnych opisanych w protokole 1-3.

1. Konfiguracja aparatury: Na rynku dostępnych jest kilka bieżni, na których kilka myszy może biegać jednocześnie i dla których można regulować wysokość, czas trwania i prędkość. Niektóre bieżnie są wyposażone w siatkę, która dostarcza wstrząsy o niskiej intensywności, aby zachęcić myszy do biegania. Jednak myszy mdx są wrażliwe na stres i można je łatwo zmotywować w bardziej przyjazny sposób poprzez delikatne pchnięcie ręką w kierunku biegu. Dlatego zdecydowanie zaleca się, aby NIE używać siatki przeciwwstrząsowej. Ogólnie rzecz biorąc, stymulacja ręką jest potrzebna tylko podczas pierwszej sesji biegowej.
2. Umieść myszy na bieżni poziomej.
3. Uruchom bieżnię z prędkością biegu 12 m/min. Niższe prędkości (8 m/min) muszą być używane u starych myszy (>15 miesięcy), gdzie wyższe prędkości łatwo prowadzą do wyczerpania.
4. Podczas pierwszej sesji zachęcaj myszy do biegania, delikatnie popychając je, gdy są blisko końca pasa.
5. Gdy myszy będą biegać przez 30 minut, umieść je z powrotem w klatce.
6. Powtarzaj to dwa razy w tygodniu przez np. 12 tygodni.
7. W razie potrzeby zapewnij sobie okresy odpoczynku. Na przykład niektóre myszy mdx muszą przestać działać i powinny mieć możliwość odpoczynku przez kilka minut. Jeśli tak się stanie, wyłącz pasek, daj wszystkim myszom okres odpoczynku trwający dwie minuty, włącz pasek na dwie minuty z prędkością 4 m/min. Następnie zwiększ prędkość do 12 m/min i pozwól myszom dokończyć protokół. Ważne jest, aby wszystkie myszy ukończyły cały protokół biegowy.
   
   Uwaga: W przypadku, gdy myszy mdx potrzebują okresów odpoczynku, rozważ rozgrzewkę przed protokołem 30-minutowych ćwiczeń. Ta sesja rozgrzewkowa składa się z: 2-minutowego okresu aklimatyzacji z prędkością 4 m/min, po którym następuje 8-minutowa rozgrzewka z prędkością 8 m/min.
   
   
   W naszych rękach 4-16-tygodniowe samice myszy mdx są w stanie ukończyć 30-minutowy protokół ćwiczeń bez odpoczynku. Inni donieśli, że w dopasowanym wieku samcach myszy mdx, 45% myszy potrzebuje okresów odpoczynku, aby zakończyć ćwiczenie. Protokół rozgrzewki zmniejsza liczbę przystanków¹².

Results

Siła chwytu kończyn przednich u myszy dzikich i mdx wzrasta między 4-12 tygodniem życia i ponownie maleje u starszych myszy. Upośledzenie siły można już zaobserwować u młodych myszy mdx. Reprezentatywne dane 9-tygodniowych samic myszy przedstawiono na rysunkach 1A i 1B. Chociaż zmęczenie nie różni się jeszcze między szczepami w tym wieku, myszy mdx są słabsze niż myszy typu dzikiego. Nie mamy jeszcze danych na temat męczliwości u starszych myszy mdx i ...

Discussion

Przedstawione tutaj testy funkcjonalne są powtarzalne, łatwe do wykonania i mają zastosowanie do myszy typu dzikiego i dystroficznego niezależnie od ich wieku. Testy dostarczają użytecznych narzędzi do przedklinicznej oceny funkcji, siły, kondycji i koordynacji mięśni. Badając wpływ związku na naturalny przebieg choroby, opisane tutaj testy nieinwazyjne (siła chwytu kończyn przednich, zarówno testy wiszące, jak i test rotarod) można ładnie połączyć w reżim testów funkcjonalnych, w którym testy te są wykonywane w kolejnyc...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Miernik siły chwytu myszy	Chatillon DFE (odsprzedawany przez Columbus Instruments)	# 80529
Wiszące urządzenie z drutu na 2 kończyny	Wieszak na tkaninę lub urządzenie
Wiszący drut 4-ramienny urządzenie	Pokrywa klatki dla szczurów lub urządzenie
Rotarod	Ugo Basil	# 47600
Bieżnia dla myszy Exer 3/6	Columbus Instruments	# 1055SRM