Nanopodia to cienkie, ale delikatne kanały błonowe, które rozciągają się do 100 μm od przodu komórki lub z tyłu i wyczuwają środowisko komórkowe. Do obserwacji tych struktur komórkowych wymagane jest bezpośrednie utrwalenie w temperaturze 37 °C, delikatne mycie i unikanie rozpuszczalników organicznych, takich jak etanol, metanol lub aceton oraz wyższych stężeń Triton X-100.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Nanopodia - cienkie, delikatne wypustki błonowe odgrywające rolę w ruchu komórek i interakcjach międzykomórkowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przylegające komórki w hodowli utrzymują stan spolaryzowany, aby wspierać ruch i interakcje międzykomórkowe. Nanopodia to cienkie, wydłużone, w dużej mierze F-aktynowo-ujemne wypustki błonowe w komórkach śródbłonka i raka, które można uwidocznić za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego TM4SF1 (Transmembrane-4-L-six-family-1). Klastry TM4SF1 o średnicy 100-300 μm TMED (TM4SF1 enriched microdomains) zawierające od 3 do nawet 14 pojedynczych cząsteczek TM4SF1. TMED są rozmieszczone z przerwami wzdłuż nanopodiów w regularnych odstępach od 1 do 3 TMED na μm i mocno zakotwiczają nanopodia w matrycy. Dzięki temu nanopodia mogą rozciągać się na więcej niż 100 μm od przodu lub tyłu spolaryzowanych komórek śródbłonka lub guza i powoduje pozostawienie resztek błony na macierzy, gdy komórka się oddala. TMED i nanopodia zostały pominięte ze względu na ich ekstremalną kruchość i wrażliwość na temperaturę. Rutynowe mycie i utrwalanie zaburza strukturę. Nanopodia są konserwowane przez bezpośrednie utrwalenie w paraformaldehydzie (PFA) w temperaturze 37 °C, a następnie krótką ekspozycję na 0,01% Triton X-100 przed barwieniem. Nanopodia otwierają nowe perspektywy w biologii komórki: obiecują zmienić nasze rozumienie tego, w jaki sposób komórki wyczuwają otoczenie, wykrywają i identyfikują inne komórki na odległość, inicjują interakcje międzykomórkowe w bliskim kontakcie oraz mechanizmów sygnalizacyjnych zaangażowanych w ruch, proliferację i komunikację między komórkami. Metody, które zostały opracowane do badania nanopodiów pochodzących z TM4SF1, mogą być przydatne do badań nanopodiów, które tworzą się w innych typach komórek za pośrednictwem klasycznych tetraspanin, w szczególności wszechobecnych CD9, CD81 i CD151 ulegających ekspresji.
Wprowadzenie
Podczas polaryzacji dla ruchu, komórki zwierzęce rozciągają różne dynamiczne, błonowe wypukłości ze swoich powierzchni, w tym filopodia, lamellipodia, włókna retrakcyjne i falbany1. Niedawno do tej listy dodano nanopodia, nowo rozpoznany rodzaj cienkiej (100-300 μm średnicy), wydłużonej (do 50-100 μm długości) projekcji błonowej, która zapewnia kanały błonowe do przedłużania struktur F-aktyny, takich jak filopodia i włókno retrakcji, i które barwią się dodatnio TM4SF1 (Transmembrane-4-L-six-family-1) w hodowanych komórkach śródbłonka i nowotworowych2,3.
TM4SF1 to białko o topologii podobnej do tetraspaniny, które pierwotnie było znane jako antygen komórek nowotworowych4 przed odkryciem, że cząsteczka ta jest biomarkerem komórek śródbłonka, który odgrywa istotną rolę w proliferacji i migracji komórek śródbłonka2,3. Barwienie immunofluorescencyjne wykazało, że TM4SF1 jest zlokalizowany w pęcherzykach okołojądrowych i błonie plazmatycznej i jest wzbogacony w TM4SF1 ewzbogacone mikroomainy(TMED). TMED zakotwicza nanopodia w matrycy i występuje w regularnie rozmieszczonym wzorze pasmowym o długości 1-3 TMED/μm nanopodiów. Nanopodia zazwyczaj rozciągają się od przodu komórki i tylnej części komórki podczas polaryzacji komórki w celu ruchu. Ze względu na mocno przylegający charakter TMED, nanopodia nie są w stanie cofnąć się z powrotem do komórki, gdy się oddala; Porzucone pozostałości nanopodiów śledzą w ten sposób ścieżkę ruchu komórek. Nanopodia zapewniają kanały błonowe do wydłużania i cofania F-aktyny i są miejscami interakcji międzykomórkowych i komunikacji2,3. Cechy te oznaczają, że nanopodia dają unikalną możliwość badania mechanizmów leżących u podstaw składania F-aktyny podczas polaryzacji komórkowej, komórkowego wyczuwania środowiska, określania ścieżki i kierunku ruchu komórek oraz interakcji i komunikacji międzykomórkowej.
Ze względu na wysoce hydrofobową naturę TMED oraz cienką i delikatną błoniastą naturę nanopodiów, należy zachować szczególną ostrożność w celu zachowania TMED i nanopodiów. Zniszczenie nanopodiów i usunięcie TMED za pomocą powszechnych metod laboratoryjnych jest możliwym powodem, dla którego od czasu jego pierwszego odkrycia w 1986 r.ukazały się tylko sześćdziesiąt trzy publikacje na temat TM4SF1 i całkowity brak wiedzy na temat wzbogacania TM4SF1 w mikrodomenach 100-300 μm na powierzchni komórki, aż do doniesienia o TM4SF1 w komórkach śródbłonka w 2009 r.2.
Konwencjonalne metody barwienia immunologicznego często używają rozpuszczalników organicznych, takich jak etanol, metanol lub aceton, do utrwalania komórek i używają 0,1% lub wyższego stężenia Triton X-100 do przenikania komórek5. W opisanych tutaj badaniach wprowadzono trzy główne zmiany w konwencjonalnej metodzie ujawniania TMED i nanopodiów: (i) użyj 37 °C 4% PFA i utrwal komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C, (ii) zastosuj delikatne płukanie PBS w temperaturze pokojowej oraz (iii) użyj mniej niż 0,03% Triton X-100 tylko na krótko, aby przeniknąć komórki przed dodaniem przeciwciała pierwotnego, ponieważ Triton X-100 wyższy niż 0,03% wyekstrahuje TM4SF1.
Wszystkie tetraspaniny tworzą mikrodomeny na błonie komórkowej6, a niektóre kolokalizują się z TMED w komórkach śródbłonka i nowotworu2,3. Ponieważ tetraspaniny, takie jak CD9, CD81 i CD151, są powszechnie eksprymowane, opisany tutaj protokół barwienia można rozszerzyć na wiele różnych typów komórek, w których brakuje TM4SF1 do badań funkcji nanopodiów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Hodowla komórkowa na dysku szklanym pokrytym kolagenem
- Umieść szklane krążki (o średnicy 12 mm) w szklanym słoiku (4 uncje) i przeprowadź autoklaw w celu sterylizacji krążków.
- Umieść 25 ml 70% etanolu w 50 ml probówce Falcon i umieść ją w kapturze do hodowli komórkowych. Roztwór ten można używać wielokrotnie, aż poziom roztworu spadnie do 20 ml.
- Umieść ostre kleszcze z bardzo drobnym czubkiem w 70% etanolu na 5 minut przed użyciem go do obsługi szklanego dysku.
- Ostrożnie wyjmij kleszczyki z rurki i zamknij nakrętkę, a następnie delikatnie umieść kleszczyki nasączone etanolem na górze probówki, aby wyschły na powietrzu przez 2 minuty. Nie pozwól, aby końcówka kleszczy dotykała czegokolwiek w kapturze.
- Użyj sterylnych kleszczy, aby chwycić jeden sterylny szklany krążek ze szklanego słoika i umieść go w studzience 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej. Powtarzaj, aż żądana liczba studzienek zostanie wypełniona dyskami.
- Umieścić 500 μl roztworu kolagenu bydlęcego (50 ng/ml) do każdej studzienki zawierającej szklany krążek i umieścić go w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na co najmniej 30 minut. Nie ma nic złego w dłuższej inkubacji.
- Zbierz HUVEC (ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej) lub PC3 (komórki nowotworowe prostaty), które były już hodowane na 150-milimetrowej płytce do hodowli komórkowej poprzez trypsynizację i zablokuj aktywność trypsyny za pomocą kompletnej pożywki hodowlanej. Zebrać komórki do probówki Falcon o pojemności 15 ml.
- Policz liczbę komórek i upewnij się, że żywotność jest większa niż 90%.
- Granulować komórki przez odwirowanie przy 200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant.
- Użyj pożywki hodowlanej, aby rozcieńczyć komórki do 105 komórek/ml. Umieść komórki na lodzie.
- Odessać kolagen do kaptura hodowli komórkowej i delikatnie umieścić 500 μl zawiesiny komórkowej w każdym dołku, w którym szklane krążki zostały wstępnie pokryte kolagenem. 5 x 104 komórki / studzienkę w 24-dołkowej płytce da 60% konfluencję dla HUVEC i 30% konfluencję dla komórek PC3. Uwaga: dodaj więcej zawiesiny komórek, aby uzyskać większą gęstość komórek.
- Hoduj komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 1 godzinę, 2 godziny, 4 godziny, 6 godzin lub 24 godziny, aby śledzić aktywność nanopodiów i pasaż komórkowy. Zazwyczaj komórki przyczepiają się do szklanego dysku w ciągu pierwszych 30 minut, a następnie zaczynają polaryzować się i migrować w ciągu pierwszej godziny, a w ciągu następnych godzin przeprowadzają interakcje międzykomórkowe i podział komórek.
2. Utrwalenie komórek
- Każda studzienka będzie potrzebować 500 μl 4% PFA (paraformaldehydu) do utrwalenia komórek. Można stosować zarówno komercyjnie wyprodukowane, jak i świeżo wyprodukowane 4% PFA. Oblicz potrzebną ilość PFA na podstawie liczby przygotowanych studzienek i umieść PFA w 15-mililitrowej probówce Falcon. UWAGA: paraformaldehyd jest podejrzewany jako czynnik rakotwórczy.
- Umieść rurkę falcon w styropianowym stojaku, który był już na miejscu w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Pozostawić probówkę w inkubatorze na 30 minut, aby rozgrzać PFA do 37 °C.
- Umieść poduszkę grzewczą w okapie hodowlanym i włącz go.
- Wyjmij 24-dołkową płytkę do hodowli komórkowej i wstępnie podgrzany PFA z inkubatora i umieść je na poduszce grzewczej.
- Jedną ręką zasysaj pożywkę ze studzienki, a drugą ręką delikatnie wsuń 500 μl PFA do studzienki przez krawędź studzienki. Aby ułatwić aspirację, przechyl płytkę hodowlaną pod kątem około 45°, opierając ją o styropianowy stojak, tak aby była stabilna pod tym kątem. Ułatwi to aspirację i dodanie roztworu PFA do studzienki bez naruszania komórek w hodowli. Jest to najważniejszy krok do zachowania pierwotnej struktury komórkowej aktywności komórek.
- Powtarzaj proces, aż wszystkie studzienki ze szklanym dyskiem otrzymają PFA. Uwaga: wszystkie kroki, które wymagają zmiany istniejącego wcześniej roztworu ze studni, będą miały te same procedury aspiracji.
- Umieścić płytkę w temperaturze 37 °C na 5 minut.
- Weź płytkę z powrotem do okapu hodowlanego i przechyl ją na styropian zgodnie z opisem w kroku 2.5. Jedną ręką delikatnie przenieś PFA ze studni do probówki zbiorczej; drugą ręką natychmiast po tym umieścić w studzience co najmniej 500 μl PBS o temperaturze pokojowej. Po umyciu wszystkich studzienek należy powrócić i powtórzyć płukanie PBS jeszcze raz w każdej studzience. Opróżnij zebrany PFA do pojemnika na odpady niebezpieczne.
- Przygotować bufor blokujący ICC, dodając 2% płodową surowicę bydlęcą do PBS. Jako środek konserwujący dodaje się 0,04% azydku sodu (rozcieńczonego z 20% roztworu podstawowego). UWAGA: azydek sodu jest związkiem toksycznym. Bufor może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez długi czas bez zanieczyszczenia bakteryjnego.
- Trzymając płytkę hodowlaną nadal nachyloną w stosunku do podstawy, ponownie przeprowadź przez każdą studzienkę, zasysając w celu usunięcia PBS, a natychmiast po tym dodając 500 μl buforu blokującego ICC. Komórki są teraz gotowe do barwienia immunofluorescencyjnego. W razie potrzeby utrwalone komórki można przechowywać w lodówce o temperaturze 4 °C przez tydzień bez znacznej utraty białka TM4SF1.
3. TM4SF1 Barwienie immunofluorescencyjne nanopodiów
- W każdym dołku zastąp 500 μl buforu blokującego ICC nowym buforem blokującym zawierającym 0,01% Triton X-100 i pozostaw go w temperaturze pokojowej na 1 godzinę. Nie używaj więcej niż 0,03% Triton X-100, ponieważ usunie on TM4SF1 z błon komórkowych. Umyte komórki PBS z kroku 2.10 można bezpośrednio przenieść do bufora blokującego zawierającego Triton, jeśli barwienie jest gotowe do natychmiastowego rozpoczęcia.
- Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało anty-TM4SF1 (lub anty-CD9) do 0,5 μg/ml w buforze blokującym ICC.
- Z każdej studzienki należy usunąć bufor ICC/0,01% Triton i zastąpić go 300 μl roztworu przeciwciała anty-TM4SF1. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub pozostawić na noc w temperaturze 4 °C.
- Umyj każdą studzienkę nie mniej niż 500 μl PBS. Powtórz 3 razy; Za każdym razem należy przeznaczyć co najmniej 5 minut czasu inkubacji.
- Przygotować drugorzędowe przeciwciało i roztwór falloidyny w buforze blokującym ICC, używając 1000-krotnego rozcieńczenia drugorzędowego przeciwciała anty-mysiego znakowanego Alexa 488 (2 μg / ml stężenie końcowe) i 1000-krotnego rozcieńczenia falloidyny (50 ng / ml stężenie końcowe).
- Usunąć PBS i dodać 300 μl drugorzędowego roztworu przeciwciała i falloidyny do każdej studzienki i inkubować przez 2 godziny lub pozostawić na noc w temperaturze 4 °C.
- Powtórzyć etapy mycia PBS z co najmniej 5-minutową inkubacją na pranie. W ostatnim praniu pozostaw każdą studzienkę w PBS na 1 godzinę.
- Upuść pojedynczą kroplę (~10 μl) środka montażowego zapobiegającego blaknięciu na szklane szkiełko.
- Zegnij końcówkę igły strzykawkowej 19 G 1 1/2 cala pod kątem 90°, delikatnie naciskając na twardą powierzchnię. Jedną ręką przytrzymaj zgiętą igłę i delikatnie podnieś szklany krążek ze studni, a drugą ręką chwyć krążek za pomocą ostrych kleszczy.
- Odwróć szklany dysk stroną do dołu, pozwalając, aby strona ogniwa zetknęła się z nośnikiem montażowym na szklanym szkiełku. Delikatnie umieść szklany krążek i pozostaw go do wyschnięcia na noc w ciemnym miejscu w temperaturze pokojowej.
- Przystąp do obrazowania nanopodiów barwionych immunofluorescencją lub przechowuj szkiełka w pudełku ze szkiełkami w temperaturze -20 °C. Slajdy będą widoczne przez kilka miesięcy w temperaturze -20 °C.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Dla kroku 1:
Jeśli komórki (takie jak HUVEC i PC3 wykorzystane w niniejszym badaniu) są zdolne do prawidłowego wzrostu, przyłączą się one do powleczonego kolagenem dysku w ciągu 30 min od ich wysiania, wkrótce potem ulegną polaryzacji i staną się ruchliwe, a następnie wysuną nanopodia przed kierunkiem swojego przemieszczania się. Rysunek 1A oraz 1B przedstawiają odpowiednio spolaryzowaną i proliferującą komórkę HUVEC. Rysunek 2A przedstawia spola...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Nanopodia to cienkie kanały błony komórkowej, które mocno przylegają do macierzy za pośrednictwem TMED i mogą rozciągać się na ponad 100 μm od spolaryzowanej komórki ruchomej, aby wyczuwać środowisko i pośredniczyć w interakcjach międzykomórkowych2,3. Nanopodia przylegają do matrycy tak mocno, że pozostałości pozostają w tyle, gdy komórka się oddala (ryc. 1 i 2). Nanopodia pozwalają nam zatem badać, w jaki sposób komórki wyczuwają otoczenie i określają ścieżkę ruchu komórek or...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie stwierdzono konfliktu interesów.
Podziękowania
Dziękujemy dr Haroldowi Dvoraka za pomocne dyskusje, w tym sugestię spróbowania utrwalenia w temperaturze 37 °C PFA. Prace te były wspierane przez grant NIH P01 CA92644 oraz przez umowę z National Foundation for Cancer Research.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Szklane dyski | Fisher Scientific | 12-545-82 | Szklany słoik o średnicy 12 mm |
| Fisher Scientific | 02-912-310 | Certyfikowane czyste, przezroczyste szklane słoiki o prostych ściankach, 4 uncje | |
| szkła | Fisher Scientific | 12-544-1 | Szkiełka mikroskopowe Fisherfinest Premium ze zwykłego szkła |
| 50 ml Tubka Falcon | BD Falcon | 352070 | Stożkowa probówka wirówkowa o wysokiej przejrzystości 50 ml, ocena 16 000 RCF. Sterylny. |
| Probówka Falcon 15 ml ze styropianowym stojakiem | Corning | 430790 | Corning 15 ml Probówki wirówkowe PP |
| Ostre kleszcze | Fisher Scientific | 13-812-42 | Preparujące bardzo cienkie kleszcze odłamkowe |
| 24-dołkowa płytka do hodowli komórkowych | BD Bioscience | 353047 | 24-dołkowa płytka do hodowli komórkowej |
| 150 mm Płytka do hodowli komórkowych | BD Bioscience | 353025 | 150 mm Płytka do hodowli komórkowych |
| 19 G 1 ½ Igła strzykawkowa | BD Bioscience | 309635 | 19 G 1 ½ |
| Etanol | Decon Laboratories, Inc. | 2701 | Decon's Pure Ethanol 200 Proof |
| Roztwór kolagenu | BD Bioscience | 354249 | Collagen I, Wysokie stężenie, ogon szczura, 100 mg |
| Trypsyna/EDTA | Cellgro | 25-053-CI | 0,25% Trypsyna-EDTA 1x |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | DMEM o wysokiej glukozie (1x), płynny, z L-glutaminą, bez pirogronianu sodu |
| 10x | PBS Affymetrix | 75889 5 LT | PBS, 10x Roztwór, pH 7,4 |
| PFA (paraformaldehyd) | Affymetrix | 19943 1 LT | 4% w PBS |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | Płodowa surowica bydlęca |
| EGM2-MV | Lonza | CC-3162 | EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml i EGM-2 SingleQuot Kit Suplement & Czynniki wzrostu |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002-25G | Rozpuszczony w wodzie. 4% roztwór podstawowy i stężenie robocze wynosi 0,4%. |
| Mysie przeciwciało anty-ludzkie TM4SF1 | Epitop Millipore | MAB3127 | znajduje się w domenie zewnątrzkomórkowej |
| Mysie przeciwciało anty-ludzkie CD9 | BD Bioscience | 555370 | Epitop znajduje się w domenie zewnątrzkomórkowej |
| Alexa Fluor 488 Donkey anty-mysie 2nd przeciwciało | Life Technologies | A-21202 | Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) |
| Phalloidin | Chemicon | 90324 | Sprzężona z rodaminą Phalloidyna |
| Anti-fade mounting media | Life Technologies | P-36931 | ProLong Gold Odczynnik Antifade z DAPI |
| 70% etanolu | 17,5 ml etanolu (200 proof) 7,5 ml wody podwójnie dejonizowanej | ||
| 10x PBS (zrobić 200 ml) | 20 ml 10x PBS 180 ml wody podwójnie dejonizowanej | ||
| 20% Triton X-100 (zrobić 20 ml) | 4 ml Triton X-100 16 ml podwójnie dejonizowanej wody | ||
| 4% NaN3 (zrobić 25 ml) | 1 g NaN3 25 ml podwójnie dejonizowanej | ||
| wody 50 ng/ml Roztwór kolagenu bydlęcego w PBS (zrobić 5 ml) | Roztwór podstawowy 50 μ g/ml (50 ml) 830 &m; l kolagenu I (3 mg) 50 ml PBS | ||
| ICC Blocking Buffer (50 ml) | 49 ml PBS 2% FBS (dodać 1 ml) 0,04% NaN3 (dodać 100 μ l 4% NaN3) | ||
| ICC Blocking Buffer/0,01% Triton X-100 (zrobić 50 ml) | 50 ml ICC Blocking Buffer 25 μ l 20% Triton X-100 | ||
| HUVEC | Lonza | C2517A | www.lonza.com |
| PC3 | ATCC | CRL-1435 | www.atcc.org |
| Kaptur do hodowli komórkowych | NuAIRE | Nu-425-600 | NU-425 (Seria 60) Szafa Bezpieczeństwa Biologicznego |
| 37 &stopnie; C, 5% CO2 Inkubator do hodowli komórkowych | CellStar | QWJ300DABA | Cellstar CO2 Inkubator z płaszczem wodnym |
| Podkładka grzewcza | K& H Produkcja | 1020 | K& H Podgrzewana podkładka hodowli Lectro z bezpłatną osłoną z polaru (www.amazon.com) |
| Wirówka | Sorvall | T6000B | Sorvall T6000 (B) Hemocytometr wirówkowy |
| Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line |
Bibliografia
- Chhabra, E. S., Higgs, H. N. The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures. Nat. Cell Biol. 9, 1110-1121 (2007).
- Shih, S. C., et al. The L6 protein TM4SF1 is critical for endothelial cell function and tumor angiogenesis. Cancer Res. 69, 3272-3277 (2009).
- Zukauskas, A., et al. TM4SF1: a tetraspanin-like protein necessary for nanopodia formation and endothelial cell migration. Angiogenesis. 14, 345-354 (2011).
- Hellstrom, I., Beaumier, P. L., Hellstrom, K. E. Antitumor effects of L6, an IgG2a antibody that reacts with most human carcinomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 7059-7063 (1986).
- Jang, Y. Y., Ye, Z., Cheng, L. Molecular imaging and stem cell research. Mol. Imag. 10, 111-122 (2011).
- Hemler, M. E. Tetraspanin functions and associated microdomains. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 801-811 (2005).
- Vasile, E., Tomita, Y., Brown, L. F., Kocher, O., Dvorak, H. F. Differential expression of thymosin beta-10 by early passage and senescent vascular endothelium is modulated by VPF/VEGF: evidence for senescent endothelial cells in vivo at sites of atherosclerosis. FASEB. 15, 458-466 (2001).
- Itoh, T. J., Hotani, H. Microtubule dynamics and the regulation by microtubule-associated proteins (MAPs). Uchu Seibutsu Kagaku. 18, 116-117 (2004).
- Caplow, M., Shanks, J., Ruhlen, R. L. Temperature-jump studies of microtubule dynamic instability. J. Biol. Chem. 263, 10344-10352 (1988).
- Pollice, A. A., et al. Sequential paraformaldehyde and methanol fixation for simultaneous flow cytometric analysis of DNA, cell surface proteins, and intracellular proteins. Cytometry. 13, 432-444 (1992).
- Macarulla, J. M., et al. Membrane solubilization by the non-ionic detergent triton X-100. A comparative study including model and cell membranes. Revista Espanola de Fisiologia. 45 Suppl, 1-8 (1989).
- Koley, D., Bard, A. J. Triton X-100 concentration effects on membrane permeability of a single HeLa cell by scanning electrochemical microscopy (SECM). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16783-16787 (2010).
- Chang, Y. W., et al. CD13 (aminopeptidase N) can associate with tumor-associated antigen L6 and enhance the motility of human lung cancer cells. Int. J. Cancer. 116, 243-252 (2005).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
