Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Otrzymywanie usieciowanych DNA hydrożeli poliakrylamidowych

14.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51323

⸱

27 sierpnia 2014

 , 
1New Jersey Neuroscience Institute, JFK Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Rutgers University, 3Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Rutgers University

W tym artykule

Podsumowanie

Nasze laboratorium opracowało usieciowane DNA hydrożele poliakrylamidowe, dynamiczny system hydrożelowy, aby lepiej zrozumieć wpływ modulacji sztywności tkanek na funkcjonowanie komórek. Tutaj podajemy schematy, opisy i protokoły przygotowania tych hydrożeli.

Streszczenie

Mechanobiologia to rozwijająca się dziedzina nauki, która zajmuje się kluczową rolą fizycznych wskazówek w kierowaniu morfologią i funkcją komórki. Na przykład wpływ elastyczności tkanek na funkcję komórek jest głównym obszarem badań mechanobiologicznych, ponieważ sztywność tkanek moduluje się wraz z chorobą, rozwojem i urazem. Statyczne materiały naśladujące tkankę lub materiały, które nie mogą zmienić sztywności po platerowaniu komórek, są głównie używane do badania wpływu sztywności tkanki na funkcje komórki. Chociaż informacje uzyskane z badań statycznych są cenne, badania te nie wskazują na dynamiczny charakter mikrośrodowiska komórkowego in vivo. Aby lepiej przyjrzeć się wpływowi sztywności dynamicznej na funkcjonowanie komórek, opracowaliśmy system hydrożelu poliakrylamidowego usieciowanego DNA (żele DNA). W przeciwieństwie do innych dynamicznych substratów, żele DNA mają zdolność zmniejszania lub zwiększania sztywności po wytworzeniu bez bodźców. Żele DNA składają się z wiązań krzyżowych DNA, które są polimeryzowane w szkielet poliakrylamidowy. Dodawanie i usuwanie usieciowań poprzez dostarczanie jednoniciowego DNA umożliwia czasową, przestrzenną i odwracalną kontrolę elastyczności żelu. Wykazaliśmy w poprzednich raportach, że dynamiczna modulacja elastyczności żelu DNA wpływa na zachowanie fibroblastów i neuronów. W tym raporcie i filmie przedstawiamy schemat opisujący mechanizmy sieciowania żelu DNA oraz instrukcje krok po kroku dotyczące przygotowania żeli DNA.

Wprowadzenie

Podłoża statyczne i dynamiczne to dwie kategorie biomateriałów opracowanych w celu badania wpływu elastyczności lub sztywności tkanki na funkcje komórkowe. Podłoża statyczne nie mogą zmieniać swoich właściwości fizycznych po ich wytworzeniu i/lub po wysianiu komórek. Żele poliakrylamidowe (PA) były pierwszymi dwuwymiarowymi, statycznymi podłożami zsyntetyzowanymi na potrzeby badań z zakresu mechanobiologii 5,17. Żele PA są łatwe w przygotowaniu, niedrogie, wszechstronne i mogą być wytwarzane w szerokim zakresie modułów sprężystości. Choć te zalety techniczne sprawiają, że żele PA są powszechnie stosowanym podłożem, podłoża statyczne nie oddają dynamicznej natury macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i otaczającego środowiska komórkowego in vivo. Na przykład ECM ulega zmianom sztywności w wyniku urazu, rozwoju lub choroby. Dlatego w badaniach z zakresu mechanobiologii preferowane są podłoża dynamiczne jako modele podłoży naśladujące tkanki 22,24,25.

Opracowano liczne syntetyczne, naturalne, dwuwymiarowe, trójwymiarowe, statyczne i dynamiczne biomateriały naśladujące sztywność tkanek 1,3,6,16,23,26. Niektóre dynamiczne podłoża wymagają zastosowania ciepła, promieniowania UV, prądu elektrycznego, jonów lub zmian pH w celu modyfikacji ich właściwości mechanicznych 2,4,7,8,12,15,16, jednak bodźce te mogą ograniczać zastosowania biologiczne hydrożelu. Hydrożele poliakrylamidowe sieciowane DNA (żele DNA) są dynamicznymi, dwuwymiarowymi podłożami elastycznymi. Sieciowania DNA umożliwiają czasową, przestrzenną i odwracalną modulację sztywności żelu DNA poprzez dodanie do pożywki lub buforu jednoniciowego DNA (ssDNA) 9-11,13,14,18,21. W przeciwieństwie do wspomnianych wcześniej żeli dynamicznych, w których do modulacji elastyczności stosuje się bodźce, żele DNA opierają się na dyfuzji wprowadzonego ssDNA w celu zmiany elastyczności. W związku z tym górna powierzchnia żelu, na której hodowane są komórki, jest obszarem modyfikowanym w pierwszej kolejności, ponieważ szybkość modulacji elastyczności zależy od grubości żelu.

Żele DNA są podobne do swoich odpowiedników z żelu PA pod względem szkieletu z poliakryloamidu, jednakże wiązania sieciujące bis-akryloamidu zostały zastąpione wiązaniami sieciującymi złożonymi z DNA (Rysunek 1). Dwa ssDNA (SA1 i SA2) hybrydyzują z nicią sieciującą (L2), tworząc wiązania sieciujące DNA w żelu. SA1 i SA2 mają odrębne sekwencje, z których każda zawiera modyfikację Acrydite na końcu 5´ w celu efektywnego włączenia do sieci PA. Do przygotowania żeli SA1 i SA2 są oddzielnie polimeryzowane w szkielet PA, a następnie spolimeryzowane SA1 i SA2 są ze sobą mieszane. Do mieszaniny SA1 i SA2 dodaje się L2, czyli czynnik sieciujący. Sekwencja zasad L2 jest komplementarna do sekwencji SA1 oraz SA2, a L2 hybrydyzuje z SA1 i SA2, tworząc wiązania sieciujące DNA. Początkowa elastyczność żelu DNA jest określona zarówno przez stężenia L2, jak i stopień sieciowania (Tabele 1 i 2). Żele DNA zawierające równe ilości stechiometryczne L2, SA1 i SA2 są najsztywniejszymi żelami, ponieważ SA1 i SA2 są w 100% sieciowane przez L2 (oznaczane jako żele 100%). Niższe stężenia L2 skutkują niższym procentem sieciowania DNA, a tym samym miększymi żelami DNA. Skonstruowano żele o stopniu sieciowania tak niskim jak 50% (oznaczane jako żele 50%) 9-11.

Sekwencyjny proces edycji DNA; schemat; etapy z użyciem SA1, SA2, R2; analiza spektrogramowa.
Rycina 1. Schemat sieciowania i odsieciowania żelu DNA 9-11,13,14,18,21. Krok 1: SA1 (czerwony) i SA2 (niebieski) są oddzielnie polimeryzowane w szkielecie poliakryloamidowym (czarny). Po polimeryzacji roztwory spolimeryzowanego SA1 i SA2 są ze sobą mieszane. Krok 2: Dodaje się L2 (zielony), który hybrydyzuje z SA1 oraz SA2, tworząc sieciowania żelu. Krok 3: R2 hybrydyzuje z regionem toehold L2. Krok 4: Hybrydyzacja toehold R2 powoduje rozplecenie L2 z SA1 i SA2.

W przeciwieństwie do żeli z PA, żele z DNA mogą twardnieć i mięknąć po syntezie. Z tego powodu komórki hodowane na żelach z DNA mogą być poddawane dynamicznym zmianom sztywności. Aby utwardzić żele z przytwierdzonymi komórkami, do pożywki kultur żeli o niskim procencie można dodać L2, aby zwiększyć stopień sieciowania. Aby zmiękczyć żele z przytwierdzonymi komórkami, można usunąć L2, aby zmniejszyć stopień sieciowania 10,13,21. L2 posiada dodatkową sekwencję toehold na końcu 3´, która umożliwia odłączenie L2 od SA1 i SA2 (Tabela 1). Usunięcie L2 odbywa się poprzez hybrydyzację z nicią odwracającą zwaną R2. R2 jest komplementarna do pełnej długości L2 i hybrydyzuje najpierw z sekwencją toehold L2. Hybrydyzacja toehold inicjuje rozplatanie L2 od SA1 i SA2, co eliminuje wiązanie sieciujące i zmniejsza sztywność żelu.

W niniejszym raporcie i filmie przedstawiono instrukcje krok po kroku dotyczące przygotowania twardniejących i mięknących żeli DNA. Choć opisano przygotowanie żeli o stopniu sieciowania 100% i 80%, protokół ten można dostosować w celu stworzenia żeli DNA o innych początkowych i końcowych wartościach procentowych sieciowania. Generalnie żele 100% i 80% są przygotowywane, unieruchamiane na szklanych lamellkach, funkcjonalizowane, a następnie zasiewane komórkami. 48 h po wysianiu do pożywki żeli 80% dodaje się L2, a do pożywki żeli 100% dodaje się R2. Dodanie L2 do pożywki utwardza żele 80% do poziomu sieciowania 100%, podczas gdy dodanie R2 do pożywki zmiękcza żele 100% do poziomu 80%. Żele utwardzone są w tekście oznaczane jako żele 80→100%, a żele zmiękczone jako żele 100→80%. W przypadku żeli kontrolnych lub statycznych, do innego zestawu żeli 100% i 80% dostarcza się ssDNA składające się z T lub A. Po upływie minimum dwóch dni od modulacji elastyczności komórki mogą zostać poddane dalszej obróbce i analizie.

Szycie DNALiczba zasadSekwencja (Toehold)ModyfikacjaTemperatura topnienia (Tm, °C)Komentarze
5'→3'
Projekt 1SA110GCA CCT TTG C5' Acrydite34.9
SA210GTC AGA ATG A5' Acrydite23.6
L230TCA TTC TGA CGC AAA GGT GCG CTA CAC TTG56Uwzględniono 10 bp sekwencję toehold. 
R230CAA GTG TAG CGC ACC TTT GCG TCA GAA TGAR2 jest komplementarny do L2
Projekt 2SA114CGT GGC ATA GGA CT5' Acrydite46.9
SA214GTT TCC CAA TCA GA5' Acrydite40.2
L240TCT GAT TGG GAA ACA GTC CTA TGC CAC GGT TAC CTT CAT C65.9Uwzględniono 12 bp sekwencję toehold. 
R240GAT GAA GGT AAC CGT GGC ATA GGA CTG TTT CCC AAT CAG A65.9R2 jest komplementarny do L2
Projekt 3SA120ACG GAG GTG TAT GCA ATG TC5' Acrydite55
SA220CAT GCT TAG GGA CGA CTG GA5' Acrydite56.6
L240TCC AGT CGT CCC TAA GCA TGG ACA TTG CAT ACA CCT CCG T68.8Toehold nie został uwzględniony.
KontrolaKontrola20-40AAA AAA (itp.) lub
TTT TTT (itp.)

Tabela 1. Sekwencje zasad dla ssDNA 9-11,13,14,18,21. W badaniach komórkowych i mechanicznych wykorzystano kilka różnych projektów wiązań krzyżowych w celu wytworzenia żeli DNA o różnych statycznych i dynamicznych właściwościach mechanicznych. Parametrami modyfikowanymi w projekcie wiązań krzyżowych są sekwencja zasad oraz długość sekwencji lub długość wiązania krzyżowego. Pogrubiona i kursywa czcionka ilustrują odpowiednio parowanie zasad między SA1 a L2 oraz między SA2 a L2.

Projekt
123
Stężenie akryloamidu (%)1010104
SA1 plus SA2 zhybrydyzowane z L2 (% sieciowania)50801005080100100100
Elastyczność (kPa, Średnia±SEM)6.6 ± 0.617.1 ± 0.829.8 ± 2.55.85± 0.6212.67 ± 1.3322.88 ± 2.7725.2 ± 0.510.4 ± 0.6

Tabela 2. Moduł Younga (E) żeli DNA 9-11,13,14,18,21. Stężenie akryloamidu, procent sieciowania oraz długość wiązań sieciujących mogą być modulowane w żelach DNA. Projekty 1, 2 i 3 mają odpowiednio długości wiązań sieciujących 20, 28 i 40 bp. Żele 100% dla wszystkich projektów mają zbliżone moduły, co wskazuje, że długość wiązania sieciującego nie wpływa na elastyczność żelu. Jednakże zmiany stężenia akryloamidu zmieniają elastyczność żelu DNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Cały protokół, od przygotowania żelu po przetwarzanie komórek, trwa minimum sześć dni. Szacowany czas przygotowania żelu to 8 hr oraz inkubacja O/N. Szacowany czas immobilizacji żelu i hybrydyzacji DNA to 8 hr oraz etap płukania O/N. Szacowany czas funkcjonalizacji żelu to 2 hr. Czas wysiewania i wzrostu komórek zależy od rodzaju hodowli i zastosowania, jednak wymagane jest minimum cztery dni.

1. Przygotowanie żeli do DNA

UWAGA: Żele DNA należy przygotować w trzech oddzielnych etapach. Po pierwsze, należy indywidualnie spolimeryzować ssDNA SA1 i SA2 w szkielecie PA. Roztwory te nazywane są odpowiednio spolimeryzowanym roztworem SA1 oraz spolimeryzowanym roztworem SA2 (§1.1). Po drugie, należy rozpuścić łącznik (crosslinker), nić odwracalną oraz kontrolne ssDNA. Rozpuścić liofilizowane ssDNA L2 (łącznik). Roztwór ten nazywany jest 100% roztworem L2 i służy do wytwarzania żeli 100% (§1.2). Alikwot 100% roztworu L2 należy rozcieńczyć do stężenia 80%. Roztwór ten nazywany jest 80% roztworem L2 i służy do wytwarzania żeli 80%. Rozpuścić liofilizowane R2 (nić odwracalna) oraz kontrolne ssDNA do wykorzystania w §4. Po trzecie, należy zmieszać spolimeryzowany roztwór SA1, spolimeryzowany roztwór SA2 oraz 100% lub 80% roztwór L2 w stosunku 10:10:6 (SA1:SA2:L2), aby utworzyć odpowiednio żele 100% i 80% (§1.3).

1. Przygotowanie spolimeryzowanych roztworów SA1 i SA2

  1. Wybrać i zamówić odpowiednie sekwencje bazowe SA1, SA2, L2 i R2 z Tabel 1 i 2. Sekwencje bazowe oraz ich długość zostały zoptymalizowane w poprzednich raportach 9-11,13,14.
  2. Obliczyć skład wszystkich roztworów (Tabele 3-4). UWAGA: Należy skrupulatnie dokumentować obliczenia w celu późniejszego rozwiązywania problemów. Zaleca się stworzenie szablonu w programie Excel, który można będzie wielokrotnie wykorzystywać do przygotowywania żeli DNA. Przykład zestawienia dla Projektu 2 (Tabele 1 i 2) znajduje się w Tabelach 3 i 4. Objętości określone w Tabeli 4 będą stosowane w całym niniejszym protokole, jednak objętości będą się różnić dla każdej alikwoty liofilizowanego ssDNA.
RoztwórStężenie zapasowe roztworuProcent roztworu zapasowego w spolimeryzowanym roztworze SA1 lub SA2 (v/v)Stężenie końcowe roztworu w spolimeryzowanym roztworze SA1 lub SA2
Akrylamid (bez bisakrylamidu)40%2510%
Roztwór SA1 lub SA2100%6060%
Bufor TBE10x101x
TEMED20%2,50,50%
APS2%2,50,05%

Tabela 3. Procentowe udziały roztworów do przygotowania spolimeryzowanych roztworów SA1 lub SA2. Pierwsza kolumna przedstawia roztwory do przygotowania żeli DNA. Druga kolumna pokazuje stężenia tych roztworów w postaci stoku. Trzecia kolumna przedstawia procentowy udział roztworów stokowych w spolimeryzowanych roztworach SA1 lub SA2 (v/v). Ostatnia kolumna odzwierciedla stężenia końcowe w roztworach SA1 i SA2.

Składniki roztworów
RoztwórStężenie roztworu stokowego Końcowe stężenie roztworuObliczeniaIlość do dodaniaUwagi
Roztwory ssDNA (§1.1)
Roztwór SA1320,7 nmol liofilizowanego ssDNA SA13,00 mM320,7 nmol / 3,00 nmol μl-1 = 107 µl107 µl buforu TE do liofilizowanego ssDNARoztwór SA1 stanowi 60% spolimeryzowanego roztworu SA1.  
107 µl / 0,600 = 178 µl
178 µl to całkowita objętość spolimeryzowanego roztworu SA1 (Tabela 3).
Roztwór SA2324,4 nmol liofilizowanego ssDNA SA23,00 mM324,4 nmol / 3,00 nmol μl-1 = 108 µl108 µl buforu TE do liofilizowanego ssDNARoztwór SA2 stanowi 60% spolimeryzowanego roztworu SA2.
108 µl / 0,600 = 180 µl
180 µl to całkowita objętość spolimeryzowanego roztworu SA2 (Tabela 3).
Roztwór 100% L2657,4 nmol liofilizowanego ssDNA L23,00 mM657,4 nmol / 3,00 nmol μl-1 = 219 µl219 µl buforu TE do liofilizowanego ssDNARozcieńczyć alikwot roztworu 100% L2 do stężenia 80% L2
Roztwór 80% L280 µl ssDNA 100% L280%—20 µl buforu TE do 80 µl roztworu 100% L2
Roztwór kontrolny332,6 nmol liofilizowanego ssDNA poly T lub A3,00 mM332,6 nmol / 3,00 nmol μl-1 = 111 µl111 µl buforu TE do liofilizowanego ssDNA
Roztwór R2193,8 nmol liofilizowanego ssDNA R23,00 mM193,8 nmol / 3,00 nmol μl-1 = 64,6 µl64,6 µl buforu TE do liofilizowanego ssDNA
Roztwory spolimeryzowane (§1.2)
Spolimeryzowany roztwór SA140% akrylamid10%178 µl x 0,25 = 44,5 µl45 µlObliczyć ilość akrylamidu, TBE, APS i TEMED w oparciu o całkowitą objętość 178 µl (patrz powyżej i Tabela 3).
10x TBE1x178 µl x 0,10 = 17,8 µl18 µl
roztwór 100% SA160%—107 µlRoztwór SA1 stanowi 60% spolimeryzowanego roztworu SA1 (patrz powyżej i Tabela 3).
2% APS0,05%178 µl x 0,025 = 4,45 µl4,5 µlDodać i wymieszać APS przed dodaniem TEMED.
20% TEMED0,50%178 µl x 0,025 = 4,45 µl4,5 µl
Spolimeryzowany roztwór SA240% akrylamid10%180 µl x 0,25 = 45 µl45 µlObliczyć ilość akrylamidu, TBE, APS i TEMED w oparciu o całkowitą objętość 180 µl (patrz powyżej i Tabela 3).
10x TBE1x180 µl x 0,10 = 18 µl18 µl
roztwór 100% SA260%—108 µlRoztwór SA2 stanowi 60% spolimeryzowanego roztworu SA2 (patrz powyżej i Tabela 3).
2% APS0,05%180 µl x 0,025 = 4,5 µl4,5 µlDodać i wymieszać APS przed dodaniem TEMED
20% TEMED0,50%180 µl x 0,025 = 4,5 µl4,5 µl
Roztwory żelowe (§1.3)
100% roztwór żelu100% spolimeryzowany roztwór SA110 części—10 µlPrzygotować żele 100% z następującym stosunkiem SA1:SA2:L2, 10:10:6.
100% spolimeryzowany roztwór SA210 części—10 µl
roztwór 100% L2 6 części—6 µl
80% roztwór żelu100% spolimeryzowany roztwór SA110 części—10 µlPrzygotować żele 80% z następującym stosunkiem SA1:SA2:L2, 10:10:6.
100% spolimeryzowany roztwór SA210 części—10 µl
roztwór 80% L26 części—6 µl
Żele dynamiczne (§3-4)
żel 80→100%żel 80%żel 100%Obliczenie 1:1 µl roztworu 100% L2 do pożywki hodowlanejObliczenia oparto na żelach o objętości 20 µl na szkiełkach nakrywkowych. Po pierwsze, przeliczyć części roztworu 100% L2 w 20 µl żelu na µl. Po drugie, obliczyć ilość (w µl) roztworu 100% L2 potrzebną do dodatkowego 20% usieciowania. Dodać tę ilość roztworu 100% L2 do żelu.
(20 µl / 26 części) x 6 części = 4,6 µl
Obliczenie 2:
5 µl x 0,2 = 1 µl
żel 100→80%żel 100%żel 80%Obliczenie 1:1 µl roztworu 100% R2 do pożywki hodowlanejObliczenia oparto na żelach o objętości 20 µl na szkiełkach nakrywkowych. Po pierwsze, przeliczyć części roztworu 100% L2 w 20 µl żelu na µl. Po drugie, obliczyć ilość (w µl) roztworu 100% L2, którą należy usunąć, aby uzyskać żel 20%. Dodać tę ilość roztworu R2 do żelu.
(20 µl / 26 części) x 6 części = 4,6 µl
Obliczenie 2:
5 µl x 0,2= 1 µl
żel 100% (kontrolny)żel 100%żel 100%—1 µl roztworu kontrolnego do pożywki hodowlanejIlość roztworu kontrolnego jest równoważna ilości dodanego roztworu R2.
żel 80% (kontrolny)żel 80%żel 80%—1 µl roztworu kontrolnego do pożywki hodowlanejIlość roztworu kontrolnego jest równoważna ilości dodanego roztworu 100% L2.

Tabela 4. Przykładowe obliczenia dla przygotowania żelu do DNA. Podano przykładowe liczby w celu zilustrowania obliczeń dla przygotowania żeli 80%, 100%, 100→80% oraz 80→100%. Żele do DNA to Projekt 2 w Tabeli 1.

  1. Odwiruj liofilizowane ssDNA SA1 przy 2,000 x g przez 15 sec, aby upewnić się, że całe ssDNA znajduje się na dnie probówki. UWAGA: Prawidłowe stężenie roztworu SA1 jest kluczowe dla syntezy żelu DNA.
  2. Przygotuj 3 mM roztwór SA1, dodając 107 µl buforu 1x Tris-EDTA, pH 8,0 (bufor TE) do probówki (Tabele 3-4).
  3. Podgrzewaj SA1 w buforze TE w temperaturze 70 °C przez 5 min lub do całkowitego rozpuszczenia osadu ssDNA. UWAGA: Temperatura podgrzewania powinna być co najmniej o 5 °C wyższa od temperatury topnienia (Tm), aby zapewnić jednoniciowy stan DNA.
  4. Przygotuj roztwór do polimeryzacji SA1, dodając 40% akryloamid oraz bufor 10x Tris-Borate-EDTA (TBE) w indicated procentach (Tabela 3). W tym przykładzie dodaj odpowiednio 45 i 18 µl do 107 µl roztworu SA1 (Tabela 4).
  5. Odgazuj azotem przez 3 min, aby ułatwić mieszanie. Wprowadź końcówkę p200 podłączoną do źródła azotu do roztworu i powoli przepuść gaz przez ciecz. Przed odgazowaniem roztworu SA1 sprawdź szybkość przepływu azotu w wodzie, aby zapobiec rozpryskiwaniu.
  6. Odwiruj przez 15 sec przy 2,000 x g, aby zebrać roztwór.
  7. Dodaj 4,5 µl 2% nadsiarczanu amonu (APS, Tabele 3-4), aby zainicjować polimeryzację żelu.
  8. Kilkakrotnie odwróć probówkę, aby wymieszać zawartość.
  9. Odwiruj przez 15 sec przy 2,000 x g, aby zebrać roztwór w celu zapewnienia homogenicznej polimeryzacji.
  10. Dodaj 4,5 µl 20% tetrametyloetylenodiaminy (TEMED, Tabele 3-4), aby katalizować polimeryzację.
  11. Kilkakrotnie odwróć probówkę, aby wymieszać zawartość.
  12. Odwiruj przez 15 sec przy 2,000 x g, aby zebrać roztwór w celu zapewnienia homogenicznej polimeryzacji.
  13. Odgazuj azotem przez 3-5 min, aby dokończyć polimeryzację i zminimalizować ilość niezareagowanych monomerów.
  14. Inkubuj roztwór przez 10 min w temperaturze pokojowej (RT), aby zakończyć polimeryzację. UWAGA: Roztwór ten nazywa się spolimeryzowanym roztworem SA1.
  15. Powtórz kroki 1.1.3-1.1.16 z liofilizowanym ssDNA SA2, dodając odpowiednio 45, 18, 4,5 i 4,5 µl akryloamidu, TBE, APS i TEMED do 108 µl roztworu SA2 (Tabele 3-4). UWAGA: Spolimeryzowane roztwory SA1 i SA2 można przechowywać w temperaturze 4 °C do jednego miesiąca.

2. Przygotowanie roztworów L2, R2 i kontrolnych

  1. Powtórz kroki 1.1.3-1.1.5 z liofilizowanym ssDNA R2, dodając 64,4 µl buforu TE (Tabela 4).
  2. Powtórz kroki 1.1.3-1.1.5 z liofilizowanym kontrolnym ssDNA, dodając 111 µl buforu TE (Tabela 4).
  3. Powtórz kroki 1.1.3-1.1.5 z liofilizowanym ssDNA L2, dodając 219 µl buforu TE (Tabela 4). UWAGA: Jest to 100% roztwór L2. Dodanie 100% roztworu L2 do spolimeryzowanych roztworów SA1 i SA2 (patrz §1.3) doprowadzi do powstania 100% sieciowanego żelu DNA (żel 100%), ponieważ SA1, SA2 i L2 będą ekwiwalentne stechiometrycznie.
  4. Rozcieńcz alikwot 100% roztworu L2 do stężenia 80%, dodając 20 µl 1x buforu TE do 80 µl 100% roztworu L2 (Tabela 4). UWAGA: Jest to 80% roztwór L2. Dodanie 80% roztworu L2 do spolimeryzowanych roztworów SA1 i SA2 (patrz §1.3) doprowadzi do powstania 80% sieciowanego żelu DNA (żel 80%), ponieważ tylko 80% SA1 i SA2 zostanie sieciowanych z L2. Roztwory można przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie jeden miesiąc.

3. Przygotowanie roztworów żelu

  1. Podgrzewać spolimeryzowane roztwory SA1 i SA2 w temperaturze 70 °C do momentu zmniejszenia lepkości roztworu (około 1 min). Jeśli roztwór nadal jest zbyt lepki, aby można go było pipetować, zwiększyć temperaturę do 80 °C.
  2. Dodać 10 µl lub 10 części spolimeryzowanego roztworu SA1 do 10 µl lub 10 części spolimeryzowanego roztworu SA2 (Tabela 4). UWAGA: Spolimeryzowane roztwory SA1 i SA2 są niezwykle lepkie i trudne do pipetowania. Ponieważ stężenia są krytyczne dla tworzenia żelu, od tego momentu należy używać pipety z wyporem dodatnim lub zapoznać się z omówieniem w celu poznania innych technik manipulacji. Należy również pipetować w wielu małych aliquotach (>20 µl) zamiast jednej dużej objętości.
  3. Wymieszać spolimeryzowane roztwory SA1 i SA2, stosując naprzemienne podgrzewanie (przez 15 s w 70 °C) i mieszanie (przez 15 s końcówką pipety) przez łącznie 1 min.
  4. Dodać 6 µl lub 6 części 100% roztworu L2, aby utworzyć 100% żel (Tabela 4).
  5. Wymieszać, stosując naprzemienne podgrzewanie i mieszanie, jak opisano w kroku 1.3.3.
  6. Podgrzewać żel przez 1 h w optymalnej temperaturze wyżarzania (35 °C). Temperaturę wyżarzania obliczyć, odejmując 5 °C od temperatury topnienia sekwencji ssDNA o najniższej temperaturze topnienia (Tabela 1).
  7. Przenieść 100% żel pipetą do 60-mm szalki Petriego.
  8. Pozostawić wiązania krzyżowe DNA do dalszej rehybrydyzacji, inkubując żel przez 4 h w RT.
  9. Przykryć żel buforem PBS zawierającym wapń i magnez i inkubować O/N w RT. UWAGA: Żele spęcznieją około 3-krotnie w stosunku do ich objętości początkowej. Ponadto żele zrównoważą się z buforem, a nadmiar akryloamidu dyfunduje z żeli. Wapń i magnez w PBS stabilizują hybrydyzację DNA i zapobiegają pękaniu żelu (patrz Omówienie w celu rozwiązania problemów z pękaniem żelu).
  10. Usunąć pozostały bufor z szalki Petriego.
  11. Aby wytworzyć żele 80%, powtórzyć kroki 1.3.1-1.3.10, zastępując 100% roztwór L2 w kroku 1.3.4 roztworem L2 80%. Przechowywać żele 100% i 80% w temperaturze 4 °C do jednego miesiąca. UWAGA: Różnice w sztywności między żelami 80% a 100% są fizycznie rozróżnialne.

2. Immobilizacja żelu na szkle

UWAGA: Unieruchom aliquoty żeli 100% lub 80% na szklanych lamellkach (Rysunek 2).

  1. Podgrzać 100% żel w temperaturze 70 °C przez około 30 sek lub do momentu, gdy żel stanie się mniej lepki, co umożliwi pipetowanie.
  2. Umieścić szklane krawetki na bloku grzewczym o temperaturze 70 °C i pozostawić do podgrzania na 1-2 min.
  3. Nanieść kroplę kleju optycznego na każdą szklaną krawetkę.
  4. Nanieść 20 µl 100% żelu na każdą szklaną krawetkę (Tabela 4). UWAGA: na każdą krawetkę można nanieść od 10 do 30 µl.
  5. Pozostawić żel do roztopienia i rozpłynięcia się po szklanej krawetce. UWAGA: Jeśli topologia żelu nie wydaje się jednorodna po roztopieniu, należy go wypłaszczyć inną silikonowaną szklaną krawetką. Należy jednak pamiętać, że w kolejnych krokach nastąpi dodatkowe pęcznienie, co może przyczynić się do nierównomierności żelu.
  6. Zdjąć żel na szkle z bloku grzewczego i umieścić go w 24-dołkowej płytce do hodowli tkanek.
  7. Powtórzyć kroki 2.1-2.6 dla żelu 80%.
  8. Podgrzewać żele przez 1 h w optymalnej temperaturze wyżarzania (35 °C). UWAGA: Jest normalne, że żele wysychają; zostanie to rozwiązane podczas inkubacji żeli w PBS.
  9. Naświetlać płytki zawierające żele 80% i 100% światłem ultrafioletowym (UV, 365 nm) przez 15 min. UWAGA: Naświetlanie UV jednocześnie utwardza klej i sterylizuje żele. Jeśli komora do sieciowania UV nie jest dostępna, żele można umieścić pod lampą UV znajdującą się w komorze laminarnej. Po naświetlaniu UV przeprowadzić kolejne kroki protokołu w komorze laminarnej, aby zachować sterylność żeli. Od tego momentu należy również stosować sterylne roztwory.
  10. Pozostawić wiązania krzyżowe DNA do rehybrydyzacji w RT przez 4 h.
  11. Dodać PBS i inkubować przez noc (O/N) w temperaturze 4 °C. UWAGA: Inkubacja w PBS płucze, równoważy i ponownie napęcznia żele, ponieważ wielokrotne podgrzewanie może prowadzić do ich odwodnienia.

Schemat procesu powlekania kolagenem; ustawienie dysku żelowego z ekspozycją na UV w celu przytwierdzenia macierzy zewnątrzkomórkowej.
Rycina 2. Schemat unieruchomienia i funkcjonalizacji żelu. Po przygotowaniu żeli DNA (szare), żele są przytwierdzane do szkiełek nakrywkowych (białe) za pomocą kleju optycznego (zielony). Żele są jednocześnie utwardzane i sterylizowane światłem UV. Po spęcznieniu żele mają grubość około 1 mm. Następnie żele są funkcjonalizowane w dwuetapowym procesie (ramka czerwona). Po pierwsze, sulfo-SANPAH jest koniugowany z akrylamidem na powierzchniach żelu poprzez ekspozycję na światło UV. Po drugie, żele są inkubowane z kolagenem lub poli-D-lizyną, która przytwierdza się do estru sulfo-N-hydroksysuccynimidowego w sulfo-SANPAH. Rycina została zmodyfikowana na podstawie źródła 10.

3. Funkcjonalizacja żelu

UWAGA: Funkcjonalizacja żelu DNA jest niezbędna dla adhezji komórek, ponieważ żele poliakrylamidowe są materiałami obojętnymi (Rysunek 2). W tej sekcji żele zostaną funkcjonalizowane w dwóch etapach. Po pierwsze, N-sulfosukcynimidylo-6-(4'-azydo-2'-nitrofenyloamino)heksanian lub sulfo-SANPAH zostanie kowalencyjnie przyłączony poprzez fotolizę grupy azydonitrofenylowej do szkieletu poliakrylamidowego żeli DNA. Po drugie, aminy pierwszorzędowe w kolagenie lub poli-D-lizynie przyłączą się do estru sulfo-N-hydroksysukcynimidu w sulfo-SANPAH, aby przymocować białka do powierzchni żelu.

  1. Usuń bufor z dołków za pomocą pipety, uważając, aby nie odessać żelu. UWAGA: Nie stosuj aspiracji próżniowej, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo odessania żelu.
  2. (Opcjonalnie) Przemyj żele trzykrotnie przez 15 min w RT, aby usunąć nadmiar monomeru akrylamidu, TEMED i APS.
  3. Dodaj około 300 µl sulfo-SANPAH, aby pokryć każdy żel.
  4. Naświetlaj żele promieniowaniem UV (365 nm) przez 5 min.
  5. Usuń sulfo-SANPAH.
  6. Przepłucz żele raz w PBS, aby usunąć nadmiar sulfo-SANPAH.
  7. Powtórz kroki 3.3-3.6.
  8. Inkubuj żele w około 300 µl roztworu poly-D-lysine o stężeniu 0.2 mg/ml przez 1 hr w RT lub O/N w 4 °C. UWAGA: Alternatywnie inkubuj żele z kolagenem typu 1 o stężeniu 0.2 mg/ml O/N w 4 °C.
  9. Przemyj żele dwukrotnie w PBS przez 5 min, aby usunąć nadmiar poly-D-lysine.
  10. Inkubuj żele w około 300 µl pożywki przez 30 min w celu równowagi żeli.
  11. Usuń pożywkę bezpośrednio przed wysianiem komórek.

4. Hodowla i obrazowanie komórek

UWAGA: W tej sekcji przedstawiamy szczegóły dotyczące zmiękczania lub utwardzania żeli po wysiewaniu komórek. Z kilku powodów nie podano tutaj szczegółowego protokołu hodowli komórek. Po pierwsze, wiele typów komórek może przylegać do żeli DNA, a każdy typ komórek wymaga od badacza specyficznych dostosowań procesu wysiewania. Po drugie, w tych eksperymentach stosuje się standardowe techniki hodowli komórek i tkanek, które można znaleźć w licznych artykułach oryginalnych, artykułach technicznych oraz książkach referencyjnych. Techniki dotyczące konkretnie wysiewania fibroblastów i neuronów na żele DNA można znaleźć w poprzednich publikacjach 9-11,19-21.

  1. Wysiej komórki. W celu zapoznania się z protokołami dotyczącymi sekcji i/lub hodowli neuronów lub fibroblastów wspomnianych w niniejszym artykule, należy odwołać się do jednej z następujących publikacji 9-11,19-21.
  2. Po upływie minimum 48 hr zmodyfikuj sztywność żelu, pipetując 1 µl roztworu kontrolnego, L2 lub R2 w bezpośrednim sąsiedztwie żelu (Tabela 4).
    1. Aby zwiększyć sztywność żeli z poziomu 80% do 100% usieciowania (żele 80→100%), uzupełnij brakujące 20% L2 w żelach 80%, dodając 1 µl 100% roztworu L2 w bezpośrednim sąsiedztwie żelu.
    2. Aby zmniejszyć sztywność żeli z poziomu 100% do 80% usieciowania (żele 100→80%), dodaj R2 w celu usunięcia 20% wiązań sieciujących z żeli 100%, dodając 1 µl 100% roztworu R2 w bezpośrednim sąsiedztwie żelu.
    3. W przypadku kontroli dodaj równą objętość roztworu kontrolnego do podgrupy żeli 100% i 80%, dodając 1 µl roztworu kontrolnego w bezpośrednim sąsiedztwie żelu.
  3. Przeprowadź pożądane przetwarzanie komórek i analizę danych po upływie minimum 48 hr.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przed naszymi badaniami oddziaływania między komórkami a macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) obserwowano na statycznych, podatnych biomateriałach lub na nieodwracalnych i jednokierunkowych podłożach dynamicznych. Podłoża te nie odzwierciedlają dokładnie dynamicznego charakteru mikrośrodowiska komórkowego. Nasza praca zmienia istniejące paradygmaty techniczne, dostarczając bardziej fizjologiczny model badania oddziaływań komórka-ECM na dynamicznych biomateriałach ulegających zmiękczaniu i utwardzaniu. W poprzednich badaniach...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zdolność żeli DNA do zmiękczania lub usztywniania przed i po adhezji komórek sprawia, że są one idealnym modelem do badania roli dynamicznej sztywności tkanek na funkcję komórki. Wszystkie trzy konstrukcje zostały wykorzystane w badaniach mechanicznych i biologicznych. Jednak wszystkie trzy projekty mają podobną elastyczność przy różnych procentach usieciowania, co wskazuje, że długość usieciowania nie wpływa na elastyczność żelu DNA (Tabela 2). Natomiast stężenie akrylamidu wpływa na elastyczność. Konst...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować: Dr. Frankowi Jiangowi, Dr. Davidowi Linowi, Dr. Bernardowi Yurke i Dr. Udayowi Chippadzie za ich wkład w rozwój technologii żelu DNA; Dr. Norellowi Hadzimichalisowi, Smitowi Shahowi, Kimberly Peterman, Robertowi Arterowi za komentarze i edycje tego rękopisu; źródłom finansowania, w tym New Jersey Commission on Spinal Cord Research (Grant #07A-019-SCR1, N.A.L.) oraz New Jersey Neuroscience Institute (M.L.P.); oraz wydawcom Tissue Engineering, Part A o zgodę na przedruk rysunków 2 i 4 oraz Biomaterials o zgodę na przedruk ryciny 3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ssDNAIntegrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)
idtdna.com		Nie wirować ssDNA. Delikatnie odwrócić fiolkę i/lub roztwór pipety do wymieszania.
PBS z wapniem i magnezemDowolna marka.
100x Bufor Tris-EDTA (bufor TE)Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)
sigmaldrich.com		T9285
10x Bufor Tris-Borate-EDTA (Bufor TBE)Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)93290TBE jest toksyną reprodukcyjną.
40% roztwór akrylamiduFisher Scientific (Pittsburg, PA)BP14021Akrylamid jest toksyną.
Nadsiarczan amonu (APS)Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)A3678Przygotować 2% roztwór w buforze TE. APS jest toksyną i środkiem drażniącym.
Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)T9281Przygotować 20% roztwór w buforze TE. TEMED jest łatwopalny, i toksyczny.
Okrągłe szkło nakrywkowe o średnicy 12 mmFisher Scientific (Pittsburg, PA)
fishersci.com		12-545-82
Klej optyczny Norland 72Norland Products (Cranbury, NJ)
norlandprod.com		NOA72
24-dołkowa płytkaDowolna marka.
do mikrowirówekDowolna marka.
Sulfo-SANPAHProteoChem lub Thermo Fisher, (Rockland, IL)
proteochem.com lub thermofisher.com		C111 lub 22589Przygotować roztwór 0,315 mg/ml w wodzie bezpośrednio przed użyciem. Rozpuścić w temperaturze 37 stopni; C i sterylizować filtr. Normalne jest obserwowanie nierozpuszczonego sulfo-SANPAH w filtrze. Sulfo-SANPAH jest wrażliwy na światło, dlatego roztwór należy chronić przed światłem do momentu ekspozycji na promieniowanie UV.
Poli-D-lizyna (PDL)Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)P6407Przygotować roztwór 0,2 mg/ml w wodzie i przefiltrować sterylizować.
Kolagen typu IAffymetrix (Santa Clara, CA)
affymetrix.com		13813Przygotować roztwór 0,2 mg/ml w 0,2 N kwasie octowym. Roztwór musi pozostać zimny przez cały czas, aby uniknąć polimeryzacji. Kwas octowy jest substancją łatwopalną, toksyczną i.
Szkło nakrywkowe 22 x 60Fisher Scientific (Pittsburg, PA)12-544-G
Pipeta wyporowaGilson, Inc (Middletown, WI)
gilson.com		F148504
Blok grzewczyFisher Scientific (Pittsburg, PA)11-718
ŹródłoŻele należy umieszczać jak najbliżej światła UV. Światło UV może spowodować obrażenia skóry lub oczu.
Termometrdowolnej marki.
Azot gazowyGTS-Welco (Flemington, NJ)
www.praxairmidatlantic.com/		NI 5.0UH-R
do hodowli tkankowej Probówki światła UV

Bibliografia

  1. Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly A close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nat Cell Biol. 3 (5), 466-472 (2001).
  2. Peppas Brannon-Peppas, L., Peppas, N. A. Dynamic and equilibrium swelling behaviour of ph-sensitive hydrogels containing 2-hydroxyethyl methacrylate. Biomaterials. 11 (9), 635-644 (1990).
  3. Charati, M. B., Ifkovits, J. L., Burdick, J. A., Linhardt, J. G., Kiick, K. L. Hydrophilic elastomeric biomaterials based on resilin-like polypeptides. Soft Matter. 5 (18), 3412-3416 (2009).
  4. Davis, K. A., Burke, K. A., Mather, P. T., Henderson, J. H. Dynamic cell behavior on shape memory polymer substrates. Biomaterials. 32 (9), 2285-2293 (2011).
  5. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophys J. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  6. Gray, D. S., Tien, J., Chen, C. S. Repositioning of cells by mechanotaxis on surfaces with micropatterned youngs modulus. J Biomed Mater Res A. 66 (3), 605-614 (2003).
  7. Homma, M., Seida, Y., Nakano, Y. Effect of ions on the dynamic behavior of an electrodriven ionic polymer hydrogel membrane. Journal of applied Polymer Science. 82 (1), 76-80 (2001).
  8. Horkay, F., Tasaki, I., Basser, P. J. Osmotic swelling of polyacrylate hydrogels in physiological salt solutions. Biomacromolecules. 1 (1), 84-90 (2000).
  9. Jiang, F. X., Yurke, B., Firestein, B. L., Langrana, N. A. Neurite outgrowth on a DNA crosslinked hydrogel with tunable stiffnesses. Ann Biomed Eng. 36 (9), 1565-1579 (2008).
  10. Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. Effect of dynamic stiffness of the substrates on neurite outgrowth by using a DNA-crosslinked hydrogel. Tissue Engineering Part A. 16 (6), 1873-1889 (2010).
  11. Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. The relationship between fibroblast growth and the dynamic stiffnesses of a DNA crosslinked hydrogel. Biomaterials. 31 (6), 1199-1212 (2010).
  12. Kloxin, A. M., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Synthesis of photodegradable hydrogels as dynamically tunable cell culture platforms. Nat Protoc. 5 (12), 1867-1887 (2010).
  13. Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. Mechanical properties of a reversible, DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogel. J Biomech Eng. 126 (1), 104-110 (2004).
  14. Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. Use of rigid spherical inclusions in young's moduli determination: Application to DNA-crosslinked gels. J Biomech Eng. 127 (4), 571-579 (2005).
  15. Luo, Y., Shoichet, M. S. Light-activated immobilization of biomolecules to agarose hydrogels for controlled cellular response. Biomacromolecules. 5 (6), 2315-2323 (2004).
  16. Marklein, R. A., Burdick, J. A. Spatially controlled hydrogel mechanics to modulate stem cell interactions. Soft Matter. 6 (1), 136-143 (2010).
  17. Pelham Jr, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  18. Previtera, M. L., Chippada, U., Schloss, R. S., Yurke, B., Langrana, N. A. Mechanical properties of DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogels with increasing crosslinker density. BioResearch Open Access. 1 (5), 256-259 (2012).
  19. Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Firestein, B. L. Effects of substrate stiffness and cell density on primary hippocampal cultures. J Biosci Bioeng. 110 (4), 459-470 (2010).
  20. Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Langrana, N. A., Firestein, B. L. Regulation of dendrite arborization by substrate stiffness is mediated by glutamate receptors. Ann Biomed Eng. 38 (12), 3733-3743 (2010).
  21. Previtera, M. L., Trout, K. L., Verma, D., Chippada, U., Schloss, R. S., Langrana, N. A. Fibroblast morphology on dynamic softening of hydrogels. Ann Biomed Eng. 40 (5), 1061-1072 (2012).
  22. Saxena, T., Gilbert, J., Stelzner, D., Hasenwinkel, J. Mechanical characterization of the injured spinal cord after lateral spinal hemisection injury in the rat. J Neurotrauma. 29 (9), 1747-1757 (2012).
  23. Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3d collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnol Bioeng. 102 (2), 632-643 (2009).
  24. Wozniak, M. A., Chen, C. S. Mechanotransduction in development A growing role for contractility. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (1), 34-43 (2009).
  25. Wuerfel, J., et al. Mr-elastography reveals degradation of tissue integrity in multiple sclerosis. Neuroimage. 49 (3), 2520-2525 (2012).
  26. Zaari, N., Rajagopalan, P., Kim, S. K., Engler, A. J., Wong, J. Y. Photopolymerization in microfluidic gradient generators Microscale control of substrate compliance to manipulate cell response. Adv Mater. 16 (23-24), 2133-2137 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Hydro ele sieciowane DNAprzygotowanie elu poliakryloamidowegosieciowanie elu za pomoc DNAdostarczanie jednoniciowego DNAmodulacja elastyczno ci elupod o a do hodowli kom rkowychbadania z zakresu mechanobiologiidynamiczna kontrola sztywno cizachowanie neuron w i fibroblast wimmobilizacja za pomoc kleju optycznego
Otrzymywanie usieciowanych DNA hydrożeli poliakrylamidowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.