Analiza reakcji przetwarzania RNA przy użyciu systemów bezkomórkowych: 3' końcowe rozszczepienie substratów pre-mRNA in vitro

Summary

RNA polimeraza II syntetyzuje prekursorowy RNA, który wykracza poza koniec 3' dojrzałego mRNA. Koniec dojrzałego RNA jest generowany kotranskrypcyjnie, w miejscu dyktowanym przez sekwencje RNA, poprzez aktywność endonukleazy kompleksu rozszczepienia. Tutaj szczegółowo opisujemy metodę badania reakcji rozszczepienia in vitro.

Abstract

Koniec 3' mRNA ssaków nie powstaje w wyniku nagłego zakończenia transkrypcji przez polimerazę RNA II (RNPII). Zamiast tego RNPII syntetyzuje prekursorowe mRNA poza końcem dojrzałych RNA, a aktywny proces aktywności endonukleazy jest wymagany w określonym miejscu. Rozszczepienie prekursorowego RNA zwykle następuje 10-30 nt poniżej miejsca konsensusu poliA (AAUAAAA) po dinukleotydach CA. Białka z kompleksu rozszczepienia, wieloczynnikowego kompleksu białkowego o masie około 800 kDa, osiągają tę specyficzną aktywność nukleazy. Specyficzne sekwencje RNA przed i za miejscem poliA kontrolują rekrutację kompleksu rozszczepienia. Bezpośrednio po rozszczepieniu pre-mRNA są poliadenylowane przez polimerazę poliA (PAP) w celu wytworzenia dojrzałych stabilnych wiadomości RNA.

Przetwarzanie końca 3' transkryptu RNA może być badane przy użyciu komórkowych ekstraktów jądrowych z określonymi radioznakowanymi substratami RNA. Podsumowując, długi, nienaruszony prekursor RNA znakowany ³²P inkubuje się z ekstraktami jądrowymi in vitro, a rozszczepienie ocenia się za pomocą elektroforezy żelowej i autoradiografii. Gdy nastąpi prawidłowe rozszczepienie, wykrywa się i określa ilościowo krótszy 5-stopowy rozszczepiony produkt. W tym miejscu szczegółowo opisujemy test rozszczepienia, używając jako przykładu przetwarzania 3' końca mRNA HIV-1.

Introduction

Biosynteza najbardziej dojrzałych eukariotycznych wiadomości RNA (mRNA) wymaga kilku modyfikacji potranskrypcyjnych, takich jak capping, splicing i poliadenylacja. Modyfikacje te są na ogół sprzężone w celu zapewnienia prawidłowego przetwarzania¹ i znacznego zwiększenia stabilności mRNA.

Formacja końca 3' pre-mRNA ssaków jest generowana przez endonukleolityczne rozszczepienie powstającego RNA, po którym następuje dodanie reszt adenylanowych do produktu rozszczepionego 5' przez polimerazę poli(A) (PAP)^2-4. U ssaków rozszczepienie odbywa się za pomocą wieloskładnikowego kompleksu białkowego o masie około 800 kDa, który g....

Protocol

1. Adaptacja przylegających komórek do zawiesiny

(To jest opcjonalny krok. Komórki zawiesinowe na ogół wytwarzają lepsze ekstrakty jądrowe, jednak można również użyć komórek hodowanych na płytkach.)

1. Przystosuj przylegające komórki do wzrostu w zawiesinie za pomocą zmodyfikowanego MEM Joklika uzupełnionego 5-10% surowicą nowonarodzonych cieląt lub płodową surowicą bydlęcą i 1% L-glutaminą: penicyliną-streptomycyną. Rozmnażać komórki w kolbach obrotowych z nasadką filtrującą w temperaturze 37 °C przy 8 % CO₂ .
2. Podczas dostosowywania komórek należy zacząć od 100 ml w kolbie obrotowej o pojemności 500 ml. Utrzym....

Results

Reprezentatywne wyniki testu rozszczepienia miejsc poli(A) RNA HIV-1 (Rysunek 2). Możemy zaobserwować nierozszczepiony substrat RNA, który jest najwolniej migrującym pasmem na górze żelu. Specyficzny rozszczepiony produkt jest najintensywniejszym krótszym pasmem fragmentów, który biegnie szybciej w żelu przy oczekiwanym rozmiarze i jest specyficznie nieobecny w teście rozszczepienia kontroli mutpoli(A), która zawiera mutację punktową w substracie RNA sekwencji poliA (mutPolyA). Czasami można zaobserwować.......

Discussion

Reakcja rozszczepienia pre-mRNA 3' in vitro , przeprowadzona w ekstraktach jądrowych komórek HeLa lub z czynnikami rozszczepienia frakcjonowanymi z tych ekstraktów, umożliwiła identyfikację podstawowych czynników rozszczepienia i ich głównych kompleksów^16-21. Ostatnio zidentyfikowano znacznie więcej białek związanych z tymi czynnikami²², a reakcja in vitro może nadal rzucać światło na to, w jaki sposób te białka przyczyniają się do reakcji. Być może dlatego, że reakcja in vivo .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kolba 1 L Celstir	Wheaton	356884	Dostępne różne rozmiary
4-pozycyjne mieszadło wolnoobrotowe	VWR	12621-076
Wirówka kubełkowa wahadłowa	Beckman Coulter		Allegra x-15R z wirnikiem SX4500
Ultrawirówka	Beckman Coulter		Optima L-100 XP Ultra z wirnikiem SW41 Wirówka
stołowa 5417R	Eppendorf		Termomikser w lodówce
inkubator	Eppendorf
250 ml probówki stożkowe	Corning	430776
50 ml probówki stożkowe	BD Falcon	352098
Ultraclear probówki wirówkowe	Beckman Coulter	344059
JOKLIK modyfikowany MEM	Lonza	04-719Q
Płodowa surowica bydlęca	Atlas	F-0500-A	Inaktywowana termicznie
L-glut:pen:strep	Gemini Bio-Products	400-110
1 M Tris-HCl pH 8,0	Mediatech	46-031-CM
Chlorek magnezu	Fisher	BP214-500
Chlorek potasu	MP Biomedicals	194844
HEPES	Fisher	BP310-500
DTT	Alexis Biomedicals	280-001-G-010
Glicerol	Fisher	BP229-4
5 M roztwór chlorku sodu	Mediatech	46-032-CV
EDTA 0,5 M roztwór	Sigma-Aldrich	E7889-100ml
EDTA	Fisher	BP120-500
PMSF	Thermo Scientific	36978
Siarczan amonu	Fisher	A702-500
Kompletne tabletki koktajlowe z inhibitorem proteazy bez EDTA	Roche	04 693 132 001
Zestaw kaset dializacyjnych Slide-A-Lyzer	Thermo Scientific	66372	MWCO 7,000 0,5 ml-3 ml
15 ml Zestaw młynków do tkanek Dounce	Sigma-Aldrich	D9938-1SET	Dostępne
różne rozmiaryRozwiń zestaw do PCR o wysokiej wierności	Roche	11 732 650 001
10 mM dNTP Mix	Invitrogen	Y02256	10 mM każdy nukleotyd
Zestaw MaxiScript SP6/T7	Ambion	AM1322
m7G(5')ppp(5') G Czapeczka RNA	New England Biolabs	S1404S
Century Marker Template Plus	Ambion	AM7782
Easytides UTP [α-32P] 250 μ Ci	Perkin Elmer	BLU507H250UC
Bufor ładujący żel II	Ambion	8546G
DEPC woda uzdatniona	Ambion	AM9906
10x TAE	Fisher	BP13354
10x	TBE Ameresco Life Sciences	0658-4L
10x PBS	Fisher	BP399-20
Mocznik	Fisher	BP169-212
Nadsiarczan amonu	Bio-Rad	161-0700
TEMED	Fisher	BP150-20
Octan amonu	Fisher	A637-500
40% 19:1 akrylamid: bis-akryloamid	Bio-Rad	161-0144
Glikogen	Roche	10 901 393 001
100% absolutny etanol 200 dowód	Acros	61509-0040
Kwaśny fenol: chloroform	Ambion	9720	Do
płynu do scyntylacji	Fisher	SX18-4
Inhibitor rnazy	Promega	N261B
Alkohol poliwinylowy - PVA	Sigma-Aldrich	P8136-250G
Fosforan kreatyny	Calbiochem	2380
100 mM dATP	Fisher	BP2560-4
SDS	Acros	23042-5000
Proteinaza K	Fisher	BP1700-100
Regulowana jednostka sekwencjonująca	Sigma-Aldrich	Z351881-1EA
Spinacze do segregatorów	Office Depot	838-056
Talerze szklane 20 cm x 42 cm	Sigma-Aldrich	Z352543	1 ZESTAW
Talerze szklane 20 cm x 22 cm	Sigma-Aldrich	Z35252-7	1 ZESTAW
20 cm x 42 cm aluminiowe płyty chłodzące	Sigma-Aldrich	Z352667	1 EA
Przekładki 0,4 mm x 22 cm	Sigma-Aldrich	Z35230-6	1 ZESTAW
dystanse 0,4 mm x 42 cm	Sigma-Aldrich	Z352314-1	1 ZESTAW
grzebień 8-dołkowy	Sigma-Aldrich	Z35195-4	1 EA
Grzebień 16-dołkowy	Sigma-Aldrich	Z351962	1 EA
Grzebień 32-dołkowy	Sigma-Aldrich	Z351970	1
EA Żelowa powłoka odstraszająca	C.B.S. Scientific	SGR-0401	lub SGR-0101 do indywidualnej butelki
Końcówki do ładowania żelem	Rainin	GT-10-4	0,1-10 μ l
Sekwencjonowanie PowerPac HV	Bio-Rad	PowerPac HV	5,000 V/500 mA/400 W
Suszarka żelowa Model 583	Bio-Rad	Model 583
Hydrotech pompa próżniowa do suszarki żelowej	Bio-Rad
Glogos II Markery świecące w ciemności	Agilent	420201
Film 8 x 10	Folia Midsci	BX810
14 x 17	Phenix	F-BX1417
Kaseta autoradiograficzna	Fisher	FBCA 1417	dostępny rozmiar 8 x 10