Izolacja frakcji wzbogaconych jądrami CA1 z wycinków hipokampa w celu zbadania zależnego od aktywności importu jądrowego synaptojądrowych białek przekaźnikowych

Synaptyczne receptory N-metylo-D-asparaginianu (NMDAR) odgrywają kluczową rolę w plastyczności synaptycznej i sygnalizacji przetrwania komórek, podczas gdy aktywacja pozasynaptycznych NMDAR-ów może wywołać neurodegenerację i śmierć komórki. Zmiany te zależą od ściśle kontrolowanej/regulowanej ekspresji genów zależnej od aktywności, a zatem wymagają stałej komunikacji między aktywowanymi synapsami lub dendrytami a jądrem⁷. Kinazy MAP ERK1 / 2 są efektorami dalszej sygnalizacji synaptycznych NMDAR i biorą udział w ekspresji genów indukowanej aktywacją NMDAR, podczas gdy sygnalizacja za pośrednictwem pozasynaptycznego NMDAR nie ma wpływu lub hamuje aktywność ERK1 / 2^8,11.

Istnieje wiele białek, które okazały się przemieszczać między dystalnymi dendrytami a jądrem. Wiele z tych białek zawiera sygnał lokalizacji jądrowej i jest aktywnie transportowanych wzdłuż mikrotubuli w sposób zależny od dyneiny i importyny do jądra^6,9. Co ciekawe, niektóre z tych przekaźników przechodzą do jądra tylko w odpowiedzi na określone bodźce synaptyczne. Na przykład wsteczny transport cyklicznego białka wiążącego element odpowiedzi AMP 2 (CREB2) jest indukowany przez substancję chemiczną LTD, ale nie LTP¹². Zlokalizowana stymulacja synaptyczna zależna od NMDAR napędza regulowany przez CREB koaktywator transkrypcji (CRTC1) do jądra, proces translokacji, który jest zaangażowany w długoterminową plastyczność hipokampa⁴. Niedawno wykazano, że białkowy przekaźnik Jacob przemieszcza się do jądra zarówno po synaptycznej, jak i pozasynaptycznej aktywacji NMDAR i reguluje transkrypcję genu 5 zależną od^CREB. Synaptyczne lub pozasynaptyczne pochodzenie sygnału jest zakodowane w potranslacyjnej modyfikacji Jacoba. Aktywność synaptyczna indukuje zależną od ERK1/2 fosforylację Jacoba w kluczowej serynie w pozycji 180 (pJacobS 180), co jest niezbędne do późniejszej translokacji do jądra w pierwotnej hodowli hipokampa. Co więcej, w neuronach CA1 ostrych wycinków hipokampa pJacobS 180 przemieszcza się do jądra po LTP pobocznym Schaffera, ale nie LTD^1,10. pS180 Jacob prowadzi do zwiększonej ekspresji genów związanych z plastycznością, a ta ekspresja genów wpływa z powrotem na funkcję synaptyczną. W przeciwieństwie do tego, Jacob, który przemieszcza się do jądra po pozasynaptycznej aktywacji NMDAR, nie jest fosforylowany w Ser180 i może być związany z innym kompleksem białkowym w jądrze, powodując "wyłączenie CREB" i wycofanie kontaktów synaptycznych¹⁰.

Większość opublikowanych badań nad importem jądrowym synapto-jądrowego przekaźnika białkowego przeprowadzono w zdysocjowanych pierwotnych kulturach neuronalnych. Dlatego interesujące byłoby sprawdzenie, czy takie odkrycia można odtworzyć w fizjologicznie bardziej odpowiednich warunkach przy użyciu wycinków hipokampa, w których połączenia i funkcje neuronów są znacznie lepiej zachowane. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowany protokół oceny zależnej od LTP translokacji jądrowej przekaźników białkowych za pomocą immunoblottingu. Metoda ta nadaje się również do analizy zależnej od aktywności fosforylacji białek w surowej frakcji jądrowej. W szczególności obecny protokół obejmuje przygotowanie ostrych wycinków hipokampa CA1, indukcję i rejestrację LTP. Następnie region CA1 jest mikroskopowo wycinany w celu wyizolowania stymulowanego regionu. Połączyliśmy i zmodyfikowaliśmy protokół izolacji jądrowej dostarczony przez zestaw do ekstrakcji CellLytic NuCLEAR ze zmianami wprowadzonymi przez Zhao i współpracowników¹⁷. Zoptymalizowana procedura obejmuje lizę wypreparowanych regionów CA1 w hipotonicznym buforze, co pozwala na pęcznienie komórek i uwalnianie jąder. Lizę komórek i morfologię jąder można określić za pomocą badania mikroskopowego. Wzbogacanie jądrowe uzyskuje się poprzez krótki etap wirowania. Analiza immunoblottingu z przeciwciałami przeciwko NeuN i NSE2, specyficznym markerom frakcji jądrowych lub cytozolowych, wskazuje, że podejście to może być wykorzystane jako szybki i powtarzalny protokół do izolacji tych frakcji subkomórkowych i do badania bardzo labilnych modyfikacji potranslacyjnych, takich jak fosforylacja białek. Ponadto metoda ta jest korzystna w przypadku małych próbek tkanek pochodzących z wypreparowanych regionów CA1 wycinków hipokampa i może być stosowana w połączeniu z immunohistochemią wycinków hipokampa.

1. Przygotowanie ostrych plastrów hipokampa z mózgu dorosłego szczura

1. Znieczulić szczury izofluranem. UWAGA: Zabieg należy wykonać przy zamkniętym eksykatorze, nie należy wdychać izofluranu. Upewnij się, że zwierzę jest całkowicie znieczulone.
2. Odetnij głowę szczurowi, szybko odizoluj mózg i zanurz go w wstępnie owęglanym (mieszanina 95% O₂ / 5% CO₂ gazów) lodowatym roztworze Geya (skład w mM: 130 NaCl, 4,9 KCl, 1,5 CaCl₂·2H₂O, 0,3 MgSO₄·2H₂O, 11 MgCl₂·6H₂O, 0,23 KH₂PO₄, 0,8 na₂HPO₄·7H₂O, 5 Glukoza ·H₂O, 25 HEPES, 22 NaHCO₃, pH 7,32) przez 30 min^1,2,10,16.
3. Usuń móżdżek i część kory śródwęchowej. Oddziel półkule korowe nacięciem środkowym strzałkowym, a następnie umieść każdą półkulę na jej przyśrodkowej powierzchni. Następnie wykonać cięcie pod kątem 50-70° (w poprzek 50-70°) wzdłuż krawędzi grzbietowej każdej półkuli^13,14.
4. Przyklej każdą półkulę świeżo ściętą powierzchnią na platformie do krojenia systemu cięcia. Platforma powinna być pokryta wstępnie karbonogennym, lodowatym roztworem Geya.
5. Wytnij 350 μm 50-70° poprzeczne plastry od przedniej do tylnej strony za pomocą wibratomu dostosowanego w celu zminimalizowania oscylacji osi z. Formacja hipokampa, kora podkrążkowa i śródwęchowa, a także kora, która znajduje się grzbietowo-bocznie w stosunku do hipokampa, będą częścią plastrów używanych do eksperymentów^13,14.
6. Przenieść wycinki hipokampa do inkubatora w kształcie litery U i zanurzonego inkubatora i inkubować przez co najmniej 2 godziny w temperaturze 32 °C z karbogenowanym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (ACSF zawierającym w mM: 110 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 CaCl₂·2H₂O, 1,5 MgSO₄·2H₂O, 1,24 KH₂PO₄, 10 Glukoza·H₂O, 27,4 NaHCO₃, pH 7,3)^1,2,10,16.

2. Umiejscowienie elektrod, zapis linii bazowej i indukcja LTP

1. Przenieś wycinek hipokampa do zanurzonej komory zapisowej zamontowanej pod mikroskopem. Perfuzja (6-7 ml/min) z karbogenicznym ACSF przez co najmniej 30 minut w temperaturze 32 °C.
2. Przygotuj szklane mikroelektrody kapilarne wypełnione ACSF (rezystancja końcówki wynosi 3-5 MΩ).
3. Umieścić szklane mikroelektrody wypełnione ACSF we włóknach pobocznych CA1 Schaffera w celu stymulacji oraz w warstwie promieniowej CA1 w celu zapisu fEPSP^1,2,10 (ryc. 2). Odległość między elektrodami powinna wynosić około 300 μm.
4. Wywołanie pobudzających potencjałów postsynaptycznych w polu (fEPSPs) poprzez stymulację włókien pobocznych Schaffera dwufazowymi prostokątnymi impulsami prądowymi (200 ms/polaryzacja) w zakresie 3-4 V.
5. Wykonaj test maksymalnej stymulacji, mierząc zależność wejścia-wyjścia i zdefiniuj siłę stymulacji jako 40% maksymalnych uzyskanych wartości nachylenia fEPSP i utrzymuj ją na stałym poziomie przez cały czas trwania eksperymentu.
6. Rozpocznij zapis linii podstawowej przez co najmniej 15 minut po teście maksymalnej stymulacji. Mierz reakcje na bodźce testowe co minutę przez cały czas trwania eksperymentu. Wykonuj nagrania podstawowe ze stymulacją o niskiej częstotliwości.
7. Zapisuj linię bazową przez co najmniej 30 minut.
8. W przypadku późnej indukcji LTP należy zastosować tetanizację o wysokiej częstotliwości 100 Hz składającą się z trzech 1-sekundowych ciągów bodźców przy 100 Hz z 5-minutowym interwałem między treningami. Aby zwiększyć pole stymulacji w obrębie obszaru CA1, 5 μM bicukuliny można wypłukać w ciągu 2 minut przed tężycą i należy ją wypłukać natychmiast po ostatniej tężyczce.

3. Zbieranie plastrów po indukcji LTP i błyskawicznym zamrożeniu

1. Zatrzymaj nagrywanie LTP na 2 minuty lub 30 minut po trzech ciągach stymulacji tężcowej indukującej późne LTP.
2. Wyjmij elektrody i szybko przenieś plasterek na wstępnie zimną metalową platformę umieszczoną na suchym lodzie. Powtórzyć procedurę dla plastra kontrolnego trzymanego w inkubatorze w kształcie litery U. UWAGA: Podczas pracy z suchym lodem należy używać rękawiczek.
3. Zbierz każdą plasterkę do probówki o pojemności 1,5 ml i przechowuj w temperaturze -80 °C.

4. Izolacja frakcji wzbogaconych jądrowo z regionu CA1 hipokampa

1. Weź 1,5 ml probówek Eppendorfa z zamrożonymi plastrami w temperaturze od -80 °C i trzymaj je na lodzie.
2. Dodać do probówki 0,5 ml świeżego, zimnego buforu TBS zawierającego inhibitory proteazy (PI) i fosfatazy (PS). Inkubować przez 2-3 minuty i przenieść do mikroskopu stereoskopowego. UWAGA: Podczas pracy z PI i PS należy używać rękawic ochronnych i fartucha laboratoryjnego.
3. Wypreparuj obszar warstwy piramidalnej CA1 hipokampa za pomocą dwóch igieł. Użyj jednej igły do przytrzymania plastra pod mikroskopem stereoskopowym, a drugiej igły do cięcia obszaru CA1.
4. Zbierz wycięte regiony CA1 z 5 plasterków (dla każdej grupy) do nowej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 50 μl buforu do lizy (1x hipotoniczny bufor do lizy zawierający w mM: 10 HEPES, 1,5 MgCl₂, 10 KCl, pH 7,9, z PI i PS). Należy pamiętać, że taka ilość materiału będzie wystarczająca do przeprowadzenia 2-3 immunoblotów.
5. Homogenizuj pobraną tkankę, ostrożnie pipetując w górę iw dół. Użyj pipety o pojemności 200 μl. Inkubuj lizat na lodzie przez 5-7 minut, aby komórki mogły pęcznieć.
6. Weź 2 μl lizatu, upuść na szkiełko mikroskopowe i wizualizuj pęcznienie komórek pod mikroskopem jasnego pola. Przy prawidłowym obrzęku komórek jądra pojawiają się jako okrągłe, nienaruszone struktury.
7. Zebrać 20 μl próbki do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml jako "frakcję homogenatu". Dodać 8 μl denaturującego 4x buforu próbki SDS.
8. Pozostałe lizaty odwirować z prędkością 11 000 obr./min przez 1 min.
9. Ostrożnie pobrać supernatant od góry ("frakcję cytozolową"), przenieść do nowej probówki i dodać 20 μl 4-krotnego buforu do próbki.
10. Zawiesić osad w 60 μl buforu hipotonicznego i dodać 20 μl buforu do 4 x próbki. Frakcja ta jest określana jako "frakcja wzbogacona jądrowo".
11. Frakcje homogenatowe, cytozolowe i wzbogacone jądrowo mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C lub -80 °C w celu późniejszego immunoblottingu.

5. Semiilościowe immunoblotting dla białek synaptojądrowych

1. Rozmrozić próbki i gotować je przez 5 minut w temperaturze 95 °C.
2. Weź 5 μl z każdej frakcji i oznacz stężenie białka za pomocą testu amido black lub testu BCA.
3. Załaduj równą ilość próbek białek z frakcji homogenatycznej, cytoplazmatycznej i wzbogaconej jądrowo na SDS-PAGE. Próbki z plastrów kontrolnych i LTP należy umieścić na tym samym żelu w celu bezpośredniego porównania.
4. Wykonaj standardową procedurę western-blotting (zalecany jest transfer na mokro).
5. Zbadaj błony wybranym przeciwciałem. Następnie te same bloty (lub te same próbki prowadzone równolegle) mogą być badane za pomocą markera cytoplazmatycznego - enolazy specyficznej dla neuronu2 (NSE2) i markera jądrowego - NeuN oraz przeciwciała -aktyny jako kontroli obciążenia.

6. Analiza danych

1. Wydajność indukcji LTP może być analizowana przez oprogramowanie Clampfit. Średnie nachylenie zapisów linii bazowej porównano ze spadkami po tężyczce przy użyciu dwukierunkowej ANOVA, p <0,05 uznano za istotnie różne. Wartości nachylenia fEPSP zostały przedstawione na wykresach jako średnia ± S.E.M.
2. W celu ilościowego określenia immunoplam należy zeskanować film autoradiograficzny i przeanalizować zintegrowaną gęstość prążków białkowych za pomocą ImageJ lub prążków fluorescencyjnych z systemem Licor. Wartości prążków immunoreaktywnych powinny być znormalizowane w celu kontroli obciążenia i blottingu. Do porównania grupy kontrolnej i LTP można zastosować nieparametryczny test U-Manna-Whitneya.

Tabela 1. .

Wcześniej pokazaliśmy, że białko synaptojądrowe Jacob gromadzi się w jądrze po indukcji LTP, ale nie LTD1. Co więcej, translokacja Jacoba po stymulacji synaptycznej wymaga aktywacji MAPK ERK1 / 2 i fosforylacji Jacoba w Ser180 (ryc. 1). Fosforylowany Jacob przemieszcza się do jądra w sposób zależny od importyny, a stan fosforylacji może być zachowany przez dłuższy czas poprzez połączenie z pośrednim włóknem αinterneksyna15 (ryc. 1). Fosfostan Jacoba jest ważny dla ekspresji genów zależnych od aktywności i przeżycia komórek. Co ciekawe, aktywacja pozasynaptycznych NMDAR również wpycha Jacoba do jądra, ale w tym przypadku Jacob nie jest fosforylowany w Ser180, a jego akumulacja jądrowa indukuje "wyłączenie" CREB5,10. Opisane powyżej wyniki uzyskano za pomocą protokołów ustalonych w naszym ostatnim badaniu (patrz Karpova i wsp.10 w celu szczegółowego opisu modelu).

Aby udowodnić, że Jacob przemieszcza się do jądra po indukcji LTP, wyindukowaliśmy i zmierzyliśmy indukcję wzmocnienia fEPSP pobocznego Schaffera w ostrych wycinkach hipokampa, a następnie wyizolowaliśmy jądra neuronów z neuronów CA1 (Rysunki 2 i 3). Porównaliśmy dwa różne punkty czasowe po zastosowaniu stymulacji o wysokiej częstotliwości (2 minuty i 30 minut) i zarejestrowaliśmy indukcję LTP dla każdego fragmentu, który został następnie przetworzony w celu izolacji jądrowej i western blotting (ryc. 2 i 3). Wzbogacenie neuronalnego markera jądrowego NeuN można zaobserwować we frakcji wzbogaconej w jądra przygotowanej z wypreparowanego regionu CA1, podczas gdy cytozolowy marker neuronalny enolase2 (NSE) jest najczęściej obecny we frakcji supernatantu otrzymanej po odwirowaniu lizowanych komórek (Figura 4A). Swoistość przeciwciała Jacoba pS180 została scharakteryzowana wcześniej (szczegóły patrz Karpova i wsp.10). pS180 Poziomy Jacoba pozostały niezmienione w całkowitych homogenatach białka CA1 i we frakcji wzbogaconej jądrowo 2 minuty po tetanizacji (Figura 4B), ale znaleźliśmy znaczny wzrost immunoreaktywności pJacobS 180 30 minut po indukcji LTP (Figura 4C), potwierdzając, że Jacob translokujący się do jądra w tym modelu plastyczności komórkowej jest fosforylowany w Ser180.

Rysunek 1. Jacob fosforylowany w S180 koduje synaptyczne pochodzenie sygnałów NMDAR. Tężcowa stymulacja włókien pobocznych schaffera w hipokampie powoduje aktywację synaptycznych NMDAR, a następnie aktywację kaskady sygnalizacyjnej MAPK ERK1/2. Aktywowany ERK1 / 2 wiąże się i fosforyluje Jacoba w serynie 180, a kompleks Jacob-ERK1 / 2 przemieszcza się do jądra, co koreluje ze zwiększoną aktywnością CREB i aktywacją ekspresji genów związanych z plastycznością.

Rysunek 2. Sprzęt i narzędzia używane do indukcji LTP i preparowania regionu CA1 z wycinków hipokampa. A) Wibratomium stosowane do przygotowania ostrych plastrów hipokampa (1 - Wibratom) B1-2) Konfiguracja elektrofizjologii i obrazowania (2 - Mikroskop; 3 - Mikromanipulator i system perfuzyjny; 4 - Elektroda kodująca; 5 - Elektroda stymulacyjna; 6 - Soczewka obiektywu wodnego; 7 - Uchwyt na plasterki z plastrem hipokampa) C)Sprzęt używany do preparowania regionu CA1 z wycinków hipokampa (8. Mikroskop stereoskopowy; 9 - Strzykawka insulinowa z igłami; 10 - Małe nożyczki chirurgiczne; 11 - Skalpel; 12 - Plastikowa pipeta Pasteura; 13 - Cienka szpatułka; 14-100 mm plastikowe naczynie hodowlane wypełnione lodowatą wodą i 40 mm plastikowe naczynie hodowlane używane do rozcinania plastrów.

Rysunek 3.Kreskówka przedstawiająca procedurę eksperymentalną. Liczby wskazują kroki w protokole. 2.1-2.8) Ostra szczelina hipokampa w zanurzonej komorze ze szklanymi elektrodami umieszczonymi w warstwie promieniowej w celu wzmocnienia synaps obocznego CA1 Schaffera. Wstawka reprezentuje ścieżki analogowe fEPSP próbki, pozioma kreska wskazuje 5 ms, a pionowa kreska wskazuje 0,5 mV. 3.3) Plastry zebrano do probówek o pojemności 1,5 ml po zarejestrowaniu LTP i zamrożono. 4.3) Wypreparowanie regionu CA1 z wycinków hipokampa dorosłego szczura. 4.4-4.5) Regiony CA1 homogenizowane w hipotonicznym buforze do lizy, co powoduje osmotyczne pęcznienie komórek i uwalnianie jąder. 4.8) Odwirowanie lizatów przy 11 000 obr./min przez 1 min. 4.10) Pobieranie frakcji wzbogaconych cytoplazmatycznych i jądrowych do immunoblottingu. 5.3) Ładowanie frakcji cytoplazmatycznych i wzbogaconych jądrowo na SDS-PAGE, a następnie standardowe western-blotting.

Rysunek 4. Indukcja CA1 LTP prowadzi do akumulacji pJacS180 w jądrze. A) Immunoblot dla homogenatycznych, cytozolowych i wzbogaconych jądrowo frakcji lizatu CA1 sondowany markerami cytozolowymi i jądrowymi. ZA)Analiza immunoblot poziomu pJac-S180 w homogenacie 2 min i 30 min po indukcji tężcowania. C)Analiza immunoblot poziomu pJacS180 we frakcji wzbogaconej jądrami 2 min i min po tężyzacji. Wyniki te są częścią wykresu kwantyfikacyjnego opublikowanego w Karpova et al10. Te reprezentatywne immunobloty nie zostały uwzględnione w oryginalnej publikacji.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.