Rekrutacja leukocytów do wątroby odbywa się w wyspecjalizowanych kanałach sinusoid wątrobowych, które są wyściełane unikalnymi komórkami śródbłonka sinusoidalnego wątroby. Mikroskopia z kontrastem fazowym rekrutacji leukocytów przez ludzki śródbłonek sinusoidalny wątroby w warunkach fizjologicznego naprężenia ścinającego może ułatwić wyjaśnienie mechanizmów molekularnych, które leżą u podstaw tego procesu.
Artykuł metodologiczny
Test adhezji przepływowej do badania rekrutacji leukocytów do ludzkiego śródbłonka sinusoidalnego wątroby w warunkach naprężeń ścinających
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przenikanie leukocytów do ludzkiej tkanki wątroby jest powszechnym procesem we wszystkich chorobach zapalnych wątroby u dorosłych. Przewlekły naciek może prowadzić do rozwoju zwłóknienia i progresji do marskości wątroby. Zrozumienie mechanizmów molekularnych, które pośredniczą w rekrutacji leukocytów do wątroby, może zidentyfikować ważne cele terapeutyczne w chorobach wątroby. Kluczową interakcją podczas rekrutacji leukocytów jest interakcja komórek zapalnych ze śródbłonkiem w warunkach naprężeń ścinających. Rekrutacja do wątroby zachodzi w kanałach niskiego ścinania sinusoid wątrobowych, które są wyściełane przez komórki śródbłonka sinusoidalnego wątroby (HSEC). Warunki w obrębie sinusoid wątrobowych można podsumować poprzez perfuzję leukocytów przez kanały wyłożone ludzkimi monowarstwami HSEC przy określonych prędkościach przepływu. W tych warunkach leukocyty przechodzą krótki etap wiązania, po którym następuje aktywacja i mocna adhezja, po którym następuje etap pełzania, a następnie transmigracja przez warstwę śródbłonka. Za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym każdy etap tej "kaskady adhezji" może być wizualizowany i rejestrowany, a następnie analizowany w trybie offline. Komórki śródbłonka lub leukocyty można wstępnie poddać działaniu inhibitorów w celu określenia roli określonych cząsteczek podczas tego procesu.
Wprowadzenie
Obecnie jest dobrze ustalone, że rekrutacja leukocytów ogólnie przebiega zgodnie z paradygmatem wieloetapowej kaskady adhezji1. Polega to na wychwytywaniu leukocytów z przepływającej krwi przez komórki śródbłonka wyściełające ścianę naczynia. Początkowo leukocyty przechodzą etap toczny, w którym pośredniczą receptory selektoryny lub członkowie nadrodziny immunoglobulin. Pozwala to na aktywację receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR) ulegających ekspresji na powierzchni leukocytów przez chemokiny prezentowane na glikokaliksie śródbłonka. Prowadzi to do zmiany potwierdzenia integryny na stan "wysokiego powinowactwa" na powierzchni leukocytów oraz zatrzymanie i mocne przyleganie do śródbłonka. Po mocnym przyleganiu następuje zmiana kształtu i pełzanie leukocytów po naczyniu. Ostatnim krokiem jest transmigracja przez monowarstwę śródbłonka, która może odbywać się drogami parakomórkowymi lub transkomórkowymi.
Podczas gdy wieloetapowa kaskada adhezji opisuje ogólny mechanizm rekrutacji leukocytów w organizmie, istnieją różnice specyficzne dla danego narządu. W wątrobie większość rekrutacji leukocytów zachodzi w obrębie sinusoid wątrobowych, w przeciwieństwie do innych narządów, w których rekrutacja na ogół zachodzi w obrębie żyłek zawłosionych2. Sinusoidy wątrobowe są środowiskiem o niskim ścinaniu, a leukocyty przechodzą krótki etap wiązania przed mocną adhezją, która jest niezależna od selektyny2. Kanały te są wyściełane przez sinusoidalny śródbłonek wątroby, który jest nieciągły i zawiera okienka, otwarte pory o średnicy 100-200 nm i brak błony podstawnej3. Wyjaśnienie mechanizmów molekularnych, które pośredniczą w rekrutacji leukocytów w ludzkim śródbłonku sinusoidalnym wątroby, może pomóc w zidentyfikowaniu specyficznych dla narządów celów terapeutycznych w chorobach zapalnych wątroby.
Testy adhezji przepływu są niezbędnymi narzędziami w badaniu rekrutacji leukocytów. Pozwalają one na rekonstrukcję rekrutacji leukocytów w obecności naprężeń ścinających w celu analizy adhezji pod wpływem dobrze zdefiniowanych sił. Najczęstszym zastosowaniem testu jest badanie adhezji leukocytów do hodowanych monowarstw śródbłonka lub oczyszczonych substratów. Dostępne na rynku komory przepływowe służą do perfuzji komórek w warunkach przepływu laminarnego między dwiema płaskimi powierzchniami, a następnie do wizualizacji dynamicznego procesu adhezji pod mikroskopem4. Poprzednie grupy wykazały, że niektóre oddziaływania adhezyjne zachodzą tylko pod wpływem przepływu i nie mogą być badane w testach statycznych5,6.
Użyliśmy tej techniki do podsumowania sinusoid wątrobowych i zbadania rekrutacji leukocytów w warunkach niskiego naprężenia ścinającego. Pierwotne ludzkie HSEC są hodowane w mikroszkiełkach, a leukocyty mogą być następnie perfundowane przez tę monowarstwę z szybkością przepływu obliczoną na odtworzenie naprężenia ścinającego w sinusoidach wątroby. Naprężenie ścinające to naprężenie, które jest przykładane równolegle lub stycznie do powierzchni, w przeciwieństwie do naprężenia normalnego, które jest prostopadłe. Każdy płyn, który porusza się wzdłuż granicy, będzie wywierał naprężenie ścinające na tę granicę. Wykazano, że naprężenie ścinające jest istotnym składnikiem transmigracji limfocytów7. W tych warunkach każdy etap kaskady adhezyjnej może być uwidoczniony za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego. Metoda ta pozwoliła na uzyskanie ważnych informacji na temat rekrutacji leukocytów w wątrobie, w tym badania konwencjonalnych cząsteczek adhezyjnych8, roli chemokin i receptorów chemokiny9-11 oraz atypowych cząsteczek adhezyjnych, takich jak białko adhezji naczyniowej-1 (VAP-1)8,12 oraz powszechny receptor śródbłonka limfatycznego i naczyniowego-1 (CLEVER-1)13. Chociaż ten test został wspomniany w kilku publikacjach naszej grupy, jego opis był krótki i skorzystaliśmy z okazji, aby przedstawić szczegółowy przewodnik krok po kroku, aby pomóc w rozwiązywaniu problemów i zapobieganiu błędom technicznym podczas próby testu. Ponadto niedawno zmieniliśmy sposób pozyskiwania komór mikrosuwakowych, co pozwala na dokładne zmiany naprężeń ścinających. Uważamy, że rozszerza to zastosowanie testu do innych komórek śródbłonka i komórek odpornościowych. Poniższa metoda opisuje przygotowanie i technikę przeprowadzania testu adhezji opartej na przepływie z ludzkimi komórkami śródbłonka sinusoidalnego wątroby i limfocytami krwi obwodowej.
Protokół
1. Przygotowanie mikroszkiełek
- Wstępnie pokryj sześciokanałowe mikroszkiełko kolagenem typu I z ogona szczura (RTC, rozcieńczony w PBS 1:100, co daje robocze rozcieńczenie 220 μg/ml). Odbywa się to poprzez wstrzyknięcie 30 μl rozcieńczonego roztworu RTC bezpośrednio do kanałów i inkubację przez 2 godziny w temperaturze 37 °C, a następnie trzy przemycia PBS.
2. Umieszczanie komórek w mikroszkiełkach
- Dysocjować zlewającą się kolbę T75 z hodowanymi ludzkimi sinusoidalnymi komórkami śródbłonka wątroby (HSEC) (wyizolowanymi z tkanki wątroby, jak opisano wcześniej13) w trypsyno-EDTA, przemyć w PBS i ponownie zawiesić w 3 x 106 komórek/ml w kompletnych pożywkach (ludzkie śródbłonkowe podłoże podstawowe uzupełnione 2 mM L-glutaminą, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny, 10% inaktywowanej termicznie surowicy ludzkiej AB, 10 ng/ml czynnika wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych i 10 ng/ml czynnika wzrostu hepatocytów). Wstrzyknąć 30 μl zawiesiny komórkowej bezpośrednio do każdego kanału.
- Pozostawić komórki do przylegania przez 1 godzinę w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i atmosferze 5%CO2 na stojaku do szkiełkowania. Po umożliwieniu przylegania komórek napełnij porty po obu stronach każdego kanału kompletnym medium (rysunek 1).
3. Stymulacja komórek cytokinami
- Pozostaw komórki w inkubatorze na 24 godziny. Oceń wzrost komórek za pomocą mikroskopu kontrastowego z odwróconą fazą. 24 godziny przed testem adhezyjnym stymuluj monowarstwy śródbłonka cytokinami, zastępując pożywkę wzrostową kompletną pożywką uzupełnioną czynnikiem martwicy nowotworu alfa i interferonem gamma, oba w stężeniu 10 ng / ml.
4. Izolacja limfocytów krwi obwodowej
- Wyizolować limfocyty krwi obwodowej od krwi pełnej, wstępnie oczyszczając frakcję jednojądrzastą przez wirowanie w gradionym gradiacji gęstości na odpowiedniej pożywce wirówkowej do separacji komórek przez 25 minut przy 800 x g. Inkubować komórki na plastiku przez 1 godzinę, aby umożliwić przyleganie monocytów.
- Po przyleganiu do tworzywa sztucznego odessać supernatant wzbogacony w limfocyty. Umyć limfocyty i ponownie je zawiesić (zwykle 1 x 106 komórek/ml w pożywce przepływowej (śródbłonkowe podłoże podstawowe zawierające 0,1% (v/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA)).
5. Wstępne leczenie śródbłonka lub leukocytów za pomocą inhibitorów
- Przygotować zalecane rozcieńczenia przeciwciał blokujących działanie lub inhibitorów małocząsteczkowych w pożywkach śródbłonkowych/0,1% (v/v) BSA. Zastąp całe podłoże roztworem przeciwciała/inhibitora blokującego w wybranym kanale mikroszkiełka 30 minut przed testem przepływu.
- W przypadku gdy planowane jest wstępne leczenie receptorów chemokiny na limfocytach, należy ponownie zawiesić wyizolowane leukocyty w roztworze RPMI zawierającym 0,1% (v/v) BSA i inkubować z 200 ng/ml toksyny krztuścowej w celu zablokowania aktywności receptorów chemokiny sprzężonej z białkiem G; alternatywnie rozcieńczyć przeciwciała blokujące specyficzne funkcje lub małocząsteczkowe inhibitory receptorów chemokiny w zalecanym rozcieńczeniu. Inkubować leukocyty w temperaturze 37 °C przez 30 minut, a następnie przemyć i ponownie zawiesić w pożywce przepływowej.
6. Konfiguracja systemu oznaczania przepływu
- Podgrzej termostatycznie sterowaną przezroczystą komorę do 37 °C. Komora powinna być wyposażona w porty do wprowadzenia silikonowego rurki oraz elektroniczne zasilanie elektronicznego zaworu elektromagnetycznego, który umożliwia przełączanie między ogniwami i mediami praktycznie bez objętości martwej. Komora jest zamontowana na mikroskopie odwróconym, aby umożliwić mikroskopię z kontrastem fazowym. Rysunek 2 przedstawia komorę do oznaczania przepływu, mikroskop i mikroszkiełko umieszczone na stoliku mikroskopu.
- Napełnij szklaną strzykawkę o pojemności 50 ml z blokadą typu luer 10 ml sterylnej wody destylowanej i przymocuj silikonową rurkę o długości 25 cm do portu strzykawki. Włożyć do pompki strzykawkowej. Zmień szybkość pobierania pompy strzykawkowej zgodnie z instrukcjami producenta mikroszkiełka, aby utrzymać naprężenie ścinające 0,05 Pa (0,5 dyn/cm2, rysunek 3).
- Wziąć dwie strzykawki o pojemności 5 ml, wyrzucić tłoki i przymocować cylindry do dwóch portów dopływowych elektronicznego zaworu elektromagnetycznego za pomocą silikonowej rurki.
- Podłącz 12 cm silikonowej rurki do zaworu odpływowego. Zastawka umożliwia naprzemienne stosowanie bezkomórkowego buforu płuczącego (pożywka śródbłonkowa/0,1% (v/v) BSA) i zawiesiny limfocytów.
- Przepłukać elektroniczny zawór elektromagnetyczny, wkładając bufor do płukania w obu cylindrach strzykawki i upewniając się, że bufor przepływa z jednej beczki przez zawór do silikonowej rurki odpływowej.
- Użyj przełącznika zaworu, aby przełączyć się na drugą beczkę i upewnij się, że bufor płynie i że wszystkie pęcherzyki zostały usunięte z systemu. Usunąć bufor płuczący z jednej z luf i zastąpić zawiesiną limfocytów Rysunek 4a.
- Podłącz silikonową rurkę z pompy strzykawkowej do jednego portu wybranego kanału mikrosuwaka za pomocą adaptera microslide. Następnie podłącz silikonową rurkę od zaworu odpływowego do przeciwległego portu za pomocą adaptera mikrosuwakowego. Upewnij się, że silikonowe rurki i adaptery są wypełnione buforem do płukania przed podłączeniem, aby zapobiec przedostawaniu się pęcherzyków powietrza do systemu (Rysunek 4b).
- Po przymocowaniu do systemu przepływowego umieść mikroszkiełko na stoliku mikroskopu i przymocuj za pomocą klipsów lub taśmy, aby zapobiec przemieszczaniu się. Ustaw mikroskop na obiektyw 10X wraz z odpowiednim ustawieniem fazy. Upewnij się, że monowarstwa śródbłonka jest uwidoczniona i wyostrzona za pomocą soczewki ocznej. Upewnij się, że obrazy mogą być rejestrowane za pomocą kamery, która jest podłączona do mikroskopu, dzięki czemu obrazy mogą być przekazywane do monitora i rejestrowane.
7. Technika oznaczania przepływu i rejestracja adhezji do analizy
- Wykonać perfuzję warstwy śródbłonka za pomocą buforu do przemywania przez 2 minuty, rozpoczynając wyjmowanie pompy strzykawkowej w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń lub niezwiązanego przeciwciała blokującego, a następnie przełączyć zastawkę, aby umożliwić 5-minutowy bolus roztworu leukocytów przy stałym naprężeniu ścinającym ścianki 0,05 Pa.
- W ciągu ostatnich 2 minut bolusa leukocytów zapisz 10 losowych pól wzdłuż długości mikroszkiełka. Pozwala to na analizę offline zwijania/wiązania limfocytów na monowarstwie śródbłonka. Nagrywaj każde pole przez około 10 sekund przed przejściem do następnego i upewnij się, że zapisy są wykonywane w kierunku przeciwnym do kierunku przepływu, aby uniknąć nagrywania tej samej komórki toczącej się dwa razy w krótkim odstępie czasu.
- Po bolusie leukocytarnym należy nałożyć 5-minutowy bolus buforu do płukania, przywracając zawór do pozycji początkowej. Podczas ostatnich 2 minut tego bolusa należy przeprowadzić drugą fazę zapisu, wybierając co najmniej 10 losowo wybranych pól wzdłuż długości mikroszkiełka. Rejestruj każde pole przez około 5 sekund przed przejściem do następnego i upewnij się, że monowarstwa śródbłonka i przylegające leukocyty są wyraźnie ostre. Pozwala to na analizę wzoru przyczepności w trybie offline.
Wyniki
Ten test umożliwia wizualizację wieloetapowej kaskady adhezji przepływowej oraz wyjaśnienie podstawowych mechanizmów molekularnych poprzez porównanie wyników eksperymentów kontrolnych z wynikami uzyskanymi przy użyciu inhibitorów molekularnych. Różne łoża naczyniowe mogą zostać odwzorowane poprzez wprowadzenie specyficznych komórek śródbłonka i zmianę warunków naprężenia ścinającego.
Każdy etap kaskady adhezji można analizować w trybie offline, stosując metodę rejestracji opisaną w protokole. Pierwszym etapem kaskady adhezji jest toczenie się leukocytów, które można wyrazić jako procent całkowitej liczby komórek przylegających. Analiza offline pozwala na zliczenie liczby komórek przylegających w każdym zarejestrowanym polu podczas podania bolusa leukocytów. Odtwarzanie obrazu umożliwia porównanie komórek ściśle przylegających z tymi, które wykonują ruch toczenia po śródbłonku. Ruch toczenia można wizualizować za pomocą tej techniki; każde pole jest rejestrowane przez co najmniej 10 s. Komórki toczące się rozpoznaje po ich zmniejszonej prędkości nad powierzchnią śródbłonka w porównaniu z komórkami płynącymi. Zachowanie to musi być utrzymywane przez co najmniej 5 s bez odrywania się komórki. Kaskada adhezji w zatokach wątrobowych zachodzi w środowisku o niskim ścinaniu, a badania in vivo potwierdziły minimalne toczenie z jedynie krótkim etapem kotwiczenia. Potwierdziliśmy, że test przepływu odzwierciedla środowisko zatok wątrobowych, wykazując, że w tych testach mniej niż 10% przylegających leukocytów stale toczy się po stymulowanych HSEC.
Kolejnym etapem kaskady adhezji jest adhezja trwała. Całkowitą adhezję można obliczyć na podstawie drugiego etapu rejestracji podczas podania bolusa buforu piorącego (krok 7.3). Analiza offline pozwala na przeliczenie całkowitej liczby trwale przylegających komórek w każdym polu (Rycina 5). Komórki trwale przylegające definiuje się jako komórki stacjonarne lub takie, które zmieniły kształt i wykazują powolne zachowanie pełzające. Następnie można obliczyć średnią liczbę komórek na pole. Wartość tę można wykorzystać wraz z całkowitą powierzchnią pola widzenia (wyznaczoną za pomocą siatki pomiarowej lub odpowiedniego zamiennika), stężeniem limfocytów (zazwyczaj 1 x 106 komórek/ml) i szybkością przepływu, aby wyrazić stopień adhezji limfocytów jako liczbę komórek przylegających/mm2/106 komórek przepływowych.
Badanie wzorca adhezji obejmuje analizę dwóch ostatnich etapów kaskady adhezyjnej, w tym zmiany kształtu, pełzania oraz migracji transendotelialnej. Leukocyty przylegające do górnej powierzchni monowarstwy HSEC są jasne w kontraście fazowym, podczas gdy te, które migrowały przez monowarstwę, są ciemne (Rysunek 6). Komórki można następnie zaklasyfikować jako wykazujące adhezję „statyczną” (niemiegrujące/okrągłe), morfologię „zmienionego kształtu” lub jako „zmigrowane”, a poszczególne kategorie wyraża się następnie jako procent całkowitej populacji adhezyjnej.
Rysunek 1. Monowarstwa pierwotnych ludzkich śródbłonkowych komórek sinusoidalnych wątroby w komorze przepływowej. A) Mikroslajdy wypełnione medium zawierającym monowarstwę komórek śródbłonka przed rozpoczęciem testu adhezji w przepływie. B) Obraz w kontraście fazowym zlewnych monowarstw śródbłonka; komórki śródbłonka powinny być wysiane na mikroslajdy uprzednio powlekane (w przypadku ludzkich śródbłonkowych komórek wątrobowych powinno być to kolagenem typu 1 z ogona szczura); niezbędne jest, aby komórki śródbłonka w hodowli były zdrowe i zlewne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.
Rysunek 2. Komora do analiz przepływowych. Tutaj przedstawiono układ komory do analiz przepływowych; składa się ona z przezroczystej komory zamontowanej na mikroskopie odwróconym. W komorze znajduje się grzejnik, który powinien być sterowany termostatycznie w celu utrzymania temperatury 37 °C. Powinny być dostępne porty umożliwiające podłączenie rurek silikonowych z mikropreparatu wewnątrz komory do pompy strzykawkowej znajdującej się na zewnątrz. Mikropreparat jest umieszczony bezpośrednio na stole mikroskopu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.
Rysunek 3. Pompa strzykawkowa. Pompa strzykawkowa jest połączona za pomocą rurek silikonowych z komorą przepływową. Pompa jest ustawiona na określoną prędkość pobierania, zależną od pożądanego naprężenia ścinającego wymaganego dla analizy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.
Rysunek 4. Podłączenie zaworu do komory przepływowej. A) Elektroniczny zawór elektromagnetyczny umożliwia przełączanie między dwiema strzykawkami zawierającymi komórki lub medium, praktycznie bez martwej przestrzeni. B) Po przepłukaniu zaworu i przygotowaniu obu strzykawek, silikonowy przewód z zaworu zostaje podłączony do komory przepływowej. Kluczowe jest, aby podczas podłączania adaptera na silikonowym przewodzie do portu w komorze przepływowej istniał interfejs ciecz/ciecz. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.
Rycina 5. Pomiar całkowitej adhezji leukocytów. Podczas ostatnich dwóch minut etapu podawania bolusa buforu płuczącego (zgodnie z opisem w protokole) należy zarejestrować co najmniej dziesięć losowych pól. Można je analizować offline i policzyć całkowitą liczbę silnie przylegających komórek w każdym polu. Całkowitą adhezję leukocytów można porównać pomiędzy komorami kontrolnymi a tymi, które zostały poddane wstępnej obróbce przeciwciałami blokującymi; tutaj przedstawiono reprezentatywne pole z preparatu kontrolnego oraz z preparatu poddanego wstępnej obróbce przeciwciałem blokującym cząsteczkę adhezyjną ICAM-1. Strzałki dodano, aby wyróżnić przylegające leukocyty; w reprezentatywnym polu z preparatu kontrolnego zidentyfikowano łącznie 25 leukocytów, a w preparacie z blokadą ICAM-1 zidentyfikowano łącznie 13 leukocytów. Paski skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.
Rysunek 6. Analiza wzorca adhezji leukocytów do monowarstw śródbłonkowych przy użyciu mikroskopii kontrastowej. Analiza offline zarejestrowanych pól może być również wykorzystana do badania kierunku i prędkości adhezji leukocytów. Poszczególne etapy kaskady adhezji można wizualizować i kwantyfikować za pomocą obrazowania kontrastowego. Komórki jasne w kontraście, które są silnie przylegające, ale nieaktywowane, można określić jako adhezję „okrągłą”, komórki aktywowane i jasne w kontraście można określić jako „ze zmianą kształtu”, a komórki ciemne w kontraście to komórki, które przeszły migrację transendotelialną i mogą być określone jako „zmigrowane”. Obraz przedstawia przykłady każdego wzorca adhezji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.
Dyskusja
Najważniejszym krokiem do pomyślnego przeprowadzenia testu przepływu jest upewnienie się, że zdrowa i zlewająca się monowarstwa komórek śródbłonka jest gotowa przed testem adhezji przepływu. Pierwotne komórki śródbłonka mogą być trudne do hodowli i wrażliwe na zmiany w metodach hodowli. Ważne jest, aby: 1) komory przepływowe były odpowiednio i równomiernie pokryte komórkami śródbłonka w monowarstwie; w przypadku HSEC używamy kolagenu z ogona szczura typu I, ale może się to różnić w przypadku innych populacji śródbłonka, 2) pożywka hodowlana jest odpowiednia dla typu komórki, w przypadku HSEC opisaliśmy naszą pełną pożywkę w sekcji protokołu. Inne ważne kroki obejmują ustawienie pompy strzykawkowej na odpowiednią prędkość, aby odzwierciedlić fizjologiczny poziom naprężeń ścinających.
Podczas badania przepływu konieczne jest zapobieganie powstawaniu pęcherzyków powietrza w obwodzie przepływu, które mogą uszkodzić monowarstwę śródbłonka lub usunąć komórki odpornościowe z powierzchni śródbłonka. Można temu zapobiec, upewniając się, że wszystkie silikonowe rurki i adaptery są przetopione buforem myjącym przed podłączeniem, że wszystkie pęcherzyki powietrza są usuwane i że media są wstępnie podgrzane przed użyciem. Podczas podłączania adapterów do portów na mikroszkiełku bardzo ważne jest, aby podczas łączenia znajdował się interfejs ciecz/ciecz, jeśli jest powietrze, utworzy to szczelinę powietrzną w systemie, która zakłóci monowarstwę śródbłonka podczas etapu wyjmowania strzykawki. Roztwór leukocytów w cylindrze strzykawki wymaga regularnego mieszania, aby zapewnić, że komórki nie osiadają, utrzymując w ten sposób stałą gęstość komórek przez cały eksperyment.
Podczas etapów rejestracji ważne jest, aby upewnić się, że obraz warstwy śródbłonka jest odpowiednio ostry i wyraźny, aby umożliwić dokładną analizę offline, oraz że podczas drugiego etapu testu przepływu (bolus po leukocytach) pozostało wystarczająco dużo czasu podczas fazy buforowania płukania przed wznowieniem zapisu, aby upewnić się, że wszystkie nieprzylegające leukocyty zostały usunięte. Podobnie, ważne jest, aby używać komórek śródbłonka w monowarstwie o odpowiedniej gęstości, aby zapobiec utracie komórek, które mogą zakłócać wzorce przepływu w wąskich naczyniach włosowatych, a także mogą być trudne do odróżnienia od większych przylegających leukocytów pod mikroskopią kontrastu fazowego. Opisaliśmy optymalną gęstość wysiewu dla ludzkich komórek śródbłonka sinusoidalnego wątroby, ale może się ona różnić w zależności od różnych populacji śródbłonka i gatunków.
Poczyniono znaczne postępy w badaniu rekrutacji leukocytów w modelach zwierzęcych za pomocą mikroskopii przyżyciowej. Główną zaletą metody oznaczania adhezji przepływowej jest to, że rekrutację leukocytów można badać w układzie binarnym z pierwotnymi ludzkimi komórkami śródbłonka. Co więcej, interakcje te można badać przy fizjologicznie odpowiednich poziomach naprężeń ścinających. Ważne jest, aby potwierdzić wyniki badań przyżyciowych u zwierząt z ludzkim układem komórkowym, ponieważ mogą występować różnice we właściwościach śródbłonka między gatunkami. Jednym z ograniczeń testu przepływu jest to, że rekrutacja leukocytów jest badana w jednokomórkowym środowisku monowarstwy śródbłonka. Ponadto, gdy leukocyty przylgną i przejdą transmigrację przez śródbłonek, mogą nie być obecne w wystarczającej liczbie, aby można je było wyizolować i poddać dalszym procesom.
Pomimo tych ograniczeń, po opanowaniu testu adhezji przepływowej można go opracować w celu przeprowadzenia dalszej analizy kaskady adhezji leukocytów i dostosować do rekapitulacji środowiska wielokomórkowego. Przedłużone rejestrowanie pojedynczych pól i użycie oprogramowania śledzącego może być wykorzystane do analizy pełzania leukocytów. Ponadto, po zakończeniu testu przepływu, mikropreparaty mogą być badane za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej i znakowania immunofluorescencyjnego w celu bardziej szczegółowego zbadania adhezji i transmigracji. Dodatkowo wcześniej opracowaliśmy model in vitro , w którym przepływające leukocyty mogą wchodzić w interakcje ze śródbłonkiem wątroby uwarunkowane obecnością hepatocytów. Test ten można również opracować do badania subpopulacji leukocytów: nasza grupa przeprowadziła badania z podzbiorami, takimi jak limfocyty T regulatorowe, limfocyty B i leukocyty naciekające wątrobę.
Badania te są dowodem na to, że test adhezji przepływowej jest potężnym narzędziem do badania ogólnej i specyficznej dla narządu rekrutacji leukocytów w układach ludzkich.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych
Podziękowania
S.S. jest finansowany przez Wellcome Trust Intermediate Clinical Fellowship, C.W. przez Wellcome Trust Programme Grant.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sześciokanałowa mikroprowadnica VI 0,4 komora przepływowa | Ibidi | 80601 | Dostępne są inne rozmiary kanałów i wstępnie powlekane prowadnice w zależności od wymagań testu. |
| Adaptery przepływu mikroszkiełko VI 0,4 | Ibidi | 80646 | |
| Komora do badania przepływu | Solent Scientific | 33-3322 | Komory te są wykonywane na zamówienie przez firmę w oparciu o model mikroskopu i akcesoriów. |
| Mikroskop odwrócony IX2 | Olympus, Wielka Brytania | Model IX50 | |
| Pompa strzykawkowa Harvard | Apparatus, Wielka Brytania | 702101 | |
| Elektroniczny zawór elektromagnetyczny | Lee Products Limited, Wielka Brytania | Numer katalogowy LFYA1226032H | |
| Rurki silikonowe duże | Fisher Scientific | FB50855 | Średnica wewnętrzna 2 mm, średnica zewnętrzna 4 mm |
| Rurka silikonowa - mała | Fisher Naukowe | FB50853 | Średnica wewnętrzna 1 mm, średnica zewnętrzna 3 mm |
| Szklana strzykawka Harvard | Apparatus, Wielka Brytania | 55-0962 | |
| Pożywka do separacji komórek/Lympholyte | VH Bio | CL-5020 | |
| Kolagen ze szczurzego ogona | Sigma Aldrich | C3867-1VL |
Bibliografia
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Wong, J., et al. A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature. Clin. Invest. , 2782-2790 (1997).
- Braet, F., Wisse, E. Structural and functional aspects of liver sinusoidal endothelial cell fenestrae: a review. Compar. Hepatol. 1, 1 (2002).
- Lawrence, M. B., Springer, T. A. Leukocytes roll on a selectin at physiologic flow rates: distinction from and prerequisite for adhesion through integrins. Cell. 65, 859-873 (1991).
- Finger, E. B., et al. Adhesion through L-selectin requires a threshold hydrodynamic shear. Nature. 379, 266-269 (1996).
- Lawrence, M. B., Kansas, G. S., Kunkel, E. J., Ley, K. Threshold levels of fluid shear promote leukocyte adhesion through selectins (CD62L,P,E). J. Cell biol. 136, 717-727 (1997).
- Cinamon, G., Shinder, V., Alon, R. Shear forces promote lymphocyte migration across vascular endothelium bearing apical chemokines. Nat. Immunol. 2, 515-522 (2001).
- Lalor, P. F., et al. Vascular adhesion protein-1 mediates adhesion and transmigration of lymphocytes on human hepatic endothelial cells. J. Immunol. 169, 983-992 (2002).
- Aspinall, A. I., et al. CX(3)CR1 and vascular adhesion protein-1-dependent recruitment of CD16(+) monocytes across human liver sinusoidal endothelium. Hepatology. 51, 2030-2039 (2010).
- Curbishley, S. M., Eksteen, B., Gladue, R. P., Lalor, P., Adams, D. H. CXCR 3 activation promotes lymphocyte transendothelial migration across human hepatic endothelium under fluid flow. Am. J. Pathol. 167, 887-899 (2005).
- Oo, Y. H., et al. Distinct roles for CCR4 and CXCR3 in the recruitment and positioning of regulatory T cells in the inflamed human liver. J. Immunol. 184, 2886-2898 (2010).
- Weston, C. J., Shepherd, E. L., Adams, D. H. Cellular localization and trafficking of vascular adhesion protein-1 as revealed by an N-terminal GFP fusion protein. J. Neural Transm. , (2013).
- Shetty, S., et al. Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium. J. Immunol. 186, 4147-4155 (2011).
Przedruki i uprawnienia
