Method Article

Analiza reakcji przetwarzania RNA przy użyciu systemów bezkomórkowych: 3' końcowe rozszczepienie substratów pre-mRNA in vitro

DOI:

10.3791/51309

⸱

May 3rd, 2014

 ,  ,  , 
1Department of Infectious Diseases, The Scripps Research Institute, 2Department of Chemistry, City College of New York

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA polimeraza II syntetyzuje prekursorowy RNA, który wykracza poza koniec 3' dojrzałego mRNA. Koniec dojrzałego RNA jest generowany kotranskrypcyjnie, w miejscu dyktowanym przez sekwencje RNA, poprzez aktywność endonukleazy kompleksu rozszczepienia. Tutaj szczegółowo opisujemy metodę badania reakcji rozszczepienia in vitro.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Koniec 3' mRNA ssaków nie powstaje w wyniku nagłego zakończenia transkrypcji przez polimerazę RNA II (RNPII). Zamiast tego RNPII syntetyzuje prekursorowe mRNA poza końcem dojrzałych RNA, a aktywny proces aktywności endonukleazy jest wymagany w określonym miejscu. Rozszczepienie prekursorowego RNA zwykle następuje 10-30 nt poniżej miejsca konsensusu poliA (AAUAAAA) po dinukleotydach CA. Białka z kompleksu rozszczepienia, wieloczynnikowego kompleksu białkowego o masie około 800 kDa, osiągają tę specyficzną aktywność nukleazy. Specyficzne sekwencje RNA przed i za miejscem poliA kontrolują rekrutację kompleksu rozszczepienia. Bezpośrednio po rozszczepieniu pre-mRNA są poliadenylowane przez polimerazę poliA (PAP) w celu wytworzenia dojrzałych stabilnych wiadomości RNA.

Przetwarzanie końca 3' transkryptu RNA może być badane przy użyciu komórkowych ekstraktów jądrowych z określonymi radioznakowanymi substratami RNA. Podsumowując, długi, nienaruszony prekursor RNA znakowany 32P inkubuje się z ekstraktami jądrowymi in vitro, a rozszczepienie ocenia się za pomocą elektroforezy żelowej i autoradiografii. Gdy nastąpi prawidłowe rozszczepienie, wykrywa się i określa ilościowo krótszy 5-stopowy rozszczepiony produkt. W tym miejscu szczegółowo opisujemy test rozszczepienia, używając jako przykładu przetwarzania 3' końca mRNA HIV-1.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biosynteza najbardziej dojrzałych eukariotycznych wiadomości RNA (mRNA) wymaga kilku modyfikacji potranskrypcyjnych, takich jak capping, splicing i poliadenylacja. Modyfikacje te są na ogół sprzężone w celu zapewnienia prawidłowego przetwarzania1 i znacznego zwiększenia stabilności mRNA.

Formacja końca 3' pre-mRNA ssaków jest generowana przez endonukleolityczne rozszczepienie powstającego RNA, po którym następuje dodanie reszt adenylanowych do produktu rozszczepionego 5' przez polimerazę poli(A) (PAP)2-4. U ssaków rozszczepienie odbywa się za pomocą wieloskładnikowego kompleksu białkowego o masie około 800 kDa, który gromadzi się w określonych sekwencjach pre-RNA. Sekwencja sygnałowa poli(A), wysoce konserwatywna kanoniczna sekwencja heksanukleotydowa AAUAAA, kieruje miejsce rozszczepienia na około 10-30 nt w dół. To miejsce jest specyficznie rozpoznawane przez czynnik specyficzności rozszczepienia i poliadenylacji (CPSF), a podjednostka 73 kD CSPF zawiera aktywność endonukleazy. Czynnik stymulacji rozszczepienia (CstF) wiąże bardziej zdegenerowaną sekwencję pierwiastków bogatych w Gu lub U za miejscem poli(A). Do rozszczepienia wymagany jest również czynnik rozszczepienia ssaków I (CFIm) oraz czynnik rozszczepienia ssaków II (CFII). CFIm wiąże specyficzne miejsca UGUA(N) w elementach sekwencji (USEs), które zostały zdefiniowane dla wielu genów i wydają się być zaangażowane w ważne procesy fizjologiczne5-8.

In vitro, reakcje przetwarzania RNA są często analizowane przy użyciu radioznakowanych substratów RNA9-12. Mogą one być syntetyzowane przez transkrypcję odpływową z promotora bakteriofaga T7 lub SP6. Podczas badania miejsca poliadenylacji, które nie zostało wcześniej scharakteryzowane, konieczne jest użycie genomowego DNA, a nie cDNA, do wygenerowania substratu RNA, ponieważ ważne sekwencje dalsze mogą nie być obecne w cDNA. Zaprojektuj substraty tak, aby zawierały co najmniej 150 nt przed i 50 nt za miejscem rozszczepienia/końcem dojrzałego mRNA. Produkt łupliwości migruje szybciej niż podłoże; Ponieważ jednak inne fragmenty mogą być generowane przez niespecyficzne działanie nukleazy, specyficzność reakcji musi być weryfikowana przez jej zależność od prawidłowych sekwencji sygnałów przetwarzania. Dlatego substraty RNA z mutacją punktową w sekwencji AAUAAA (np. AAGAAA) służą jako negatywna kontrola reakcji rozszczepienia.

Biorąc pod uwagę, że niewielka ilość radioznakowanego RNA jest używana do reakcji rozszczepienia, RNazy obecne w dużej obfitości w większości ekstraktów jądrowych mogą być problematyczne i ograniczać wybór materiału wyjściowego do przygotowania ekstraktu. Komórki HeLa mają tendencję do zawierania niskich poziomów endogennych RNaz, a zatem dobrze radzą sobie w tych testach.

Endonukleolityczne rozszczepienie substratów RNA in vivo i in vitro następuje bezpośrednio po addycji poli(A), więc rozszczepiony produkt pośredni nie występuje w wykrywalnych ilościach. Dlatego, aby zbadać określoną sekwencję RNA lub białka biorące udział w reakcji rozszczepienia, przeprowadza się eksperymenty w warunkach, które uniemożliwiają wystąpienie poliadenylacji. Nie ma zależności rozszczepienia od poliadenylacji i odwrotnie, więc można zatrzymać poliadenylację bez szkody dla reakcji rozszczepienia. W ten sposób ATP jest zastępowany analogiem kończącym łańcuch, który nie ma grupy hydroksylowej 3', dzięki czemu tylko pojedynczy nukleotyd może zostać włączony w miejscu poli(A) i można wykryć tylko rozszczepiony RNA.

Biorąc pod uwagę złożoność i wysoki stopień szczegółowości tego typu testów, opisujemy szczegółowy protokół wideo do badania rozszczepienia endonukleolitycznego przez maszynerię rozszczepienia/Poly(A) prekursorów mRNA in vitro. Opisujemy, jak przygotować kompetentne ekstrakty jądrowe, wygenerować znakowane radioaktywnie substraty RNA, przeprowadzić reakcję rozszczepienia oraz przeanalizować i zinterpretować otrzymane produkty. Rysunek 1 przedstawia przykład substratowych RNA kodujących koniec 3' pre-mRNA HIV-1, które mają być użyte do testu rozszczepienia. Koniec 3' genomu RNA HIV składa się z wielu ważnych sekwencji regulatorowych, takich jak miejsce poli(A), region bogaty w G + U i element USE, które są niezbędne do wydajnego dojrzewania wirusowych transkryptów mRNA13. W tym przykładzie spodziewalibyśmy się, że wejściowy substrat RNA będzie wynosił 338 nt, a po rozszczepieniu 237 nt. Gdyby dopuszczono do wystąpienia poliadenylacji, zaobserwowano by rozmaz produktów między 237 a 437 nt.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Adaptacja przylegających komórek do zawiesiny

(To jest opcjonalny krok. Komórki zawiesinowe na ogół wytwarzają lepsze ekstrakty jądrowe, jednak można również użyć komórek hodowanych na płytkach.)

  1. Przystosuj przylegające komórki do wzrostu w zawiesinie za pomocą zmodyfikowanego MEM Joklika uzupełnionego 5-10% surowicą nowonarodzonych cieląt lub płodową surowicą bydlęcą i 1% L-glutaminą: penicyliną-streptomycyną. Rozmnażać komórki w kolbach obrotowych z nasadką filtrującą w temperaturze 37 °C przy 8 % CO2 .
  2. Podczas dostosowywania komórek należy zacząć od 100 ml w kolbie obrotowej o pojemności 500 ml. Utrzymuj minimum 0,3 x 106 komórek/ml i wymieniaj pożywkę co 1-2 dni, aż do osiągnięcia odpowiedniego tempa wzrostu (zwykle 2-6 tygodni). Po adaptacji, komórki HeLa w zawiesinie powinny podwajać się co około 24 godziny. UWAGA: W fazie adaptacji minie trochę czasu, zanim komórki powrócą do normalnego tempa podwajania.
  3. Utrzymuj komórki w gęstości 0,5-0,8 x 106 komórek/ml w pożądanej objętości końcowej (zwykle 1-10 l)
  4. Komórki są zwykle zbierane w połowie fazy logarytmicznej (około 0,5-0,65 x 10,6 komórek/ml i >90% żywotności). Użyj kolby obrotowej o odpowiedniej wielkości dla żądanej ilości pożywki hodowlanej.

2. Ekstrakty jądrowe

  1. Przygotowanie buforu i odczynnika
    nuta: Ekstrakcje przeprowadza się zgodnie ze zmodyfikowaną procedurą ekstrakcji jądrowej Dignam et al. (1983)14.
    1. Przygotować 1X bufor fosforanowy soli fizjologicznej, bufor A, bufor C i bufor D (Tabela 1) na dzień przed przystąpieniem do ekstrakcji i przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Wyższe plony osiąga się zazwyczaj przy świeżo przygotowanym buforze; Jednak bufor jest stabilny przez kilka tygodni. Ważne jest, aby wszystkie, aparaty i urządzenia były wstępnie schłodzone i utrzymywane w niskiej temperaturze przez cały czas ekstrakcji. Użyj chłodni do jak największej liczby kroków i/lub utrzymuj wszystko na lodzie. Dodaj DTT i PMSF bezpośrednio przed użyciem.
  2. Komórki zbiorcze i myjące
    1. Wlać komórki do czterech stożkowych butelek o pojemności 250 ml i wirować w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w wirówce z wirnikiem wahliwym lub o stałym kącie nachylenia. Zdekantować supernatanty i dodać kolejne 250 ml pożywki do hodowli komórkowych do każdej butelki. Powtarzaj wirowania, aż wszystkie komórki zostaną ogranulowane.
    2. Ponownie zawiesić połączone końcowe granulki w łącznej ilości 250 ml lodowatego PBS i przelać do jednej stożkowej butelki o pojemności 250 ml. Wirować komórki w temperaturze 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w wirówce z odchylanym kubełkiem.
    3. Odlać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w lodowato zimnym PBS, tak aby całkowita objętość NIE przekroczyła 50 ml. Poluzować osad za pomocą pipetowania i przenieść do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
    4. Ponownie wirować komórki w temperaturze 500 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C w wirówce z odchylanym wiadrem. Odlać supernatant i oszacować oraz zanotować objętość osadu komórkowego (CPV) tak dokładnie, jak to możliwe. Użyj wody w osobnej pasującej tubie, dla porównania, jeśli granulka jest mniejsza niż oznaczenia objętości na probówce.
  3. Liza komórek
    1. Dodaj DTT do bufora A. Ponownie zawieś osad w buforze A, używając 5 woluminów szacowanego CPV. Odpipetować do rozdrobnienia osadu i inkubować na lodzie przez 10 minut.
    2. Wirować komórki w temperaturze 931 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w wirówce z odchylanym kubełkiem.
    3. Ostrożnie odsysać supernatant zamiast dekantować. Objętość osadu powinna zwiększyć się mniej więcej dwukrotnie z powodu obrzęku komórek.
    4. Dodaj 1 CPV buforu A do komórek. Delikatnie rozdrobnij granulkę i usuń małą porcję (około 50 μl) do probówki do mikrofuge na lodzie. Przenieś zawieszone komórki do homogenizatora Dounce o odpowiedniej wielkości (zwykle o pojemności 15 ml) schłodzonego na lodzie.
    5. Zjonizuj komórki 12-15 powolnymi, ale stałymi pociągnięciami tłuczka typu B (ciasnym). Usunąć małą porcję lizatu i zbadać pod mikroskopem pod kątem całkowitej lizy (nienaruszone małe ciemne jądra w porównaniu z spuchniętymi komórkami) przez barwienie błękitem trypanowym. Nienaruszone komórki będą czyste). Kontynuuj homogenizację, aż do osiągnięcia 90% lizy i zatrzymaj się na tym, nadmierne dozowanie może negatywnie wpłynąć na jakość ekstraktów jądrowych.
    6. Przenieś lizat do ultraprzezroczystych probówek ultrawirówek i zanotuj całkowitą objętość. Zrównoważyć przez zważenie probówek i wirować z prędkością 1,069 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
      nuta: Ultrawirówka jest używana na tym etapie pomimo niskiej prędkości wirowania, ponieważ ta sama rura będzie wirowana z większą prędkością w następnym kroku. To wirowanie da dość ciasny osad pokrywający dno probówki z bardziej mętnym supernatantem powyżej, który może być zebrany i użyty do cytozolowych ekstraktów S100. Jeśli na górze rurki znajduje się widoczna warstwa lipidowa, można ją usunąć.
    7. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety i przenieść go do innej probówki. Unikaj naruszania pastylki jądrowej. nuta: Ważne będzie poznanie końcowej objętości supernatantu w celu określenia upakowanej objętości jądrowej (PNV).
  4. Przygotowanie ekstraktu jądrowego
    1. Po ostrożnym usunięciu supernatantu należy ponownie odwirować w tej samej probówce osad surowego ekstraktu jądrowego o masie 25 453 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Usunąć pozostały sklarowany sklarowany składnik osadu (powinna to być niewielka ilość klarownego płynu) i dodać go do poprzedniej kolekcji sklarowanego nad osadem. Zmierzyć końcową objętość supernatantu. Obliczyć PNV, odejmując tę objętość od całkowitej objętości pierwotnego lizatu, o której wcześniej wspomniano. Alternatywnie, jeśli osad jest wystarczająco duży, jego objętość można oszacować, porównując z podobną objętością wody w identycznej rurce.
    3. Dodać 1 objętość PNV buforu C (około 1 ml/ml komórek). Ostrożnie usunąć osad za pomocą końcówki pipety i przenieść do homogenizatora Dounce o odpowiedniej wielkości. Jeśli używasz tego samego homogenizatora co poprzednio, przepłucz homogenizator sterylną wodą dejonizowaną.
    4. Ponownie zawiesić granulkę za pomocą ~ 5-10 uderzeń za pomocą homogenizatora Dounce za pomocą ciasnego tłuczka.
    5. Przenieść homogenizowany lizat jądrowy do schłodzonej probówki i mieszać przez odwrócenie przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Jeśli objętość jest wystarczająco duża, wymieszaj za pomocą magnetycznej płytki mieszającej i wirówki.
    6. Przenieść lizat do nowej ultraprzezroczystej probówki wirówkowej i wirować z prędkością 25 453 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Pellet powinien być zwarty. Na około 5 minut przed zakończeniem wirowania należy nawodnić kasety lub rurki do dializy, które mają odpowiednią masę cząsteczkową odciętą (MWCO) (np. 7 000 kDa).
    7. Usunąć supernatant (ekstrakt jądrowy) z probówki do schłodzonej stożkowej probówki za pomocą pipety do przenoszenia, a następnie przystąpić do dializy.
  5. dializa
    1. Wstrzyknąć ekstrakty do uwodnionych kaset dializacyjnych zgodnie z instrukcjami producenta i dializować ekstrakty jądrowe w 500 ml buforu D50 przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C, mieszając.
    2. Zastąp bufor 500 ml świeżego, lodowatego buforu D50 i dializuj przez dodatkowe 4 godziny w temperaturze 4 °C. Ten 4-godzinny krok może zostać podzielony na dwie 2-godzinne zmiany.
    3. Wyjąć ekstrakty z kasety dializacyjnej i przenieść do schłodzonych probówek. Wirować ekstrakty przez 5 minut w temperaturze 1 500 x g w temperaturze 4 °C.
    4. Porcje ekstraktów przelać do schłodzonych probówek Eppendorfa i zamrozić błyskawicznie w ciekłym azocie (50-100 μl na podwielokrotność). Przechowywać w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.

3. Synteza sondy RNA

  1. Przygotowanie szablonu
    nuta: Matryce używane do transkrypcji mogą być fragmentami PCR lub plazmidami, które zawierają promotor T7 lub SP6 przed i bezpośrednio przylegają do żądanej sekwencji sondy. Matryce plazmidowe muszą być zlinearyzowane poniżej sekwencji szablonów będących przedmiotem zainteresowania. Zauważyliśmy wyższą wydajność z szablonów PCR.
    1. Promotor T7/SP6 może być wprowadzany podczas reakcji PCR. Zaprojektuj starter sensacyjny z promotorem T7/SP6 przed sekwencją docelową.
    2. Amplifikuj żądaną sekwencję w 2-3 reakcjach na matrycę za pomocą PCR zgodnie z instrukcją producenta przy użyciu polimerazy o wysokiej wierności.
    3. Połączyć równoważne reakcje i oczyścić przez ekstrakcję żelem.
    4. Sekwencjonuj produkty PCR, aby zweryfikować dokładność matrycy. (Opcjonalnie)
  2. Transkrypcja RNA z znakowaniem 32P
    1. Przeprowadzić transkrypcję in vitro z 1 μg matrycy za pomocą dostępnego na rynku zestawu, który jest kompatybilny z promotorem (SP6 lub T7) z następującymi modyfikacjami. Użyj 1 μl świeżego 3,000 Ci/mmol [α-32P] UTP, 0,5 μl 10 mM zimnego UTP, 0,1 μl 10 mM GTP i 0,9 μl 10 mM m7G(5')ppp(5')G czapeczki RNA w całkowitej końcowej objętości 20 μl.
      nuta: G-cap poprawia stabilność transkryptów RNA w ekstraktach jądrowych (cap:GTP) w stosunku 10:1. Zimny UTP jest dodawany, aby zapobiec sytuacji, w której 32P-UTP jest odczynnikiem ograniczającym.
    2. Zsyntetyzuj drabinkę wielkości RNA, jak opisano powyżej, bez czapeczki G. Dostępne są komercyjne szablony do generowania markera wielkości RNA.
    3. Inkubować reakcje transkrypcyjne w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę (w przypadku SP6 stosować 40 °C). Po zakończeniu przeprowadzić mineralizację DNazy w matrycy przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
    4. Po mineralizacji dodać 1 μl 0,5 M EDTA i 5 μl buforu ładującego II do substratów RNA. Dodać 20 μl bufora ładującego II do markera.
    5. Podgrzewać marker RNA i sondy w temperaturze 95 °C przez 3 minuty, a następnie umieścić na lodzie.
  3. Odlewanie żelu poliakrylamidowego/elektroforeza sondy
    1. Przygotuj 1 l mieszanki 6% żelu poliakrylamidowego (PAGE) i 400 ml 10% PAGE. Aby uzyskać 6%, wymieszaj 150 ml 40% 19:1 akrylamidu:bis-akrylamidu ze 100 ml 10X Tris/Boran/EDTA (TBE) i 460 g mocznika. Zalać do 800 ml sterylną wodą dejonizowaną i zamieszać na płycie grzejnej, stosując małe temperatury (około 50-80 °C). Uzupełnić do 1 l z wodą dejonizowaną.
      nuta: Reakcja jest endotermiczna. Ogrzewanie sprzyja solubilizacji mocznika. Zdjąć z ognia, gdy tylko mocznik się rozpuści i doprowadzić roztwór do 1 l wodą dejonizowaną. Alternatywnie mieszać w temperaturze pokojowej przez noc; Zbyt dużo ciepła może zainicjować polimeryzację.
    2. Chroń mieszankę PAGE przed światłem folią aluminiową i przechowuj w temperaturze pokojowej. Mieszanki PAGE można przygotować z wyprzedzeniem i są one stabilne przez kilka miesięcy.
    3. Przygotować 400 ml mieszanki 10% PAGE, łącząc 100 ml 40% 19:1 akrylamidu:bis-akrylamidu, 40 ml 10x TBE i 184 g mocznika. Po rozpuszczeniu mocznika uzupełnić do 400 ml wodą dejonizowaną.
      Alternatywnie należy przygotować 20% roztwór akrylamidu w proporcji 19:1 i 0% roztwór akryloamidu z samym buforem i mocznikiem; Można je następnie mieszać w dowolnych proporcjach, aby uzyskać dowolny procent od 0 do 20%; Mocznik zawsze rozpuszcza się powoli.
    4. Przygotować 10-50 ml 10% roztworu nadsiarczanu amonu (APS) w sterylnej wodzie dejonizowanej w zależności od liczby żeli do odlania.
    5. Szklane płytki żelowe o wymiarach 20 cm x 22 cm umyć 70% etanolem (EtOH). Osusz dużymi, niestrzępiącymi się chusteczkami.
    6. Umyć zwykłą płytkę 1 ml 5 N wodorotlenku sodu (NaOH), a następnie ponownie przemyć 70% EtOH. Pokryj karbowaną płytkę żelowym roztworem silikonowym, przecierając płytkę nasączonym małym Kimwipe.
    7. Zmontuj płytki, umieszczając zwykłą płytkę na pustym pudełku z końcówkami do pipet lub kawałku styropianu, aby podnieść ją ze stołu oczyszczoną stroną do góry. Ułóż przekładki 0,4 mm na krawędzi każdego długiego boku.
    8. Ostrożnie umieść karbowaną płytkę na przekładkach tak, aby powlekana strona znajdowała się po wewnętrznej stronie żelu. Użyj brzytwy lub innego cienkiego narzędzia, aby przesunąć przekładki w celu wyrównania na dole i po bokach płytek żelowych, a następnie zabezpiecz klipsami do segregatorów po obu stronach płytek żelowych nad przekładkami.
    9. Przygotuj 30 ml mieszanki 8% PAGE na żel, mieszając 15 ml mieszanek 10% i 6% w tubce o pojemności 50 ml. Szybko dodaj 300 μl 10% APS, a następnie 30 μl N,N,N',N'-tetra-metyloetylenodiaminy (TEMED) do 8% mieszanki żelowej.
      nuta: Odpowiednie procenty żelu dla poszczególnych rozmiarów sond powinny być dobrane przez eksperymentatora.
    10. Zakręć i odwróć 2x i wlej roztwór do karbowanego obszaru płytek żelowych. Pamiętaj, aby lekko podnieść talerze ręcznie i utrzymywać równomierne nalewanie, aż mieszanka PAGE zacznie kapać z dna.
    11. Opuść płytki z powrotem do poziomu i natychmiast włóż duży 8-dołkowy prostokątny grzebień do żelu o wymiarach 0,4 mm x 20 cm. Małe bąbelki w pobliżu dna nie wpłyną na bieganie, ale w studzienkach nie powinno być pęcherzyków.
      nuta: Połóż ręczniki papierowe na stole poniżej dolnej i górnej części żelu, aby uchwycić wszelkie rozlane płyny podczas nalewania.
    12. Pozostaw mieszaninę PAGE do polimeryzacji przez co najmniej 30 minut.
    13. Przenieś spolimeryzowany żel do komory chłodniczej i zmontuj aparat do elektroforezy. Dodaj zimny bufor TBE do linii napełniania w górnej i dolnej komorze.
    14. Zdejmij grzebień i użyj brzytwy, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia. Umieść żel w aparacie i użyj spinacza do segregatora, aby przytrzymać płytkę do uszczelki. Dodaj zimny KSE do górnej komory, aż spłynie do płytek.
    15. Umyj studzienki strzykawką o pojemności 30 ml/igłą 21 G 1-1/2" wypełnioną zimnym TBE tuż przed załadowaniem oznakowanych substratów RNA. Umieść aluminiową płytkę z tyłu szkła, aby pomóc w równomiernym rozprowadzaniu ciepła podczas biegu.
    16. Załadować 3 μl markera i całą 25 μl reakcji transkrypcji każdego substratu RNA do oddzielnych studzienek. Pozostaw studzienkę między transkryptami o podobnej wielkości, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu. Barwniki błękitu bromofenolowego i cyjanolu ksylenowego w buforze ładującym można wykorzystać do oszacowania migracji wielkości na żelu.
    17. Uruchom żel ze stałą mocą odpowiednią do wielkości sond RNA (np. 25 watów przez 2 godziny dla sond o długości 600 nt).
  4. Znakowana ekstrakcja i oczyszczanie RNA
    1. Po elektroforezie ostrożnie opróżnij górną komorę aparatu żelowego. Większość radioaktywności będzie znajdować się w żelu i dolnej komorze; Górny bufor może jednak zawierać pewną ilość materiału radioaktywnego.
    2. Użyj tacki do transportu żelu w przypadku przenoszenia do innego obszaru roboczego z materiałem radioaktywnym. Ostrożnie usuń przekładki, odciągając wystający element na boki od żelu.
    3. Delikatnie oddziel płytki. Żel powinien przykleić się do płytki, która nie została silikonowana. Umieść kawałek plastikowej folii na żelu i szklanej płytce.
    4. Umieść naklejkę z markerem glogos autorad na plastikowej folii na obszarze żelu, który jest wolny od jakichkolwiek próbek.
    5. W ciemnym pomieszczeniu umieść kawałek filmu autoradiograficznego na całej kliszy i naświetlaj przez co najmniej 1 minutę. Wywołaj film.
    6. Umieść wywołany film na jasnej powierzchni. Następnie umieść plastikową stronę żelu stroną zadrukowaną do dołu na folii i wyrównaj marker autorad od żelu do naświetlonego markera na folii. Po wyrównaniu użyj czarnego markera, aby zaznaczyć położenie żądanych pasków na szkle.
      nuta: Alternatywnie, wyrównaj żele/film w następujący sposób, aby wyciąć prążki RNA. W ciemnym pomieszczeniu połóż zawinięty żel na stole, połóż na nim folię i połóż kasetę (lub książkę itp.) na kawałku filmu. Włącz na chwilę włącznik światła w pokoju, a następnie wyłącz, jeśli jest wyłączony. Spowoduje to "przedbłysk" filmu, generując kontur wszystkich dołków na filmie ze względu na ciśnienie/ochronę przed światłem, którą zapewnia kaseta na górze. Ułatwia to wyrównanie folii na żelu i wycięcie opaski bez użycia markerów fluorescencyjnych.
    7. Ostrożnie usuń plastikową folię i użyj świeżego skalpela lub brzytwy do każdego substratu RNA, a następnie wytnij pasma z żelu i umieść w oddzielnych probówkach do mikrofug o pojemności 1,7 ml. Użyj nutatora do delikatnych mieszań podczas elucji.
    8. Dodać 500 μl buforu elucyjnego RNA (0,5 M octanu amonu, 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 0,2% SDS) do każdej probówki. Krótko odwirować, aby zanurzyć fragment żelu. Inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 3-16 godzin, w zależności od wielkości sondy.
    9. Przenieść całe 500 μl eluowanego materiału do nowej probówki. Unikaj przenoszenia jakichkolwiek kawałków żelu, ponieważ będą one zakłócać oczyszczanie. Dodać 1 μl glikogenu (20 mg/ml) wraz z 500 μl zimnego, kwaśnego fenolu-chloroformu (dla RNA).
    10. Krótko wir, roztwór powinien wydawać się mętny. Wirować w temperaturze pokojowej z maksymalną prędkością (~16 000 x g) przez 5-6 minut.
    11. Ostrożnie przenieś górną (wodną) warstwę do nowych probówek, zbierając jak najwięcej, unikając jednocześnie wszelkich zanieczyszczeń z interfazy. Dodać równą ilość chloroformu do przeniesionej warstwy wodnej. Powtórz krok 3.4.10 i przenieś górną (wodną) warstwę do nowej probówki. Do pobranego materiału dodać 1 ml lodowatego 95-100% EtOH. Inkubować w temperaturze -80 °C przez 10 minut. UWAGA: W razie potrzeby RNA może być przechowywane przez noc.
    12. Osadzać RNA przez 30 minut w temperaturze 16 000 x g w temperaturze 4 °C. Ostrożnie przelać supernatant do pojemnika na odpady radioaktywne i dodać 1 ml lodowatego EtOH o zawartości 70% cząstek do każdej granulki.
    13. Osadzać RNA w temperaturze 16 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, odlać supernatant, ponownie wirować przez 1 minutę i usunąć wszelkie pozostałości EtOH za pomocą pipety i pozostawić w temperaturze pokojowej z otwartymi nakrętkami, aby umożliwić odparowanie pozostałego EtOH.
    14. Zawiesić granulki w 20-30 μl wody wolnej od RNaz. Znakowany RNA może być przechowywany w temperaturze -80 °C.
      nuta: Radioaktywny miernik pomiarowy powinien być używany przez cały czas trwania procedury ekstrakcji, aby sprawdzić, czy oznakowany RNA nie został utracony podczas żadnego etapu.
  5. Kwantyfikacja znakowanego RNA dla reakcji rozszczepienia pre-mRNA 3' mRNA
    1. Przybliżyć molowość substratów łupliwych, stosując następującą procedurę.
      1. Weźmy na przykład 1 μl 3 000 Ci/mmol [α-32P] UTP i 10 mCi/ml. (W dniu odniesienia na etykiecie stężenie chemiczne tego roztworu podstawowego wyniesie 3,3 μM UTP. Przed tą datą jest wyższy i jeden okres półtrwania (~13 dni) po dacie jest to ~1,6 mM, itd.) Udział UTP w końcowym stężeniu reakcji jest zazwyczaj znikomy, gdy stosuje się końcowe stężenie UTP na zimno powyżej UTP Km. T7 RNAP Km dla UTP wynosi 114 mM 15.
      2. Rozcieńczyć 1 μl w 39 μl wody. Następnie dodać 1 μl rozcieńczonego [α-32P] UTP do odpowiedniej objętości płynu scyntylacyjnego w fiolce scyntylacyjnej. (UWAGA: Płyn scyntylacyjny nie jest w rzeczywistości potrzebny do tej konkretnej aktywności 32P, ponieważ liczenie Cerenkowa również da wiarygodne wartości cpm. Sprawdź instrukcję licznika scyntylacyjnego, aby wybrać właściwy kanał do liczenia Cerenkova i policz objętość 1 ml przez 1 minutę).
    2. Rozcieńczyć 1 μl każdego znakowanego substratu RNA do oddzielnych fiolek z równą ilością płynu scyntylacyjnego użytego w poprzednim etapie. Upewnij się, że masz fiolkę z samym płynem scyntylacyjnym, aby obliczyć tło. Określ ilościowo radioaktywność w liczniku scyntylacyjnym.
    3. Pomnóż liczbę na minutę (cpm) dla próbki UTP [α-32P] przez 40, aby uwzględnić początkowe rozcieńczenie i odjąć tło uzyskane przez sam płyn scyntylacyjny. Pomnóż liczby dla każdej sondy RNA przez ilość wody wolnej od RNaz (20-30 μl) użytej do ponownego zawieszenia sond RNA. Daje to całkowitą cpm oczyszczonego RNA.
      przykład: Maksymalny cpm = (cpm [α-32P] UTP – tło) x 40. Znakowana próbka RNA 1 = 20 000 cpm x 20 = 400 000 cpm (jeśli 20 μl jest używane do resuspension)
    4. Jeżeli do sporządzenia transkrypcji użyto ilości innej niż 1 μl [α-32P] UTP, należy uwzględnić tę objętość w końcowym cpm [α-32P] UTP, mnożąc cpm dla próbki [α-32P] UTP przez użytą ilość.
      Przykład: Do sporządzenia transkrypcji używa się 2 μl [α-32P] UTP. Obliczony cpm dla 1 μl [α-32P] UTP wynosi 500 000 cpm. Pomnóż 500 000 * 2 = 1 000 000 cpm
    5. Podziel obliczony oznaczony RNA cpm przez obliczony cpm dla samego [α-32P] UTP. W ten sposób można z grubsza oszacować odsetek oznaczonych UTP incorporated.
      Przykład: 400 000 / 1 000 000 = 0,40 lub 40% włączone
    6. Ponieważ enzym nie jest w stanie rozróżnić izotopów, ten sam procent znakowanego i nieznakowanego UTP jest włączany do RNA podczas transkrypcji. Obliczyć ilość zimnego UTP w molach, która jest dodawana do reakcji transkrypcji (0,5 μl roztworu 10 mM = 5,0 x 10-9 moli UTP).
    7. Pomnóż mole UTP w reakcji przez procent włączony (znany z powyższego liczenia gorących UTP), a następnie podziel to przez liczbę urydyn w sekwencji RNA.
      Przykład: 5,0 x 10-9 moli UTP x 0,40 = 2 x 10-9 moli UTP
      2 x 10-9 moli UTP / 73 U na transkrypt = 2,7 x 10-11 moli RNA
    8. Przekształć mole RNA w molowość, dzieląc objętość odzyskanego roztworu do rezawieszania RNA.
      Przykład: 2,7 x 10-11 moli RNA / 20 μl = 1,370 nM RNA. Dla transkryptów T7 RNAP wykonanych z około 1 μg zlinearyzowanego plazmidu i zawieszonych w 20 μl wody typowe są wartości od 200 do 1,400 nM.
      nuta: Stężenie molowe RNA stosuje się w celu zapewnienia, że końcowe stężenie substratu pre-mRNA w reakcji rozszczepienia in vitro jest mniejsze niż 5 nM na reakcję rozszczepienia. Wydajność rozszczepienia może się zmniejszyć, jeśli stężenie RNA zostanie znacznie podwyższone powyżej 5 nM.

4. 3' Reakcja rozszczepienia mRNA

  1. Przygotowanie odczynnika do reakcji rozszczepienia
    1. Przygotuj wszystkie odczynniki potrzebne do reakcji rozszczepienia. Przygotuj 10% alkohol poliwinylowy (PVA) we wrzącej wodzie i powoli dodawaj odpowiednią ilość proszku PVA. 10% PVA będzie lepkie i potrzebuje czasu, aby się rozpuścić. Przechowywać w temperaturze pokojowej lub -20 °C.
    2. Przygotować 1 M fosforan kreatyny (CP) i przechowywać w temperaturze -80 °C. Ważne jest, aby używać 1 M CP, który ma mniej niż 4 miesiące.
    3. Przygotować 1 M DTT i przechowywać w temperaturze -20 °C. Wykonać świeże rozcieńczenie 0,2 M DTT z 1 M DTT tuż przed przeprowadzeniem reakcji rozszczepienia.
    4. Przygotuj ETS (roztwór zatrzymujący rozszczepienie): 10 mM Tris pH 7,8, 10 mM EDTA, 0,5% SDS. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
  2. Reakcja rozszczepienia
    1. Podgrzej znakowany RNA do 80 °C przez 2 minuty, a następnie umieść na lodzie.
    2. Delikatnie zwiruj, a następnie wiruj 10% PVA na najwyższych obrotach przez 2-3 minuty, aby usunąć bąbelki.
    3. Mieszanka główna 1: Aby uzyskać pojedynczą reakcję, połącz 3,125 μl 10% PVA, 0,625 μl 1 M CP, 0,25 μl 0,5 M tRNA, 0,125 μl 100 mM dATP, 0,13 μl 40 U/μl inhibitora RNazy, 0,25 μl 0,1 M EDTA pH 8, 0,1 μl 0,2 M DTT, i 0,645 μl wody wolnej od RNaz. Dozować 5,25 μl mieszanki wzorcowej 1 na probówkę na lód.
    4. Mieszanka główna 2: Użyć 6,25 μl/reakcję ekstraktów jądrowych o stężeniach wyższych niż 2 mg/ml. W razie potrzeby ekstrakty jądrowe można rozcieńczyć buforem D50.
    5. Połączyć 6,25 μl ekstraktu jądrowego z uprzednio dozowanymi 5,25 μl mieszanki głównej 1. Dodać 1 μl znakowanego substratu RNA, który rozcieńcza się do 50 nM. Alternatywnie, RNA może być włączony do Master mix 1, pod warunkiem, że jest dodawany po inhibitorze RNazy, DTT i tRNA. nuta: Użyj <5 nM znakowanego substratu RNA.
    6. Delikatnie wiruj i szybko obracaj każdą próbkę, aby usunąć pęcherzyki. Inkubować w temperaturze 30 °C przez maksymalnie 2 godziny, ale w celu uzyskania optymalnych wyników należy przeprowadzić kurs czasowy. Dłuższe inkubacje mogą zwiększyć degradację tła.
  3. Trawienie i oczyszczanie proteinazy K
    1. Usunąć próbki z ognia i dodać 182,5 μl roztworu zatrzymującego ETS do każdej reakcji. Dodać 5 μl 20 mg/ml proteinazy K i inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
    2. Ekstrahować RNA, dodając 1 objętość (200 μl) kwaśnego chloroformu fenolowego, 1/10 objętości (20 μl) 3 M octanu sodu i 1 μl 20 mg/ml glikogenu. Kontynuować ekstrakcję zgodnie z opisem w sekcjach 3.4.9-3.4.14.
    3. Po zakończeniu ekstrakcji RNA należy usunąć wszystkie pozostałości EtOH. Zawiesić osad w 8 μl buforu ładującego (90% formamidu, 10 mM EDTA, z błękitem bromofenolowym (BFB) (i/lub błękitem ksylenowo-cyjanolowym)). Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C lub poddawane elektroforezie żelowej.
  4. Reakcja rozszczepienia Elektroforeza
    1. Przygotować 6% żel akrylamidowy, jak wcześniej stwierdzono w sekcjach 3.3.1-3.3.17 z kilkoma modyfikacjami. Użyj sekwencjonujących płytek żelowych o wymiarach 20 cm x 42 cm z 2 klipsami do segregatora na każdym dłuższym boku. Użyj 32-dołkowego grzebienia i przygotuj 40 ml mieszanki żelowej.
    2. Do żelu należy dodać 3 μl markera i 5 μl każdej próbki. Zoptymalizuj ustawienia elektroforezy zgodnie ze wstępnym rozszczepieniem i rozmiarami rozszczepionych produktów.
    3. Po zakończeniu elektroforezy należy postępować zgodnie z sekcjami 3.4.1-3.4.3, aby zdemontować żel. Zamiast folii przytnij kawałek bibuły filtracyjnej do rozmiaru płytki żelowej i ostrożnie umieść go po jednej stronie odsłoniętego żelu.
    4. Mocno dociśnij bibułę filtracyjną do żelu, a następnie odwróć płytkę tak, aby bibuła filtracyjna znajdowała się na dole, a szklanka na górze. Mocno dociśnij szklankę do stołu, aby upewnić się, że żel równomiernie chwyta bibułę filtracyjną.
    5. Powoli oderwij bibułę filtracyjną, do której powinien być przymocowany żel, od jednego z krótkich końców, aż cała bibuła filtracyjna z dołączonym żelem zostanie usunięta ze szklanej płytki.
    6. Przykryj odsłoniętą stronę żelową folią. Przyklej folię do bibuły filtracyjnej.
    7. Umieść żel na suszarce do żelu stroną z filtrem skierowaną w stronę podciśnienia. Suszyć przez 15 minut lub do całkowitego wyschnięcia żelu.
      nuta: Jeśli suszarka do żelu nie jest dostępna, do wizualizacji prążków RNA można użyć kliszy rentgenowskiej. Naświetlanie powinno być przeprowadzone w światłoszczelnej kasecie z ekranem intensyfikacyjnym w temperaturze -80 °C. Czas naświetlania określa się empirycznie. Uwaga: żele akrylamidowe o niskiej zawartości procentowej mogą pękać po zamrożeniu.
    8. Żel może być teraz używany do naświetlania filmu lub do stosowania z fosfo-imagerem. Czas ekspozycji zależy od siły znakowanego RNA. Początkowo można zastosować 24-godzinną ekspozycję. Jeśli używasz filmu, naświetl w temperaturze -80 °C za pomocą ekranu intensyfikacyjnego i pozwól mu ogrzać się do temperatury pokojowej przed wywołaniem.
    9. Zmierz stosunek między rozszczepionym i nierozszczepionym RNA w każdej próbce, aby określić ilościowo wydajność cięcia.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywne wyniki testu rozszczepienia miejsc poli(A) RNA HIV-1 (Rysunek 2). Możemy zaobserwować nierozszczepiony substrat RNA, który jest najwolniej migrującym pasmem na górze żelu. Specyficzny rozszczepiony produkt jest najintensywniejszym krótszym pasmem fragmentów, który biegnie szybciej w żelu przy oczekiwanym rozmiarze i jest specyficznie nieobecny w teście rozszczepienia kontroli mutpoli(A), która zawiera mutację punktową w substracie RNA sekwencji poliA (mutPolyA). Czasami można zaobserwować...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reakcja rozszczepienia pre-mRNA 3' in vitro , przeprowadzona w ekstraktach jądrowych komórek HeLa lub z czynnikami rozszczepienia frakcjonowanymi z tych ekstraktów, umożliwiła identyfikację podstawowych czynników rozszczepienia i ich głównych kompleksów16-21. Ostatnio zidentyfikowano znacznie więcej białek związanych z tymi czynnikami22, a reakcja in vitro może nadal rzucać światło na to, w jaki sposób te białka przyczyniają się do reakcji. Być może dlatego, że reakcja in vivo ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.V. jest wdzięczny za wsparcie finansowe od K22AI077353 NIH i Fundacji Landenbergera. K.R. z wdzięcznością dziękuje za finansowanie od NIH (5SC1GM083754).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kolba 1 L CelstirWheaton356884Dostępne różne rozmiary
4-pozycyjne mieszadło wolnoobrotoweVWR12621-076
Wirówka kubełkowa wahadłowaBeckman CoulterAllegra x-15R z wirnikiem SX4500
UltrawirówkaBeckman CoulterOptima L-100 XP Ultra z wirnikiem SW41 Wirówka
stołowa 5417REppendorfTermomikser w lodówce
inkubatorEppendorf
250 ml probówki stożkoweCorning430776
50 ml probówki stożkoweBD Falcon352098
Ultraclear probówki wirówkoweBeckman Coulter344059
JOKLIK modyfikowany MEMLonza04-719Q
Płodowa surowica bydlęcaAtlasF-0500-AInaktywowana termicznie
L-glut:pen:strepGemini Bio-Products400-110
1 M Tris-HCl pH 8,0Mediatech46-031-CM
Chlorek magnezuFisherBP214-500
Chlorek potasuMP Biomedicals194844
HEPESFisherBP310-500
DTTAlexis Biomedicals280-001-G-010
GlicerolFisherBP229-4
5 M roztwór chlorku soduMediatech46-032-CV
EDTA 0,5 M roztwórSigma-AldrichE7889-100ml
EDTAFisherBP120-500
PMSFThermo Scientific36978
Siarczan amonuFisherA702-500
Kompletne tabletki koktajlowe z inhibitorem proteazy bez EDTARoche04 693 132 001
Zestaw kaset dializacyjnych Slide-A-LyzerThermo Scientific66372MWCO 7,000 0,5 ml-3 ml
15 ml Zestaw młynków do tkanek DounceSigma-AldrichD9938-1SETDostępne
różne rozmiaryRozwiń zestaw do PCR o wysokiej wiernościRoche11 732 650 001
10 mM dNTP MixInvitrogenY0225610 mM każdy nukleotyd
Zestaw MaxiScript SP6/T7AmbionAM1322
m7G(5')ppp(5') G Czapeczka RNANew England BiolabsS1404S
Century Marker Template PlusAmbionAM7782
Easytides UTP [α-32P] 250 μ CiPerkin ElmerBLU507H250UC
Bufor ładujący żel IIAmbion8546G
DEPC woda uzdatnionaAmbionAM9906
10x TAEFisherBP13354
10xTBE Ameresco Life Sciences0658-4L
10x PBSFisherBP399-20
MocznikFisherBP169-212
Nadsiarczan amonuBio-Rad161-0700
TEMEDFisherBP150-20
Octan amonuFisherA637-500
40% 19:1 akrylamid: bis-akryloamidBio-Rad161-0144
GlikogenRoche10 901 393 001
100% absolutny etanol 200 dowódAcros61509-0040
Kwaśny fenol: chloroformAmbion9720Do
płynu do scyntylacjiFisherSX18-4
Inhibitor rnazyPromegaN261B
Alkohol poliwinylowy - PVASigma-AldrichP8136-250G
Fosforan kreatynyCalbiochem2380
100 mM dATPFisherBP2560-4
SDSAcros23042-5000
Proteinaza KFisherBP1700-100
Regulowana jednostka sekwencjonującaSigma-AldrichZ351881-1EA
Spinacze do segregatorówOffice Depot838-056
Talerze szklane 20 cm x 42 cmSigma-AldrichZ3525431 ZESTAW
Talerze szklane 20 cm x 22 cmSigma-AldrichZ35252-71 ZESTAW
20 cm x 42 cm aluminiowe płyty chłodząceSigma-AldrichZ3526671 EA
Przekładki 0,4 mm x 22 cmSigma-AldrichZ35230-61 ZESTAW
dystanse 0,4 mm x 42 cmSigma-AldrichZ352314-11 ZESTAW
grzebień 8-dołkowySigma-AldrichZ35195-41 EA
Grzebień 16-dołkowySigma-AldrichZ3519621 EA
Grzebień 32-dołkowySigma-AldrichZ3519701
EA Żelowa powłoka odstraszającaC.B.S. ScientificSGR-0401lub SGR-0101 do indywidualnej butelki
Końcówki do ładowania żelemRaininGT-10-40,1-10 μ l
Sekwencjonowanie PowerPac HVBio-RadPowerPac HV5,000 V/500 mA/400 W
Suszarka żelowa Model 583Bio-RadModel 583
Hydrotech pompa próżniowa do suszarki żelowejBio-Rad
Glogos II Markery świecące w ciemnościAgilent420201
Film 8 x 10Folia MidsciBX810
14 x 17PhenixF-BX1417
Kaseta autoradiograficznaFisherFBCA 1417dostępny rozmiar 8 x 10
RNA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maniatis, T., Reed, R. An extensive network of coupling among gene expression machines. Nature. 416, 499-506 (2002).
  2. Wahle, E., Ruegsegger, U. 3'-End processing of pre-mRNA in eukaryotes. FEMS microbiology reviews. 23, 277-295 (1999).
  3. Colgan, D. F., Manley, J. L. Mechanism and regulation of mRNA polyadenylation. Genes Dev. 11, 2755-2766 (1997).
  4. Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3' untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA biology. 9, 563-576 (2012).
  5. Danckwardt, S., et al. The prothrombin 3'end formation signal reveals a unique architecture that is sensitive to thrombophilic gain-of-function mutations. Blood. 104, 428-435 (2004).
  6. Moreira, A., et al. The upstream sequence element of the C2 complement poly(A) signal activates mRNA 3' end formation by two distinct mechanisms. Genes Dev. 12, 2522-2534 (1998).
  7. Hall-Pogar, T., Zhang, H., Tian, B., Lutz, C. S. Alternative polyadenylation of cyclooxygenase-2. Nucleic Acids Res. 33, 2565-2579 (2005).
  8. Brackenridge, S., Proudfoot, N. J. Recruitment of a basal polyadenylation factor by the upstream sequence element of the human lamin B2 polyadenylation signal. Molecular and Cellular Biology. 20, 2660-2669 (2000).
  9. Moore, C. L., Sharp, P. A. Accurate cleavage and polyadenylation of exogenous RNA substrate. Cell. 41, 845-855 (1985).
  10. Gilmartin, G. M. mRNA formation and function. , Academic Press. New York. 79-98 (1997).
  11. Wahle, E., Keller, W. RNA Processing. Vol. II. , Oxford University Press. 1-34 (1994).
  12. Chabot, B. RNA Processing Vol I. 1, Oxford University Press. 1-29 (1994).
  13. Valente, S. T., et al. HIV-1 mRNA 3' end processing is distinctively regulated by eIF3f, CDK11, and splice factor 9G8. Mol Cell. 36, 279-289 (2009).
  14. Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983).
  15. Aurup, H., Williams, D. M., Eckstein, F. 2'-Fluoro- and 2'-amino-2'-deoxynucleoside 5'-triphosphates as substrates for T7 RNA polymerase. Biochemistry. 31, 9636-9641 (1992).
  16. Keller, W., Bienroth, S., Lang, K. M., Christofori, G. Cleavage and polyadenylation factor CPF specifically interacts with the pre-mRNA 3' processing signal AAUAAA. EMBO J. 10, 4241-4249 (1991).
  17. Takagaki, Y., Ryner, L. C., Manley, J. L. Four factors are required for 3'-end cleavage of pre-mRNAs. Genes Dev. 3, 1711-1724 (1989).
  18. Takagaki, Y., et al. A multisubunit factor, CstF, is required for polyadenylation of mammalian pre-mRNAs. Genes Dev. 4, 2112-2120 (1990).
  19. Ruegsegger, U., Blank, D., Keller, W. Human pre-mRNA cleavage factor Im is related to spliceosomal SR proteins and can be reconstituted in vitro from recombinant subunits. Mol Cell. 1, 243-253 (1998).
  20. Vries, H., et al. Human pre-mRNA cleavage factor II(m) contains homologs of yeast proteins and bridges two other cleavage factors. EMBO J. 19, 5895-5904 (2000).
  21. Gilmartin, G. M., Nevins, J. R. An ordered pathway of assembly of components required for polyadenylation site recognition and processing. Genes Dev. 3, 2180-2190 (1989).
  22. Shi, Y., et al. Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex. Mol Cell. 33, 365-376 (2009).
  23. Bentley, D. L. Rules of engagement: co-transcriptional recruitment of pre-mRNA processing factors. Curr Opin Cell Biol. 17, 251-256 (2005).
  24. Tian, B., Manley, J. L. Alternative cleavage and polyadenylation: the long and short of it. Trends Biochem Sci. 38, 312-320 (2013).
  25. Ryner, L. C., Manley, J. L. Requirements for accurate and efficient mRNA 3' end cleavage and polyadenylation of a simian virus 40 early pre-RNA in vitro. Molecular and Cellular Biology. 7, 495-503 (1987).
  26. Hirose, Y., Manley, J. L. Creatine phosphate, not ATP, is required for 3' end cleavage of mammalian pre-mRNA in vitro. J Biol Chem. 272, 29636-29642 (1997).
  27. Ryan, K., Khleborodova, A., Pan, J., Ryan, X. P. Small molecule activators of pre-mRNA 3' cleavage. RNA. 15, 483-492 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

RNA Processing3 End CleavageNuclear Extract PreparationIn Vitro TranscriptionGel PurificationRadioactive Gel ElectrophoresisAutoradiographyPolyadenylation AssayHIV 1 mRNACell Free Systems

Related Articles