Askorbinian odgrywa wiele ważnych ról w metabolizmie komórkowym, z których wiele wyszło na jaw dopiero w ostatnich latach. Tutaj opisujemy średnioprzepustowy, specyficzny i niedrogi test mikropłytkowy do oznaczania zarówno wewnątrzkomórkowego, jak i zewnątrzkomórkowego askorbinianu w hodowli komórkowej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Szybki i specyficzny test mikropłytkowy do oznaczania wewnątrz- i zewnątrzkomórkowego askorbinianu w hodowanych komórkach
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Witamina C (askorbinian) odgrywa wiele ważnych ról w metabolizmie komórkowym, z których wiele wyszło na jaw dopiero w ostatnich latach. Na przykład w mózgu askorbinian działa w sposób neuroprotekcyjny i neuromodulujący, który obejmuje cykle askorbinianu między neuronami a astrocytami vicinal - związek, który wydaje się być kluczowy dla homeostazy askorbinianu w mózgu. Ponadto pojawiające się dowody silnie sugerują, że askorbinian ma znacznie większą rolę w regulacji komórkowego i ogólnoustrojowego metabolizmu żelaza, niż się powszechnie uważa. Coraz powszechniejsze uznawanie integralnej roli askorbinianu w prawidłowej i rozregulowanej fizjologii komórek i organizmów wymaga szeregu technik analitycznych o średniej przepustowości i wysokiej czułości, które można wykonać bez konieczności stosowania bardzo drogiego specjalistycznego sprzętu. W tym miejscu podajemy wyraźne instrukcje dotyczące średnioprzepustowego, specyficznego i stosunkowo niedrogiego testu mikropłytkowego do oznaczania zarówno wewnątrzkomórkowego, jak i zewnątrzkomórkowego askorbinianu w hodowli komórkowej.
Wprowadzenie
Odkrycie chemicznej natury kwasu askorbinowego (witaminy C) i jego identyfikacja jako długo poszukiwanego "czynnika przeciwszkorbutowego" przez Alberta Szent-Györgyi i innych w pracach opublikowanych w latach 1928-19341 były przełomowymi wydarzeniami w historii biochemii. Rzeczywiście, odkrycia te przyczyniły się do tego, że Szent-Györgyi otrzymał Nagrodę Nobla w dziedzinie fizjologii lub medycyny w 1937 roku. Stale poszerzający się zakres ról askorbinianu w fizjologii zwierząt i roślin, a także w zdrowiu człowieka, nadal jest przedmiotem aktywnych badań naukowych i kontrowersji.
L-askorbinian jest ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Określ wewnątrzkomórkowy askorbinian w hodowanych komórkach
- Hodowla komórkowa i zbiór
- Hoduj zawiesinę (np. ludzką erytroluksemię, K562) lub komórki adherentne (np. pierwotne astrocyty) przy użyciu standardowych procedur hodowli19-21,32,38. Uwaga: aby upewnić się, że komórki zawierają askorbinian, należy obciążyć hodowane komórki askorbinianem jako askorbinianem lub DHA33,39.
- Stwórz ekstrakt komórkowy zawierający askorbinian
- Inkubować odpowiednią liczbę zawiesiny lub przylegających komórek przemytych roztworem soli fizjologicznej (PBS....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Oznaczanie wewnątrzkomórkowego askorbinianu w hodowlach komórek w zawiesinie
W pierwszym teście (Rysunek 1) oznaczany jest wewnątrzkomórkowy askorbinian, po specyficznej dla askorbinianu (t.j. wrażliwej na AO) redukcji ferricyjanku do ferrocyjanku, z wykorzystaniem wysokoczułego oznaczania ferrocyjanku zgodnie z wcześniej opisaną procedurą37. Detekcja askorbinianu opiera się na kolorymetrycznej chelatacji żelaza dwuwartościowego, które powstaje w wyniku zależn.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszej pracy przedstawiono dwa szybkie, specyficzne i stosunkowo czułe testy mikropłytkowe kolorymetryczne do oznaczania askorbinianu pochodzącego z przedziałów wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych w hodowanych komórkach. Testy można wykonać z dostępem do standardowego sprzętu laboratoryjnego i odczynników. Jedynym umiarkowanie drogim odczynnikiem wymaganym do testu jest AO, który jest niezbędny, ponieważ nadaje wysoki stopień specyficzności analitu w stosunku do L-askorbinianu. Testy te d.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Jesteśmy wdzięczni dr Stephenowi Robinsonowi i Pani Hani Czerwińskiej (Monash University) za hojne dostarczenie kultur astrocytów.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Nunc 96-dołkowe płytki z płaskim dnem | Thermo | 269620 | Można użyć dowolnej płaskiej płytki 96-dołkowej |
| Mikrowirówka stołowa z chłodzeniem | Eppendorf | 5415D | Można również użyć mikrowirówki bez chłodzenia, która została zrównoważona do temperatury w chłodni |
| Wirówka stołowa z chłodzeniem | Eppendorf | 5810R | Wiadro |
| wahadłoweSpektrofotometr mikropłytkowy Bio-Rad Benchmark Plus | Bio-Rad | Można użyć dowolnego spektrofotometru z mikropłytkami zdolnego do odczytu przy 593 nm. Jeśli używany jest czytnik płytek oparty na filtrze, wybierz najbliższą możliwą długość fali i użyj metody krzywej standardowej. | |
| Ependorf MixMate (mieszalnik orbitalny mikropłytek) | Eppendorf | Jest to bardzo wszechstronny i niezawodny mieszalnik mikropłytek, który bardzo dobrze sprawdza się w tych testach | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), pH 7,4 | |||
| Sól fizjologiczna buforowana MOPS (MBS); 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7,3 | |||
| MBS + 5 mM D-glukozy (MBS/D) | |||
| Sól fizjologiczna buforowana HEPES + 5 mM D-glukoza (HBS/D); 137 mM NaCl, 5,2 mM KCl, 1,8 mM CaCl2• 2 H2O, 0,8 mM MgSO4• 7 H2O, 5 mM D-glukozy, 20 mM HEPES-Na+, pH 7,3) | |||
| Bufor do przenikania komórek (CPB; 0,1% saponiny w PBS) | |||
| Ogólne chemikalia | |||
| Kwas L-askorbinowy lub L-askorbinian sodu | Sigma-Aldrich | Należy uzyskać preparaty o najwyższej czystości | |
| Dimer kwasu dehydro-L-askorbinowego (DHA) | Sigma-Aldrich | 30790 | Roztwory wodne teoretycznie dają 2 mole monomeru DHA na mol dimeru DHA |
| Cytochalazyna B | Sigma-Aldrich | C6762 | Roztwory podstawowe przygotowane w DMSO lub etanolu |
| Oksydaza askorbinianowa (AO) | Sigma-Aldrich | A0157 | Roztwory podstawowe (120 U/ml) można przygotować w PBS lub MBS, a następnie zamrozić w podwielokrotnościach |
| Żelazocyjanek potasu (FIC) | Sigma-Aldrich | 455989 | Trójwodzian |
| Ferene-S (3-(2-pirydylo)-5,6-di(2-furylo)-1,2,4-triazyno-5&,5&; &sól disodowa kwasu disulfonowego) | Sigma-Aldrich | 92940 | |
| L-glutaminian sodu | Sigma-Aldrich | ||
| Saponina | Sigma-Aldrich | ||
| Roztwory podstawowe do wewnątrzkomórkowego | |||
| 3 M octan sodu (pH 6,0) | |||
| Lodowaty kwas | |||
| 0,2 M kwas | |||
| 3,3 mM FeCl3 w 0,1 M kwas | |||
| 30 mM feren-S | |||
| 50% (v/v) kwas octowy + 30% (w/v) kwas trichlorooctowy (TCA) | |||
| Roztwory podstawowe do testu | |||
| AO (120 U/ml) | |||
| 2,4 mM feren-S | |||
| 0,12 mM FeCl3 w 0,6 mM cytrynianu |
Bibliografia
- Buettner, G. R., Schafer, F. Q. Albert Szent-Györgyi: vitamin C identification. Biochem. J. , (2006).
- Padayatty, S. J., Levine, M. New insights into the physiology and pharmacology of vitamin. C. Can. Med. Assoc. J. 164, 353-355 (2001).
- Flashman, E., Davies, S. L., Yeoh, K. ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
