W tym protokole opisujemy metody efektywnej transfekcji linii komórkowych mysich makrofagów za pomocą siRNA za pomocą 96-dołkowego systemu Amaxa Nucleofector Shuttle System, stymulacji makrofagów lipopolisacharydem i monitorowania wpływu na produkcję cytokin zapalnych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykorzystanie interferencji RNA do zbadania wrodzonej odpowiedzi immunologicznej u makrofagów myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Makrofagi są kluczowymi wrodzonymi komórkami odpornościowymi fagocytarnymi. Kiedy makrofagi napotykają patogen, wytwarzają białka i związki przeciwdrobnoustrojowe, które zabijają patogen, wytwarzają różne cytokiny i chemokiny do rekrutacji i stymulacji innych komórek odpornościowych oraz prezentują antygeny w celu stymulowania adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej. W związku z tym możliwość skutecznego manipulowania makrofagami za pomocą technik takich jak interferencja RNA (RNAi) ma kluczowe znaczenie dla naszej zdolności do zbadania tej ważnej wrodzonej komórki odpornościowej. Jednak transfekcja makrofagów może być technicznie trudna i może wykazywać nieefektywny knockdown genów wywołany przez RNAi. W tym protokole opisujemy metody efektywnej transfekcji dwóch linii komórkowych makrofagów myszy (RAW264.7 i J774A.1) za pomocą siRNA przy użyciu 96-dołkowego systemu Amaxa Nucleofector Shuttle System i opisujemy procedury maksymalizujące wpływ siRNA na knockdown genów. Ponadto opisane metody są przystosowane do pracy w formacie 96-dołkowym, co pozwala na prowadzenie badań średnio- i wysokoprzepustowych. Aby zademonstrować użyteczność tego podejścia, opisujemy eksperymenty, które wykorzystują RNAi do hamowania genów regulujących produkcję cytokin indukowaną lipopolisacharydami (LPS).
Wprowadzenie
W tym protokole opisujemy skuteczne metody hamowania genów w liniach komórkowych makrofagów myszy za pomocą siRNA i monitorujemy wpływ tych zabiegów na wrodzoną odpowiedź immunologiczną. Procedury te są wykonywane w formacie 96-dołkowym, co pozwala na badania przesiewowe RNAi w sposób średnio- lub wysokoprzepustowy.
W odpowiedzi na infekcję, ludzie wywołują natychmiastową wrodzoną odpowiedź immunologiczną i wolniejszą, ale bardziej specyficzną adaptacyjną odpowiedź immunologiczną. Ta szybka wrodzona odpowiedź immunologiczna obejmuje rekrutację i aktywację fagocytarnych wrodzonych komórek odpornościowych, w tym makrofagów1. Klasyc....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Utrzymanie linii komórkowych makrofagów
- Hoduj linie komórkowe RAW264.7 i J774A.1 w DMEM uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w temperaturze 37 ºC w obecności 5% CO2 . Aby pomóc w utrzymaniu bezpłodności, dodaj 1% penicyliny/streptomycyny (wstrzykiwacz/paciorkowiec) do pożywki (chociaż nie jest to absolutnie konieczne).
- Krok krytyczny: Upewnij się, że makrofagi rosną w zdrowym stanie, aby zapewnić wydajną transfekcję i knockdown genu wywołany przez siRNA. Używaj komórek między pasażami 3 i 10 po świeżym rozmrożeniu, ponieważ te linie makrofagów wykazują najlepszą skuteczność transfekcji i utrzymują solidną....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby wykazać skuteczność transfekcji z zastosowaniem tej metody, monitorowano pobieranie siRNA znakowanego FITC przy użyciu cytometru przepływowego (Rysunek 1).
Aby zilustrować użyteczność naszego podejścia w monitorowaniu wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, do linii komórkowej makrofagów RAW264.7 transfektowano siRNA nakierowane na znane geny regulujące odporność wrodzoną, stymulowano komórki LPS, a następnie monitorowano produkcję cytokin prozapalnych IL-6 i TNFα. Różne TLR.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opublikowano liczne badania, w których poszczególne geny były celem siRNA w mysich makrofagach. Podczas gdy transfekcja za pośrednictwem lipidów została wykorzystana do indywidualnego dostarczania siRNA do linii komórkowych makrofagów, metody te mają potencjalny wpływ na żywotność, ograniczony knockdown genu i zmienność między genami. Aby opracować bardziej niezawodne testy, które można by wykorzystać do celowania w geny w sposób średnio- lub wysokoprzepustowy, zoptymalizowaliśmy techniki przy użyciu 96-dołkowego systemu.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych. Ten artykuł był sponsorowany przez Lonza, Inc.
Podziękowania
Podziękowania dla Brada Lackforda za pomoc w optymalizacji niektórych technik opisanych w tym manuskrypcie.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Amaxa nucleofector 96-dołkowy system wahadłowy | Lonza | AAM-1001S | |
| Linia komórkowa Amaxa SF 96-dołkowy zestaw nukleofektorów | Lonza | V4SC-2096 | |
| RAW264.7 mysia linia komórkowa makrofagów | ATCC | TIB-71 | |
| J774A.1 mysia linia komórkowa makrofagów | ATCC | TIB-67 | |
| siGenome smartpool siRNA | Dharmacon | różni się w zależności od na genie | |
| Nieukierunkowana kontrolna pula siRNA | Dharmacon | D-001206-13-20 | |
| Fluorescencyjny oligo Block-iT do elektroporacji | Invitrogen | 13750062 | |
| Ultrapure E. coli O111:B4 LPS | Wykaz Laboratoria biologiczne | 421 | |
| DMEM, wysoki poziom glukozy | Invitrogen | 11995-065 | |
| RPMI-1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Roztwór penicyliny-streptomycyny (Pen/Strep) | Fisher | SV30010 | |
| 0,25% Trypsyna-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
| 96-dołkowe płytki do hodowli tkankowych | Fisher | 07-200-89 | |
| 96-dołkowe sterylne płytki z okrągłym dnem (niepowlekane) | Fisher | 07-200-745 | |
| Mysz IL-6 Duoset Zestaw ELISA | R& D Biosystems | DY406 | |
| Mysz TNFα Zestaw Duoset ELISA | R& D Biosystems | DY410 | |
| Dioctan fluoresceiny | Sigma-Aldrich | F7378 | |
| Bufor RLT | Qiagen | 79216 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74134 | |
| Zestaw do oznaczania fagocytozy Vybrant | Invitrogen | V-6694 |
Bibliografia
- Kaufmann, S. H. E., Medzhitov, R., Gordon, S. The innate immune response to infection. , ASM Press. (2004).
- Adams, D. O., Hamilton, T. A. The cell biology of macrophage activation. Annual review of immunology. 2, 283-318 (1984).
- Fujiwara, N., Kobayashi, K.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
