Zautomatyzowane wizualne zadania poznawcze do rejestrowania aktywności neuronalnej za pomocą labiryntu projekcji podłogowej

Podsumowanie

Opisujemy protokoły szkolenia szczurów do przewlekłych zapisów elektrofizjologicznych w pełni zautomatyzowanych zadaniach poznawczych w labiryncie projekcji podłogowej.

Streszczenie

Zadania neuropsychologiczne stosowane u naczelnych do badania mechanizmów uczenia się i pamięci są zazwyczaj zadaniami poznawczymi kierowanymi wizualnie. Opracowaliśmy wizualne zadania poznawcze dla szczurów za pomocą labiryntu projekcyjnego^1,2, które są zoptymalizowane pod kątem zdolności wzrokowych szczurów, umożliwiając silniejsze porównania wyników eksperymentów z innymi gatunkami.

W celu zbadania neuronalnych korelatów uczenia się i pamięci, zintegrowaliśmy nagrania elektrofizjologiczne z w pełni zautomatyzowanymi zadaniami poznawczymi w Labiryncie Projekcji Pięter^1,2. Oprogramowanie behawioralne połączone z systemem śledzenia zwierząt umożliwia monitorowanie zachowania zwierzęcia z precyzyjną kontrolą prezentacji obrazu i ewentualności nagród dla lepiej wyszkolonych zwierząt. Integracja z systemem rejestracji elektrofizjologicznej in vivo umożliwia badanie behawioralnych korelatów aktywności neuronalnej w wybranych epokach danego zadania poznawczego.

Opisujemy protokoły dla systemu modelowego, który łączy automatyczną wizualną prezentację informacji dla gryzoni i wewnątrzczaszkową nagrodę z metodami elektrofizjologicznymi. Nasz system modelowy oferuje wyrafinowany zestaw narzędzi jako ramy dla innych zadań poznawczych, aby lepiej wyizolować i zidentyfikować konkretne mechanizmy przyczyniające się do określonych procesów poznawczych.

Wprowadzenie

Zadania wizualne są powszechnie używane w badaniach na ludziach i małpach do badania mechanizmów leżących u podstaw uczenia się i pamięci. Modele gryzoni są jednak łatwiej dostępne dla badaczy w przypadku badań na większą skalę, lepiej kontrolowanych, a ich dodatkową zaletą jest umożliwienie stosowania bardziej inwazyjnych technik elektrofizjologicznych. W połączeniu z innymi podejściami, takimi jak manipulacje genetyczne, zapisy elektrofizjologiczne u swobodnie poruszających się szczurów stanowią użyteczny model do precyzyjnego celowania w mechanizmy i obwody leżące u podstaw procesów poznawczych. Zadania wzrokowe naczelnych wymagają od badanych skierowania wzroku na bodźce wzrokowe na monitorze, podczas gdy zadania na szczurach wymagają od badanych interakcji z otoczeniem. Labirynt projekcyjny wykorzystuje naturalną skłonność szczurów do aktywnego eksplorowania otoczenia, jednocześnie zwracając uwagę na bodźce wzrokowe.

Zadania kognitywne z wykorzystaniem urządzeń z ekranem dotykowym zaprojektowanych specjalnie dla gryzoni pozwoliły na lepsze przełożenie wyników z modeli gryzoni na ludzi³. Zadania związane z ekranem dotykowym są zazwyczaj wykonywane w komorze z dwuwymiarowymi bodźcami wizualnymi prezentowanymi pionowo na ścianach^3-7. Te zadania na ekranie dotykowym wymagają od fotografowanego cofnięcia się w kierunku docelowego bodźca wzrokowego i przerwania wiązki światła podczerwonego lub naciśnięcia podkładki dociskowej, aby zarejestrować jego reakcję. Dowody anatomiczne i behawioralne sugerują jednak, że szczury przetwarzają informacje wizualne w dolnej półkuli wzrokowej bardziej efektywnie w celu kierowania zachowaniem^8-10. Nasze laboratorium opracowało zadania poznawcze z wykorzystaniem Labiryntu Projekcji Podłogowej², w którym dwuwymiarowe bodźce wizualne są z powrotem rzutowane na podłogę areny testowej. W labiryncie projekcji podłogowej szczury mogą być śledzone podczas wykonywania zadań na dużej otwartej arenie w porównaniu z aparatem z ekranem dotykowym. W ten sposób informacje przestrzenne w zarejestrowanej aktywności neuronalnej mogą być uzyskiwane jako dodatek do neuronalnych korelatów informacji wizualnych i podejmowania decyzji.

Dostarczamy stymulację wewnątrzczaszkową (ICS) do przyśrodkowego pęczka przodomózgowia (MFB) jako nagrodę¹¹. Ta metoda dostarczania nagród ma przewagę nad nagrodami w postaci jedzenia i picia. Nagrody w postaci jedzenia i picia mogą prowadzić do sytości, nawet u szczurów pozbawionych pokarmu, ograniczając liczbę prób, które zwierzę wykona i potencjalnie spowalniając proces szkolenia. ICS zapewnia natychmiastową nagrodę, zapewniając natychmiastową informację zwrotną na temat wydajności zadań. Natychmiastowa nagroda skutkuje szybszym kształtowaniem i przyswajaniem oraz znacznie skraca czas trwania protokołów treningowych. Co więcej, podczas jednej sesji można wykonać większą liczbę prób, co zwiększa ilość zbieranych danych i skutkuje bardziej wiarygodną próbką zachowań związanych z zadaniami.

Korzystając z Labiryntu Projekcji Podłogowej, opiszemy ogólny protokół kształtowania zachowania szczurów do wykonywania złożonych zadań poznawczych. Ten ogólny protokół zapewnia ramy do szkolenia szczurów w różnych zadaniach stosowanych obecnie do rejestrowania neuronalnych korelatów uwagi i dyskryminacji^wzrokowej1. W ten sposób labirynt projekcyjny jest zoptymalizowany pod kątem zdolności wizualnych szczurów i pozwala na silniejsze porównania z zadaniami wzrokowymi u ludzi i naczelnych.

Protokół

Wszystkie procedury były zgodne z wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Brown.

1. Przegląd systemów

System śledzenia wideo współdziała z systemem kontroli behawioralnej, aby monitorować postępy szczura w danym zadaniu, oceniać zachowania docelowe, kontrolować prezentację bodźców i dostarczać nagrody w oparciu o postępy szczura. System rejestracji elektrofizjologicznej vivo gromadzi dane neuronowe do analiz związanych ze zdarzeniami. (Rysunek 1A).

1. Labirynt projekcyjny
   1. Floor Projection Maze² to otwarte pole bez ścian (147,3 cm x 111,8 cm) z przezroczystą bezbarwną podłogą z pleksiglasu (0,6 cm grubości). Spód podłogi to ekran z tkaniny Dual Vision o wzmocnieniu jedności, który jest naciągnięty na drugi prostokąt z kawałków pleksiglasu (147,3 cm x 111,8 cm x 1,25 cm) do projekcji tylnej za pomocą projektora krótkiego rzutu.
   2. Podłącz projektor do karty graficznej w komputerze z systemem behawioralnym. Trzymaj pleksi, tkaninę ekranową i projektor za pomocą ramy z anodyzowanego aluminium.
   3. Zamontuj anodyzowaną ramę nad głową, aby zamontować górną kamerę i system kół pasowych, aby połączyć ICS i uwiązania sceny czołowej ze szczurem.
      nuta: Podłącz ramę trzymającą labirynt projekcyjny i ramę górną, aby zapewnić ciągłość elektryczną i uziemienie do przedwzmacniacza.
2. Śledzenie wideo
   1. Nagrywaj, śledź i analizuj filmy w czasie rzeczywistym za pomocą jednej kamery górnej opisanej w kroku 1.2.2.
   2. Zamontuj górną kamerę (standard VGA, 80 kl./s) na górnej ramie z anodyzowanego aluminium, aby monitorować szczura
   3. Użyj diod elektroluminescencyjnych (LED) przymocowanych do sceny głowy szczura, aby monitorować pozycję szczura, lub śledź środek ciężkości konturu szczura za pomocą automatycznego systemu śledzenia.
   4. Użyj modułu CinePlex Basic Behavior, aby przeanalizować dane o położeniu w trybie online, a także zapisać plik danych do dalszej analizy w trybie offline.
      nuta: Używamy CinePlex Behavioral Research System 3.4.1 do rejestrowania, śledzenia i analizowania pozycji szczura. Moduł CinePlex Tracking służy do śledzenia szczura. Aby skutecznie śledzić postępy zwierzęcia, użyj modułu CinePlex Basic Behavior, aby utworzyć strefy w przestrzeni dwuwymiarowej w odpowiednich miejscach labiryntu, które mają znaczenie w zadaniu. Strefy mogą być łączone w sekwencje, a zdarzenia logiczne CinePlex (takie jak wejścia do stref i spełnienie sekwencji) są przypisywane w taki sposób, że jeśli szczur spełnia kryteria zdarzenia, zdarzenie staje się prawdziwe. Przypisz zdarzenia z wyjściami cyfrowymi i interfejsem za pośrednictwem karty wejściowej superport do systemu behawioralnego.
3. W pełni zautomatyzowany system kontroli behawioralnej
   1. Arena testów behawioralnych: Użyj odpowiednio ukształtowanej areny testowej do zadania behawioralnego w labiryncie projekcji podłogowej. Zbuduj arenę za pomocą matowego białego akrylu i umieść ją bezpośrednio w labiryncie projekcyjnym na podłodze.
      Uwaga: Wymiary można dostosować do używanego zadania behawioralnego. Ściany mają zazwyczaj 45-50 cm wysokości. Tutaj używamy dwustronnych aren testowych (labirynt z muszką¹²), aby zmaksymalizować liczbę prób wykonywanych podczas sesji (rysunek 1B dla wymiarów labiryntu z muszką). Arena testowa ma cztery wyznaczone obszary zdefiniowane w oprogramowaniu śledzącym: Wschodni obszar obrazu, Zachodni obszar obrazu, Wschodni obszar gotowości próbnej i zachodni obszar gotowości próbnej (rysunek 1C).
   2. System behawioralny: System interfejsu behawioralnego kontrolowany przez oprogramowanie MED-PC IV uruchamia programy napisane wewnętrznie w notacji MEDstate (patrz Dodatek). Wykorzystaj zdarzenia z systemu behawioralnego CinePlex, aby śledzić postępy szczura podczas zadania, kontrolować prezentację obrazu, dostarczać sygnały dźwiękowe i dostarczać nagrodę.
      1. Połącz kartę wyjściową superport z cyfrowym wejściem Omniplex, aby uzyskać oznaczone czasem zdarzenia behawioralne w środowisku oprogramowania PlexControl do analiz offline. Emituj sygnały dźwiękowe za pomocą programowalnego generatora dźwięku.
         nuta: Zdarzenia behawioralne z prezentowanej tutaj aparatury mogą obsługiwać sprzęt innych firm (np. laser do stymulacji optogenetycznej) za pośrednictwem karty transmisji danych, jeśli jest to wymagane.
      2. Umieść kartę wyjściową superport, kartę wejściową superport i programowalny generator audio w stołowej szafie interfejsu. Połącz karty z kartą PCI DIG-704PCI-2 zainstalowaną w komputerze osobistym (PC) za pomocą karty dekodera DIG-700F zainstalowanej w szafie stołowej.
      3. Dostarcz szczurowi dwubiegunowy ICS fali prostokątnej za pomocą programowalnego stymulatora samostymulacji wewnątrzczaszkowej. Podłącz stymulator do komputera za pomocą karty COM PHM152. Zalecane parametry ICS: Czas trwania impulsu 1 i 2: 500 μs; Opóźnienie między impulsem 1 a 2: 500 μs; Częstotliwość: 100 Hz.
         nuta: Dostarczanie ICS jest zautomatyzowane podczas zadania, ale może być dostarczone ręcznie za pomocą programowalnej skrzynki przycisków połączonej z modułem SmartCtrl.
4. System akwizycji danych neuronowych
   1. Upewnij się, że rama labiryntu projekcyjnego i system ICS są uziemione do przedwzmacniacza systemu akwizycji danych neuronowych Omniplex, aby zminimalizować szumy elektryczne w nagraniach neuronowych.
   2. Jednocześnie zbieraj dane neuronowe, współrzędne pozycyjne z CinePlex i flagi zdarzeń behawioralnych z systemu behawioralnego w pliku danych do analiz offline.

2. Przygotowanie zwierząt

1. zwierzęta
   1. Zdobądź naiwne 22-dniowe samce szczurów Long-Evans
   .
   2. Trzymaj szczury w parach i pozwól im zaaklimatyzować się w wiwarium przez tydzień.
   3. Ze szczurami należy obchodzić się codziennie przez ~5 min.
   4. Gdy szczury osiągną 250-275 g, rozpocznij harmonogram karmienia, utrzymując masę ciała na poziomie 85-90% masy wolnego karmienia. Wagę docelową zwiększa się o 10 g / miesiąc, aż szczury osiągną 350 g.
   5. Szczury należy trzymać w jednym pomieszczeniu i kontynuować harmonogram karmienia przez co najmniej tydzień przed rozpoczęciem operacji w celu wszczepienia stymulacji i zarejestrowania elektrod.
2. Implantacja chirurgiczna
   Przeprowadzaj zabiegi chirurgiczne w standardowych warunkach aseptycznych oraz zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i regulacyjnymi.
   1. Znieczulić szczury izofluranem.
   2. Wykonaj nacięcie w skórze głowy, aby odsłonić czaszkę w celu oczyszczenia i identyfikacji bregmy i lambdy.
   3. Wykonaj kraniotomię na odpowiednich współrzędnych.
   4. Przymocuj kotwiące czaszkę.
   5. Opuść końcówkę elektrody ICS do MFB, podając następujące współrzędne: przednio-tylna, -2,7 mm od bregma; boczna, ±1,8 mm; grzbietowo-brzuszna, -8,5 mm od powierzchni czaszki. Druga elektroda ICS może zostać wszczepiona w przeciwległą półkulę jako kopia zapasowa w przypadku awarii elektrody.
   6. Przymocuj elektrody ICS do czaszki i przykręć kotwiące cementem kostnym. Nie należy cementować cokołu (plastikowej obudowy elektrody stymulującej) elektrod.
   7. Opuść elektrody rejestrujące w interesujące Cię miejsce i zabezpiecz urządzenie cementem kostnym.
   8. Ustawić cokół ICS z dala od urządzenia rejestrującego i przymocować elektrody ICS i urządzenia rejestrujące do kotwiących za pomocą cementu kostnego.
   9. Odczekaj co najmniej siedem dni na regenerację przed rozpoczęciem przyzwyczajania się do protokołu kształtowania.

3. Kształtowanie behawioralne: Ogólne kształtowanie składa się z trzech etapów: wczesnego, pośredniego i późnego kształtowania (Rysunek 2).

Uwaga: Celem kształtowania na wczesnym i średnim poziomie jest wyszkolenie szczura do utrzymywania stałej 'pozycji gotowości' w Strefie Gotowości dla każdej próby i przeprowadzenia wielu prób podczas sesji. Częściowo automatyzuj kształtowanie behawioralne, dzięki czemu trening można dostosować do indywidualnych wskaźników uczenia się szczura. Gdy szczur utrzymuje udaną "pozycję gotowości", przystąp do kształtowania specyficznego zadania (późne kształtowanie) w celu przeniesienia szczura do w pełni zautomatyzowanego protokołu w celu precyzyjnej i bezstronnej kontroli behawioralnej (ryc. 2).

1. Wczesne kształtowanie (rysunek 2A)
   1. Dzień 1: Przyzwyczaj szczura do pokoju behawioralnego na 10 minut z włączonym sprzętem, a następnie wróć do kolonii.
   2. Dzień 2: Powtórz krok 1, a następnie przyzwyczaj zwierzę do areny testowej przez 10 minut.
   3. Dzień 3: Podłącz ICS i uwięzi na scenie głównej do szczura i przyzwyczaj szczura do areny testowej przez 10 minut.
   4. Dzień 4: Określ najniższą amplitudę ICS, aby ustalić preferencję miejsca za pomocą nieformalnego protokołu warunkowania preferencji miejsca. Miareczkowanie impulsu o amplitudach 1 i 2. Typowe wartości amplitudy to 20-80 μA.
   5. Od dnia 5: Dostarcz nagrodę ICS, aby wyszkolić szczury, aby kojarzyły obszar gotowości oraz prezentacje obrazów ze wschodu i zachodu z nagrodą ICS. Kontynuuj, aż szczur będzie na przemian przechodził między wschodnimi i zachodnimi obszarami obrazu.
2. Kształtowanie pośrednie (rysunek 2B).
   1. Wprowadź biały szum (50 dB), aby zasygnalizować rozpoczęcie próby. Wyłącz biały szum, gdy szczur wejdzie do obszaru gotowości.
   2. Zautomatyzuj dostarczanie ICS w celu wejścia do strefy gotowości i udanego ukończenia "pozycji gotowości". Dostosuj prawdopodobieństwo dostarczenia ICS przy wejściu i pomyślnej "pozycji gotowości", aby wzmocnić zachowanie.
      nuta: Dostosuj prawdopodobieństwo nagrody ręcznie, aby dopasować je do wydajności poszczególnych szczurów podczas kształtowania. Zmniejszono prawdopodobieństwo otrzymania nagrody za wejście do strefy gotowości i utrzymanie udanych pozycji gotowości. Zalecane końcowe prawdopodobieństwo nagrody za wypełnienie udanych pozycji wynosi 5-10%. Szczury są nagradzane za wszystkie poprawne wybory.
   3. Zacznij od krótkich czasów "pozycji gotowości" (np. 200 ms). Stopniowo zwiększaj czas trwania "pozycji gotowości" w krokach co 100 ms.
   4. Włącz biały szum, jeśli szczur przedwcześnie przekroczy "pozycję gotowości", więc szczur musi wznowić próbę.
   5. Przejście do późnego kształtowania, gdy szczur trzyma się w "pozycji gotowości" przez maksymalnie 1,200 ms.
3. Późne kształtowanie (rysunek 2C).
   nuta: Trening w późnym kształtowaniu jest specyficzny dla zadania, w którym szczur będzie wykonywał. Zautomatyzuj szkolenie na tym etapie kształtowania, aby uzyskać precyzyjną i bezstronną kontrolę wszystkich parametrów zadania, ale zachowaj elastyczność w ręcznym dostarczaniu nagród ICS. Opisano protokoły treningowe dla dwóch zadań.
   1. Zadanie wizualnej dyskryminacji dwuwarunkowej (vBCD): Użyj różnych bodźców wizualnych, aby wytrenować szczury w zakresie prostego kształtu i rozróżniania luminancji.
      1. Rozpocznij próbę, włączając biały szum.
      2. Losowo narzucaj opóźnienia "pozycji gotowości" wynoszące 700 – 1,200 ms.
      3. W razie potrzeby należy ręcznie dostarczyć system ICS w celu wzmocnienia udanych "pozycji gotowości".
      4. Zaprezentuj parę obrazów w obszarze prezentacji obrazu. Pseudolosowo prezentuj poprawny obraz po lewej lub prawej stronie obszaru obrazu.
      5. Dostarcz ICS, aby uzyskać prawidłową reakcję i oczyść podłogę. Prawidłowa reakcja jest rejestrowana, gdy szczur wejdzie do strefy, w której znajduje się prawidłowy obraz. Tylko pierwszego dnia treningu emituj impuls białego szumu o natężeniu 75 dB, aby odstraszyć od nieprawidłowej odpowiedzi.
      6. Wydanie wersji próbnej korygującej po nieprawidłowej próbie. Próby korekcyjne mają identyczne parametry (opóźnienie lewej lub prawej strony i "pozycji gotowości") jak poprzednia nieprawidłowa próba.
      7. Gdy szczury będą w stanie z powodzeniem przeprowadzić prostą dyskryminację, wprowadź różne wzorce podłogi, aby wytrenować regułę dyskryminacji dwuwarunkowej.
      8. Przedstaw nową parę obrazów i dwa odrębne wzory podłóg, które posłużą jako kontekst. Poprawny obraz jest uzależniony od wzoru podłogi; np. gwiazda jest prawidłowa, gdy podłoga jest szara, a białe kółko jest prawidłowe, gdy podłoga jest w paski (rysunek 3C).
      9. Pseudolosowo przypisz wzór podłogi i pozycję (po lewej lub prawej) właściwego obrazu dla każdej próby, upewniając się, że próby są równoważone.
      10. Implementacja prób korekcyjnych po nieprawidłowym badaniu, w którym parametry badania są identyczne z poprzednim badaniem.
   2. Zadanie uwagi wzrokowo-przestrzennej (VSA): Umieść podświetlone białe okręgi w określonych lokalizacjach przestrzennych na arenie, aby wyszkolić szczury, aby zbliżyły się do przestrzennego położenia okręgu docelowego.
      nuta: W tym zadaniu arena ma szare okręgi w różnych lokalizacjach przestrzennych we wschodnim i zachodnim obszarze obrazu. Po udanym "ustawieniu w pozycji gotowości" okrąg celu zaświeci się (zmieni kolor na biały), a szczur musi zbliżyć się do tego miejsca docelowego (rysunek 3B).
      1. Losowo narzucaj opóźnienia "pozycji gotowości" wynoszące 1,000-1,600 ms na zasadzie próba po próbie.
      2. W razie potrzeby należy ręcznie dostarczyć system ICS w celu wzmocnienia udanych "pozycji gotowości".
      3. Po zakończeniu "pozycji gotowości" losowo podświetl jedno z szarych kółek.
      4. Dostarcz ICS, gdy szczur wejdzie w strefę oświetlonego kręgu.
      5. Wyłącz oświetlenie i rozpocznij następną próbę po przeciwnej (wschodniej lub zachodniej) stronie.
      6. Na początku późnego kształtowania oświetlaj krąg, dopóki szczur się do niego nie zbliży lub do zakończenia próby (5 sekund po zapaleniu koła). Oceniaj każdą próbę jako poprawną lub pominiętą. W przypadku prób pominięcia oświetl całą podłogę (na niej pokazano białą podłogę), a żadna nagroda nie będzie dostępna do następnej próby.
      7. Gdy wydajność szczura osiągnie 80% poprawności, zmniejsz czas, przez jaki okrąg pozostaje oświetlony do 1 sekundy. Szczur ma 5 sekund na dokonanie wyboru.
      8. Nie nagradzaj za niepoprawne próby. Rozpocznij następną wersję próbną.
      9. Jeśli próba z pominięciem, oświetl podłogę i rozpocznij nową próbę.
      10. Przy 80% poprawności jeszcze bardziej zmniejsz czas podświetlenia okręgu celu do 500 ms.
      11. Lokalizacje docelowe wybieraj losowo przed każdą próbą. Szczur będzie miał 5 sekund na dokonanie wyboru, zanim cała podłoga zaświeci się, sygnalizując koniec tej próby.
      12. Nie nagradzaj za nieprawidłowe lub pominięte próby. Szczur musi zainicjować nową próbę po przeciwnej stronie areny.
      13. Uwaga: W każdym obszarze obrazu można dodać dodatkowe okręgi, aby jeszcze bardziej zwiększyć trudność zadania.

Wyniki

Celem ogólnych etapów kształtowania jest zaaklimatyzowanie szczura do areny testowej, wytrenowanie go tak, aby pozostawał w nieruchomej 'pozycji gotowości' do prezentacji docelowych bodźców wizualnych i zbliżenie się do miejsca właściwego bodźca wizualnego. Po przyzwyczajeniu się do sali testowej, areny i uwięzi, wczesne kształtowanie zazwyczaj wymaga 100-150 prób, dopóki szczury nie będą na przemian przechodzić między wschodnią i zachodnią stroną areny. Podczas wczesnego kształtowania szczury zazwyczaj biegają po obszarze gotowości w środku areny i spędzają większość czasu na eksploracji obwodu areny (Rysunek 4A). Szczury na pośrednim etapie kształtowania stopniowo uczą się utrzymywać nieruchomą "pozycję gotowości" w obszarze gotowości, co wymaga 600-700 prób. W tym momencie ścieżki zwierząt są stereotypowymi pętlami od obszaru gotowości do obszaru obrazu, a mniej czasu spędza się na eksploracji obwodu labiryntu. Jednak szczury nie utrzymują stacjonarnej "pozycji gotowości", na co wskazuje prędkość, z jaką szczury przemierzają środkową strefę gotowości (rysunek 4B).

Pod koniec kształtowania pośredniego, szczury utrzymują nieruchomą 'pozycję gotowości' w obszarze gotowości przed zbliżeniem się do docelowego bodźca wizualnego. Następnie szczur inicjuje kolejną próbę po przeciwnej stronie areny (ryc. 4C).

Integracja oprogramowania śledzącego i Systemu Akwizycji Danych Neuronowych z systemem kontroli behawioralnej pozwala na analizę danych neuronowych związanych ze zdarzeniami. Sterowane matryce elektrod mogą być strategicznie rozmieszczone w celu rejestrowania pojedynczej jednostki i lokalnej aktywności potencjału pola. Zapisy przeprowadzono w korze zabrzętowej, gdy szczury wykonywały zadanie vBCD. Histogramy peryzdarzeń i wykresy rastrowe pokazują, że komórki w korze zabrzędowej reagują na początek docelowego bodźca wzrokowego i na początek wzorca podłogi (ryc. 5A). W tylnej korze ciemieniowej szczurów wykonujących zadanie VSA komórki reagują na prezentację obrazu, a gdy wybór został dokonany, wchodząc do strefy, która zdefiniowała obraz docelowy (ryc. 5B). Aktywność potencjału pola lokalnego w tylnej korze ciemieniowej podczas wykonywania zadania VSA wykazuje dużą moc w zakresie theta (~8 Hz), gdy szczury są w "pozycji gotowości" przed prezentacją obrazu (ryc. 5C).

Rysunek 1. Konfiguracja eksperymentalna. ZA. Schemat pomieszczeń behawioralnych i kontrolnych. Labirynt projekcyjny znajduje się w pokoju behawioralnym. Szczury są monitorowane za pomocą kamery nad głową. W sterowni znajduje się sprzęt do sterowania zadaniem i zbierania danych neuronowych. Ur. Wymiary labiryntu z muszką. C. Zrzut ekranu CinePlex Studio. Strefy są definiowane przez użytkownika. Zdarzenia logiczne są wysyłane jako cyfrowe wyjścia CinePlex do systemu kontroli behawioralnej (Med Associates) w celu monitorowania postępów szczura. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Rysunek 2. Schemat etapów kształtowania. ZA. We wczesnym kształtowaniu szczur otrzymuje ICS za wejście do Obszaru Gotowości oraz wejście do Wschodniego i Zachodniego Obszaru Obrazu. Celem jest wytrenowanie szczura, aby kojarzył te obszary z nagrodą ICS. Ur. Kształtowanie pośrednie koncentruje się na szkoleniu szczurów do utrzymywania stacjonarnej "pozycji gotowości" w obszarze gotowości. Obrazy są prezentowane dopiero po utrzymaniu udanej "pozycji gotowości". Szczury nadal otrzymują ICS za zbliżenie się do obrazu w obszarze obrazu. C. W późnym okresie kształtowania szczur z powodzeniem utrzymuje nieruchomą "pozycję gotowości". Trening jest specyficzny dla zadania, a szczur jest szkolony, aby nauczyć się określonych zasad wykonywania danego zadania. Błyskawica sygnalizuje dostawę ICS. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Rysunek 3. A. Schemat zadania vBCD. Gdy podłoga jest szara, gwiazda jest nagradzana; Gdy podłoga jest w paski, białe kółko jest nagradzane. B. Schemat zadania VSA. Szare kółka wskazują lokalizacje docelowe w obszarach obrazu. Bodźcem docelowym jest krótkie (500 ms) podświetlenie (białe) jednego z okręgów. Szczury są nagradzane za zbliżenie się do właściwego miejsca docelowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Rysunek 4. Przykładowe ścieżki podczas kształtowania. Umieść dane z dwuminutowych segmentów szczura wykonującego różne etapy kształtowania. Prędkość zwierzęcia jest reprezentowana przez mapę cieplną. Zimne kolory reprezentują najwolniejsze prędkości, a gorące reprezentują najszybsze prędkości. ZA. Podczas wczesnego kształtowania szczury eksplorują i gromadzą się na zewnętrznych ścianach wschodnich i zachodnich obszarów obrazu i nie zatrzymują się w obszarze gotowości. B. W kształtowaniu średniozaawansowanym zaczyna się wyłaniać stereotypowa ścieżka. Ścieżki tworzą pętlę prowadzącą do obszarów obrazu z powrotem do obszaru gotowości. Szczury zaczynają z powodzeniem utrzymywać "pozycję gotowości" w obszarze gotowości. C. Kiedy szczury przechodzą do późnego kształtowania, szczury utrzymują stacjonarne "pozycje gotowości", a ścieżki szczurów są bardziej stereotypowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 5. Przykłady analiz związanych z perieventami. A. Komórki zarejestrowane z kory zabrzęcznej podczas zadania vBCD z różnymi reakcjami na prezentację obrazu docelowego (po lewej) i prezentację podłogi (po prawej). B. Komórki zarejestrowane z tylnej kory ciemieniowej podczas zadania VSA z różnymi reakcjami na oświetlenie koła (po lewej). Zwiększono strzelanie po wybraniu położenia przestrzennego, w którym oświetlał się krąg celu (po prawej). C. Spektrogram wykazujący silną moc theta w tylnej korze ciemieniowej w "pozycji gotowości". Pionowa czerwona linia oznacza koniec udanej "pozycji gotowości" i prezentację obrazów. Pionowa niebieska linia wskazuje prezentację piętra 1 na początku próby w zadaniu vBCD. Pionowa zielona linia wskazuje, że wybór został zarejestrowany w zadaniu VSA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Dyskusja

Formalnie opisujemy protokoły szkolenia szczurów w zakresie w pełni zautomatyzowanych, złożonych wizualnych zadań poznawczych w labiryncie projekcji podłogowej. Labirynt projekcji podłogowej został z powodzeniem wykorzystany do ustalenia neuronalnych korelatów koniunkcji obiekt-lokalizacja i sygnałów błędów w korze zabrzeżnej podczas^{wykonywania zadania 1} z dyskryminacją wizualną 2 wyborów.

Protokół kształtowania behawioralnego został zaprojektowany tak, aby był elastyczny, dzięki czemu można go dostosować do indywidualnego tempa uczenia się szczura. Niestandardowy kod napisany dla systemu behawioralnego pozwala eksperymentatorowi kontrolować prawdopodobieństwo automatycznego dostarczania ICS na krytycznych etapach podczas treningu; np. trening w pozycji gotowości. Kod powinien również umożliwiać ręczne dostarczanie ICS za pomocą programowalnego przycisku podczas. Celem Early shaping jest ustanowienie skutecznej stymulacji ICS w celu dostarczania nagrody w celu wzmocnienia zachowania. Jeśli to możliwe, zalecamy obustronne wszczepienie elektrod stymulujących do MFB w przypadku nieskutecznej stymulacji w jednej półkuli. Z naszego doświadczenia wynika jednak, że prawie wszystkie wszczepione elektrody ICS były funkcjonalne, aby dostarczyć satysfakcjonujący bodziec. Pośredni etap kształtowania ma kluczowe znaczenie dla wyszkolenia szczura do utrzymania "pozycji gotowości" w obszarze gotowości. W "pozycji gotowości" szczur powinien być nieruchomy z nosem skierowanym w stronę obszarów obrazu, w których zostaną zaprezentowane wybrane obrazy. "Pozycja gotowości" kontroluje, kiedy pojawiają się obrazy, kierunek, z którego szczur zbliża się do obrazów oraz odległość, z której szczur ogląda obrazy. Zalecamy śledzenie diod LED zamontowanych na głowie szczura w celu monitorowania kierunku, w którym skierowana jest głowa szczura, w celu lepszej kontroli zachowania i bardziej precyzyjnej kontroli prezentacji obrazu docelowego. Ręczne dostarczanie ICS może być wydane w celu przeszkolenia szczurów w celu utrzymania odpowiedniej "pozycji gotowości". Kiedy szczur utrzymuje zadowalające "pozycje gotowości" w każdej próbie, trening w późnym kształtowaniu jest specyficzny dla danego zadania. W późnym kształtowaniu szczury są szkolone do uczenia się określonych zasad wykonywania danego zadania.

Używamy ICS jako naszej metody dostarczania nagrody, ponieważ ta metoda zapewnia natychmiastową informację zwrotną dla szczura, co skutkuje szybszym uczeniem się podczas kształtowania behawioralnego i większą liczbą ukończonych prób podczas sesji podczas zbierania danych neuronowych w zautomatyzowanym zadaniu. Dostarczanie ICS powoduje jednak artefakty elektryczne w nagraniach neuronowych i może być problematyczne w przypadku analizy ciągłych danych LFP lub danych wielojednostkowych. Interwał wokół artefaktu elektrycznego można usunąć w trybie offline z pliku danych rejestracji neuronowej przed ciągłą analizą danych. Stereotypowe artefakty z ICS w danych o spajkach filtrowanych górnoprzepustowo można łatwo usunąć w trybie offline bez wpływu na analizy pojedynczych spajków. Przyszła optymalizacja protokołów dla labiryntu projekcyjnego obejmuje wykorzystanie narzędzi optogenetycznych do dostarczania wewnętrznej nagrody w celu zminimalizowania i wyeliminowania artefaktów związanych ze stymulacją elektryczną.

Labirynt projekcyjny jest zoptymalizowany pod kątem możliwości wizualnych szczurów i dlatego lepiej nadaje się do wizualnie kierowanych zadań behawioralnych. Należy zauważyć, że nie można dokonywać bezpośrednich porównań między paradygmatami eksperymentalnymi w labiryncie projekcji podłogowej a komorami operacyjnymi ze względu na różne stosowane protokoły eksperymentalne i różne definicje kryterium pomyślnego wykonania danego zadania. Wcześniej wykazaliśmy jednak, że szczury nabyły proste zadanie dyskryminacji wizualnej 2 wyborów w ~ 50 próbach w Labiryncie Projekcji Podłogi² w porównaniu z >300 próbami w innych badaniach, w których obrazy były prezentowane pionowo w komorach operantowych^3,10. Zadanie VSA było wzorowane na klasycznym zadaniu reakcji szeregowej^{5 wyborów 13} (5-CSRT) przeznaczony do oceny procesów uwagi wzrokowej. Zazwyczaj 5-CSRT jest przeprowadzany w komorze operacyjnej i wymaga od zwierzęcia szturchnięcia nosa w odpowiednim otworze na nos wskazanym przez błysk światła; tutaj zadanie VSA jest realizowane na otwartej arenie, gdzie zwierzęta muszą pozostać nieruchome w określonym miejscu na arenie, skierować swoją uwagę na miejsca docelowe i czekać na pojawienie się bodźca świetlnego. Z naszego doświadczenia wynika, że szczury potrzebowały ~3,200 prób, aby osiągnąć kryterium (75% w dwóch kolejnych dniach) w 5-CSRT¹⁴ w porównaniu z ~800 próbami w zadaniu VSA w labiryncie projekcji podłogowej.

Kolejną zaletą zadań behawioralnych wykonywanych w labiryncie projekcyjnym jest to, że zadania są wykonywane na dużej otwartej arenie, która wykorzystuje naturalną tendencję szczura do eksploracji otoczenia, w przeciwieństwie do zadań, które wymagają od zwierzęcia skupienia wzroku na nieruchomym celu. Główną zaletą wykorzystania swobodnie poruszających się szczurów na otwartej arenie w aparacie do projekcji podłogowej jest to, że zarówno allocentryczne, jak i egocentryczne informacje przestrzenne mogą być zbierane za pomocą informacji wizualnych. Kolejną zaletą naszego paradygmatu jest to, że zadania nie muszą ograniczać się do prezentacji statycznych obrazów. Położenie i cechy bodźców wzrokowych, które są dynamiczne, mogą być wykorzystane w przyszłych zadaniach. Korzystając z możliwości śledzenia systemu badań behawioralnych CinePlex, można opracowywać zadania w celu bardziej szczegółowego zrozumienia funkcjonalnego danej struktury mózgu. Łącząc jednoczesne zapisy elektrofizjologiczne z wizualnie sterowanymi zadaniami poznawczymi, można zbadać podstawowe pytania o to, w jaki sposób aktywność mózgu jest powiązana z procesami poznawczymi, takimi jak podejmowanie decyzji i dyskryminacja wzrokowa.

Korzystając z zadań kierowanych wizualnie, wyniki badań na szczurach można lepiej przełożyć na ludzi, a ostatecznym celem jest zapewnienie terapii chorób poznawczych u ludzi.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
System akwizycji danych neuronowych OmniPlex D	Wzmacniacz cyfrowy Plexon Inc
DigiAmp	Rama Plexon Inc
do labiryntu projekcyjnego na podłodze	80/20 Inc		15 Series T-slot Projektor
krótkiego rzutu	NEC Display Solutions	WT610E
Ekran koronkowy i przelotowy Da-Lite	Firma produkująca	ekrany Da-Lite81326C
Plexiglas	Modern Plastics
SuperPort Karta wejściowa	Med Associates Inc	DIG-713A
SuperPort Karta wyjściowa	Med Associates Inc	DIG-726
Moduł interfejsu SmartCtrl	Med Associates Inc	DIG-716B
Karta dekodera	Med Associates Inc	DIG-700F
Karta PCI	Med Associates Inc	DIG-704PCI-2
Programowalny generator audio	Med Associates Inc	ANL-926
Programowalny stymulator samostymulacji wewnątrzczaszkowej	Med Associates Inc	PHM-150B	Obsługiwany przez kartę PHM-152COM
2-kanałowa elektroda	Tworzywa sztuczne1	MS303/13/SP	Cięcie 15-20 mm poniżej cokołu
Oprogramowanie	MED-PC IVMed Associates Inc	SOF-735
OmniPlex Software	Plexon Inc
CinePlex Software: moduły śledzenia i podstawowego zachowania	Plexon Inc