Izolacja nowotworowych komórek macierzystych z próbek ludzkiego raka prostaty

Podsumowanie

Izolacja nowotworowych komórek macierzystych (CSC) bezpośrednio z tkanek ludzkich jest niezbędna do ich biologicznej charakterystyki. Niniejszy manuskrypt opisuje metodologię izolacji CSC prostaty od tkanek ludzkich, a także zawiera wskazówki dotyczące rozwiązywania trudnych etapów.

Streszczenie

Model rakowych komórek macierzystych (CSC) został znacznie zmieniony w ciągu ostatnich dwóch dekad. W tym czasie CSC zostały zidentyfikowane i bezpośrednio wyizolowane z tkanek ludzkich i seryjnie rozmnażane u myszy z niedoborem odporności, zazwyczaj poprzez znakowanie przeciwciałami subpopulacji komórek i frakcjonowanie za pomocą cytometrii przepływowej. Jednak unikalne cechy kliniczne raka gruczołu krokowego znacznie ograniczyły badanie CSC prostaty ze świeżych próbek ludzkich guzów. Niedawno informowaliśmy o izolacji CSC prostaty bezpośrednio z tkanek ludzkich ze względu na ich fenotyp HLA klasy I (HLAI) ujemny. Komórki raka prostaty są pobierane z próbek chirurgicznych i mechanicznie dysocjowane. Zawiesina komórkowa jest generowana i znakowana fluorescencyjnie sprzężonym HLAI i przeciwciałami zrębowymi. Subpopulacje komórek HLAI-ujemnych są ostatecznie izolowane za pomocą cytometru przepływowego. Głównym ograniczeniem tego protokołu jest często mikroskopijny i wieloogniskowy charakter raka pierwotnego w próbkach prostatektomii. Niemniej jednak izolowane żywe CSC prostaty nadają się do charakterystyki molekularnej i walidacji funkcjonalnej przez przeszczep u myszy z niedoborem odporności.

Wprowadzenie

Niejednorodność wewnątrznowotworowa jest uważana za cechę charakterystyczną raka¹. Rzeczywiście, opisano kilka mechanizmów heterogeniczności wewnątrznowotworowej, w tym mutacje genetyczne i interakcje z mikrośrodowiskiem. Ponadto niektóre nowotwory mogą zawierać hierarchię komórkową z subpopulacją nowotworowych komórek macierzystych (CSC), która wykazuje właściwości zdolności inicjowania nowotworu i samoodnawiania się w testach przeszczepów^{seryjnych 2-5}. Początkowo opisane w nowotworach hematologicznych⁶, piersi⁷ i mózgu⁸, CSC były również badane w raku prostaty^9-12, a także innych typach nowotworów^2-5.

CSC są ogólnie uważane za frakcję komórkową w heterogenicznej populacji^2-5. W związku z tym charakterystyka funkcjonalna i molekularna CSC jest uzależniona od ich wzbogacenia z populacji masowych. W związku z tym w ciągu ostatnich dwóch dekad opracowano kilka metodologii wzbogacania CSC, które zazwyczaj obejmują rozdzielanie znakowanych populacji za pomocą cytometrii przepływowej. Ponadto istotną kwestią w badaniu CSC jest to, że hierarchiczna organizacja tkanek ludzkich może zostać zakłócona przez manipulacje eksperymentalne, takie jak seryjne pasażowanie w hodowli lub myszy z niedoborem odporności. W rezultacie, bezpośrednia izolacja CSC z tkanek ludzkich stała się ważną metodologią w dziedzinie CSC.

Rak prostaty jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności z powodu raka w Stanach Zjednoczonych i na całym świecie¹³. W związku z tym izolacja i biologiczna charakterystyka CSC prostaty jest bardzo interesująca. CSC prostaty zostały wcześniej wzbogacone z linii komórkowych, ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów i kultur zawiesinowych pochodzących od pacjentów o niskim pasażu^9,10,12,14.

Niedawno informowaliśmy o izolacji CSC prostaty bezpośrednio z ludzkich próbek chirurgicznych dzięki ich HLAI-ujemnemu fenotypowi^{powierzchni komórek 10}. Tutaj szczegółowo opisujemy procedury wdrożone w celu izolacji tych komórek. Guzy prostaty są pobierane z próbek chirurgicznych i przekształcane w zawiesiny komórkowe. Komórki są następnie barwione przy użyciu przeciwciał przeciwko HLAI oraz markerów zrębu i żywotności, a CSC są izolowane przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS). Wyizolowane CSC mogą być następnie wykorzystane do testów wymagających żywotnych komórek.

Protokół

1. Pobieranie i przetwarzanie tkanki ludzkiego raka prostaty z próbek chirurgicznych

1. Przygotować dwie stożkowe probówki polistyrenowe o pojemności 50 ml zawierające 15 ml pożywki hodowlanej Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 uzupełnionej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny.
2. Personel patomorfologii pobiera próbki pierwotnego i przerzutowego raka prostaty odpowiednio z próbek prostatektomii i chirurgii paliatywnej, zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną. Próbki przerzutowe można uzyskać m.in. z wycięć węzłów chłonnych podczas pierwotnej operacji, kręgów podczas paliatywnych zabiegów chirurgicznych, takich jak dekompresja rdzenia kręgowego, oraz płuc podczas diagnostycznego usuwania pojedynczych zmian przerzutowych.
   1. Nadmiar tkanki luzem, która nie jest potrzebna do diagnostyki klinicznej, należy pobrać do pierwszej probówki stożkowej z polistyrenu o pojemności 50 ml z kroku 1.1 i natychmiast przechowywać w temperaturze 4 °C. Pobrana tkanka powinna mieć co najmniej 4-5^cm2 powierzchni i 1-2 cm grubości.
3. Personel laboratoryjny przetwarza tkanki masowe pobrane ze służby patomorfologicznej w ramach przygotowania do badania histologicznego i wytwarzania zawiesin komórkowych.
   1. Przetwarzanie tkanek masowych nie powinno trwać dłużej niż 24 godziny od resekcji chirurgicznej, aby zagwarantować maksymalną żywotność komórek.
   2. Pracując w komorze bezpieczeństwa biologicznego ze sterylnym skalpelem i kleszczami, należy pobrać poziome odcinki tkanek o grubości 2-4 mm z makroskopowych guzków nowotworowych. Natychmiast umieść skrawki w drugiej stożkowej tubie polistyrenowej o pojemności 50 ml z kroku 1.1.
   3. Gdy guzki makroskopowe nie są uwidocznione z próbek prostatektomii, należy pobrać losowe poziome odcinki tkanek o grubości 2-4 mm z tylnych płatów i strefy przejściowej.
4. Oddziel część tkanki chirurgicznej za pomocą sterylnego skalpela i kleszczy i utrwal ją w 10% formalinie przed wytworzeniem zawiesin komórkowych. Zarchiwizuj i przeanalizuj ten materiał histologicznie, aby potwierdzić obecność tkanki raka prostaty.

2. Generowanie zawiesin komórkowych z odcinków tkanek

1. Pracując w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego, przenieś wycinek tkanki do naczynia hodowlanego o wymiarach 60 x 15 mm zawierającego 1 ml sterylnego soli fizjologicznej buforowanej 1x fosforanem (PBS).
   1. Próbkę należy mechanicznie rozcierać za pomocą sterylnego skalpela i kleszczy.
   2. W tym protokole nie ma trawienia enzymatycznego.
2. Przenieść 1 ml zawiesiny do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
   1. Dodać 1 ml do naczynia hodowlanego i powtarzać etap rozcierania, aż do całkowitego rozdzielenia części tkanki, zwykle 3-4 razy.
   2. Powtarzaj tę procedurę kolejno, aż wszystkie odcinki tkanek zostaną oddzielone.
3. Zawiesić zawartość probówki stożkowej z polistyrenu o pojemności 50 ml za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml i wirować z maksymalną prędkością (około 3 200 obr./min) przez 1 min.
4. Przefiltruj powstałą zawiesinę przez sitko do komórek o średnicy 35 μm i zbierz do drugiej sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml z polistyrenu.
5. Wytwarzać osad przez odwirowanie przy 450 x g przez 10 minut.
6. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad z 5 ml buforu do lizy czerwonych krwinek i inkubować roztwór przez 5 minut w temperaturze pokojowej krwinek. Usunąć bufor do lizy krwinek czerwonych przez odwirowanie przez odwirowanie przez 5 minut przy 450 x g w temperaturze pokojowej.
7. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad w 1x PBS uzupełnionym 5% FBS i określić ilościowo liczbę żywotnych (trypanowo-ujemnych) komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Wytworzyć zawiesinę 1x10⁶ komórek/ml i przechowywać ją na lodzie nie dłużej niż 1 godzinę.
   1. Żywotność i wydajność komórek może się znacznie różnić w zależności od próbki guza. W warunkach prostatektomii żywotność może wynosić od 45 do 70%, a pięć poziomych odcinków tkanek o grubości 2-4 mm z makroskopowego guzka guza może dać około 3x10⁶ żywotnych komórek.

3. Barwienie komórek przeciwciałami dla FACS

1. Oznacz pięć stożkowych probówek polistyrenowych o pojemności 15 ml, jak pokazano poniżej. Użyj znakowania antygenu CD45 i CD31, aby wykluczyć odpowiednio elementy hematopoetyczne i śródbłonkowe.
   1. Niepoplamione
   2. IgG_2aκ-PE + IgG₁κ-FITC
   3. HLAI-PE + IgG₁κ-FITC
   4. IgG_2aκ-PE + CD31-FITC + CD45-FITC
   5. HLAI-PE + CD45-FITC + CD31-FITC
2. Rozprowadzić ilościowo oznaczoną zawiesinę komórek z poprzedniej sekcji (krok 2.7) do pięciu probówek w kroku 3.1. Dodać przeciwciała w rozcieńczeniu 1:250 i inkubować zawiesiny komórkowe na lodzie przez 30 minut.
3. Odwirować komórki w temperaturze 450 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatanty.
4. Umyć komórki, ponownie zawieszając każdą granulkę sterylnym 1x PBS uzupełnionym 10% FBS, a następnie odwirować przy 450 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
5. Zawiesić komórki w 1 ml roztworze 1x PBS zawierającym 4',6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI) w stężeniu 10 μg/ml.
6. Przefiltruj końcowy roztwór przez nasadki sitka 35 μm do rurek polistyrenowych o wymiarach 12 mm x 75 mm.

4. Izolacja CSC prostaty przez FACS

1. Do sortowania komórek użyj cytometru przepływowego.
2. Ustaw kontrolki kompensacji za pomocą komórek z probówek #1, #2, #3 i #4.
3. Twórz bramki, które wykluczają zanieczyszczenia i skupiska komórek, korzystając z parametrów rozproszenia do przodu i z boku.
4. Ustaw bramki FITC i PE za pomocą zawieszeń odpowiednio z rury #3 i rury #4.
5. Bramka żywotnych komórek (DAPI-ujemnych) wykorzystujących pacyficzny kanał blue-A.
6. Za pomocą probówki #5 odrzuć komórki CD31-dodatnie i CD45-dodatnie i zbierz populacje HLAI-ujemne i HLAI-dodatnie do sterylnych 15-milimetrowych probówek stożkowych z polistyrenu zawierających 2 ml RPMI uzupełnionych 10% FBS.
7. Odwirować posortowane zawiesiny komórek przy 450 x g przez 5 minut, a następnie ponownie zawiesić granulki w 200-500 μl RPMI uzupełnionym 10% FBS.
8. Określ ilościowo żywotne (trypanowo-ujemne) komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.

Wyniki

Rysunek 1. Pobieranie guza raka prostaty człowieka i wykres cytometrii przepływowej ilustrujący specyficzne populacje komórek raka prostaty człowieka. (

Dyskusja

Protokół ten opisuje izolację CSC ze świeżych tkanek ludzkiego raka gruczołu krokowego. Na pomyślny wynik tego protokołu wpływa kilka ważnych czynników.

Odzyskanie dużej liczby żywotnych komórek raka prostaty zależy od dokładnej oceny próbek chirurgicznych. Z naszego doświadczenia wynika, że skuteczna izolacja rakotwórczych komórek gruczołu krokowego jest najbardziej pewna, gdy obserwuje się i przetwarza makroskopowe guzki nowotworowe¹⁰.

Jednak obecnie ch...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
RPMI	Gibco Life Technologies	11875-093
Surowica bydlęca	Gibco Life Technologies	10437-028
Penicylina Streptomycyna	Gibco Life Technologies	15140-122
PBS	Corning Cell Gro	21-031-CM
60 mm, 15 mm Naczynie do hodowli komórkowych	Corning	3295
35 & Mikro; m Sitko do komórek	BD Falcon	352340
50 ml probówka stożkowa	Crystalgen	23-2263
15 ml probówka stożkowa	Crystalgen	23-2265
Bufor lizujący czerwone krwinki	Sigma	R7757
HLA klasa I (W6/32) Przeciwciało PE	Abcam	ab43545
CD31 Przeciwciało FITC	eBioscience	11-0319-42
Przeciwciało CD45 FITC	Abcam	ab27287
IgG2aκ Przeciwciało PE	BD Pharminogen	555574
IgG1κ Przeciwciało FITC	BD Pharminogen	551954
DAPI	Invitrogen	d3571
12 mm x 75 mm Rurki polistyrenowe z nasadką sitową do komórek	BD Falcon	352235
Mieszalnik Vortex	Crystalgen	CG-BV1000
10% neutralny bufor formalina	Fisher	RBBP-0480

płodu