Obrazowanie deformacji błony plazmatycznej za pomocą pTIRFM

Podsumowanie

Mikroskopia fluorescencyjna z pełnym wewnętrznym odbiciem (pTIRFM) oparta na polaryzacji umożliwia wykrywanie dynamiki błony komórkowej w czasie rzeczywistym. W artykule opisano implementację pTIRFM do badania przebudowy błony podczas regulowanej egzocytozy. Technikę tę można uogólnić na inne procesy w biologii komórki, które bezpośrednio lub pośrednio wiążą się ze zmianami kształtu błony.

Streszczenie

Aby uzyskać nowe informacje na temat dynamiki egzocytozy, nasza grupa skupia się na zmianach w kształcie dwuwarstw lipidowych, które muszą być precyzyjnie regulowane podczas fuzji błon pęcherzykowych i plazmatycznych. Te szybkie i zlokalizowane zmiany osiąga się dzięki dynamicznym interakcjom między lipidami a wyspecjalizowanymi białkami, które kontrolują krzywiznę błony. Brak takich interakcji miałby nie tylko katastrofalne konsekwencje dla fuzji pęcherzyków, ale także dla wielu innych funkcji komórkowych, które obejmują kontrolę kształtu błony. W ostatnich latach ustalono tożsamość szeregu białek o właściwościach kształtowania błony. To, czego jeszcze brakuje, to mapa drogowa określająca, kiedy, gdzie i w jaki sposób będą działać wraz z postępem fuzji i wydawania zawartości.

Nasze zrozumienie zdarzeń molekularnych, które umożliwiają przebudowę błony, było historycznie ograniczone przez brak metod analitycznych, które byłyby wrażliwe na krzywiznę błony lub mają rozdzielczość czasową pozwalającą śledzić szybkie zmiany. PTIRFM spełnia oba te kryteria. Omówiliśmy, w jaki sposób pTIRFM jest wdrażany do wizualizacji i interpretacji szybkich, submikronowych zmian w orientacji błon komórkowych chromochłonnych podczas fuzji pęcherzyków gęstych (DCV). Stosowane przez nas komórki chromochłonne są izolowane z nadnerczy bydlęcych. Membrana jest barwiona lipofilowym barwnikiem karbocyjaninowym, 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenosulfonianem lub diD. DiD interkaluje w płaszczyźnie membrany o "ustalonej" orientacji i dlatego jest wrażliwy na polaryzację pola ulotnego. Błona komórkowa wybarwiona diD jest sekwencyjnie wzbudzana polaryzacją ortogonalną lasera o długości fali 561 nm (p-pol, s-pol). Laser o długości fali 488 nm służy do wizualizacji składników pęcherzyków i pomiaru czasu momentu fuzji. Egzocytoza jest wywoływana przez miejscową perfuzję komórek depolaryzującym roztworem KCl. Analiza jest wykonywana w trybie offline przy użyciu specjalnie napisanego oprogramowania, aby zrozumieć, w jaki sposób zmiany intensywności emisji diD odnoszą się do dylatacji porów fuzyjnych.

Wprowadzenie

Prawidłowe przeprowadzenie egzocytozy wymaga ekstremalnych zmian w kształcie dwuwarstwowej błony, które mają być precyzyjnie zaaranżowane. Przed fuzją następuje miejscowe wygięcie błony plazmatycznej pod granulką, częściowo w celu zmniejszenia bariery energetycznej dla interakcji dwuwarstw. Później, gdy membrany się łączą, generowane są obszary o dużej krzywiźnie, które muszą zostać ustabilizowane. Na koniec stopione membrany muszą zostać wygięte z ich pierwotnego kształtu, aby rozszerzyć pory fuzyjne i umożliwić uwolnienie zawartości¹. Ponieważ jest mało prawdopodobne, aby same błony ulegały tak dramatycznym i skoordynowanym zmianom, białka są niezbędne do pośredniczenia w zdarzeniach. Jednak to, w jaki sposób wpływają one na zmiany topologii błony podczas procesu fuzji, pozostaje w dużej mierze kwestią otwartą.

Istnieją doskonałe modele in vitro do wizualizacji krzywizny błony. Na przykład zastosowanie EM o ujemnym barwieniu było ważne dla kształtowania obecnych modeli molekularnych działania dwóch głównych białek transportowych - synaptotagminy i dynaminy (przeglądy, patrz Chapman² i Henshaw³). Większość testów egzocytozy w czasie rzeczywistym nie wykrywa bezpośrednio krzywizny. Zamiast tego krzywiznę wnioskuje się z testów, które informują o kinetyce uwalniania ładunku świetlnego^4-8 lub zmian w obszarze błony^9-11. PTIRFM wypełnia lukę między badaniami in vivo i in vitro, umożliwiając bezpośrednie pomiary zmian w mikromorfologii błon w czasie rzeczywistym.

PTIRFM, w trybie nieobrazowania, został zapoczątkowany przez Axelroda i współpracowników do pomiaru orientacji NPD-PE wbudowanego w modelową membranę¹². Technika ta została następnie zastosowana do wizualizacji dynamicznych zmian w żywych komórkach oznaczonych diI i FM1-43^13-18. W pTIRFM do sekwencyjnego wzbudzania sondy osadzonej w membranie stosuje się dwie polaryzacje pola ulotnego: polaryzacja p (w płaszczyźnie padania) i polaryzacja s (prostopadła do płaszczyzny padania). Przed obrazowaniem sonda - w tym przypadku diD - jest na krótko dodawana do podłoża zewnątrzkomórkowego i może interkalować w błonach plazmatycznych badanych komórek. W obszarach, w których membrana jest nierównoległa do szkła nakrywkowego (jak w przypadku falbowania lub wgłębienia membrany), diD również będzie nierównoległe. Dlatego takie obszary będą pobudzone przez wiązkę p-pol. Wiązka p-pol będzie mniej skutecznie wzbudzać diD w obszarach membrany, które są w większości równoległe do szkła nakrywkowego. Obrazy o stosunku pikseli do pikseli (P/S) informujące o emisji z sekwencyjnego wzbudzenia p- i s-pol diD będą zatem wyraźnie podkreślać obszary deformacji błony. Teoretycznie obrazy współczynnika P/S są wrażliwe nawet na niewielkie kąty odchylenia błony plazmatycznej od szkła nakrywkowego, przy amplitudzie zmian przewidywanej przez symulacje komputerowe¹⁸. Obrazy P/S są również niezależne od odległości fluoroforu od powierzchni szkła nakrywkowego i lokalnego stężenia fluoroforu. Lokalne stężenie fluoroforu jest natomiast dostarczane przez obrazy informujące o sumie emisji P między pikselami i 2-krotności emisji S (P+2S). Pomiar P+2S jest czuły na dokładną geometrię wgłębienia, z niewielką, niewielką lub żadną możliwą zmianą. Można to wykazać za pomocą symulacji komputerowych, które modelują przejścia poru fuzyjnego od stanu wczesnego (tj. z wąską szyjką) do późniejszego^16,18. Przewiduje się, że P+2S stopionego pęcherzyka przyczepionego do błony plazmatycznej za pomocą wąskiej szyjki (i z większą ilością diD blisko granicy) będzie na przykład większe niż w przypadku stopionego pęcherzyka ze znacznie szerszymi porami (gdzie diD znajduje się w najciemniejszej części pola ulotnego).

W tym artykule omawiamy, jak pTIRFM jest wdrażany i wykorzystywany do badania szybkich, miejscowych zmian w kształcie membrany, które zachodzą podczas rozszerzania porów fuzji. Chociaż tylko jedno zastosowanie jest wyraźnie omówione, metody można uogólnić na wiele innych procesów biologicznych komórek, które bezpośrednio lub pośrednio wiążą się z przebudową błony.

Protokół

1. Ustawienia systemu PTIRF

Technika pTIRFM zbudowana jest na platformie odwróconego mikroskopu. Wiązki laserowe są kierowane przez boczny port oświetleniowy i niepolaryzacyjną boczną kostkę filtrującą, a następnie skupiane są na tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu 60X 1,49 NA TIRF. Dwie dodatkowe soczewki (1,6X i 2X) w ścieżce emisji między mikroskopem a kamerą EMCCD dają końcowy rozmiar piksela około 80 nm. Wiązki laserowe są kierowane za pomocą sterowanych programowo luster galwanometrycznych do szybkiego przełączania między oświetleniem epi- i całkowitym odbiciem wewnętrznym (TIR). Opisany poniżej protokół zakłada, że optyka TIRF jest już umieszczona na stole powietrznym w optymalnych pozycjach do wzbudzenia fluoroforu i obrazowania. Opisano w nim, w jaki sposób optyka polaryzacyjna jest dodawana do istniejącego zestawu mikroskopu TIRF, aby umożliwić obrazowanie deformacji błony komórkowej. Schemat konfiguracji optycznej naszego laboratorium do generowania zarówno TIR, jak i TIR opartego na polaryzacji pokazano na rysunku 1A. Protokół zakłada użycie lasera o długości fali 488 nm do wzbudzania fluorescencyjnych białek pęcherzykowych oraz lasera o długości fali 561 nm do obrazowania barwnika karbocyjaninowego, diD.

1. Włącz wszystkie elementy mikroskopu, lasery i komputery.
2. Skieruj wiązkę z lasera o długości fali 488 nm na tylną płaszczyznę ogniskowej (BFP) soczewki 1.49 NA, jak pokazano na rysunku 1A. Jeśli wiązka laserowa zostanie skupiona na BFP, wyjdzie skolimowana i pojawi się jako mały, dobrze zdefiniowany punkt na suficie bezpośrednio nad obiektywem.
3. Wyreguluj lustro galwanometru X (lustro znajdujące się w równoważnej płaszczyźnie próbki) tak, aby wiązka lasera była przesuwana poza oś i wychodziła z obiektywu pod coraz bardziej stromymi kątami do normalnej obiektywu.
4. Następnie sprawdź, czy TIR został osiągnięty. Dodać 10 μl fluorescencyjnych mikrosfer do 1 ml objętości PSS w naczyniu ze szklanym dnem. Powinna być wykrywana tylko fluorescencja z mikrosfer znajdujących się na dnie naczynia, najbliżej granicy faz TIR. Wykrywanie unoszących się mikrosfer wskazuje, że kąt między padającym światłem a normalną obiektywu jest niewystarczający.
   
   Poniższa sekcja opisuje konfigurację komponentów optycznych niezbędnych do obrazowania opartego na polaryzacji.
5. Używając wyrównanej wiązki 488 nm jako przewodnika, dostosuj położenie surowej wiązki laserowej 561 nm tak, aby poruszała się po identycznej ścieżce optycznej. Laser o długości fali 561 nm będzie wykorzystywany do obrazowania barwnika karbocyjaninowego, diD.
6. Włóż soczewkę rozbieżną i lustra za laserem 561 nm. Za pomocą luster wyreguluj wiązkę tak, aby była wyrównana z wiązką 488 nm, a punkt był ostry na suficie, gdy lustra galwanometru znajdują się w pozycji "0".
7. Wyśrodkuj płytkę ćwierćfalową (QW) na ścieżce wiązki bezpośrednio za aperturą lasera. Użyj QW, który jest achromatyczny lub dostrojony do długości fali wzbudzenia. QW spolaryzuje kołowo każde spolaryzowane liniowo światło, które wpada pod kątem 45° z osią optyczną. Niektóre elementy optyczne, takie jak kostki polaryzacyjne, mają odchylenie tłumienia w kierunku jednej osi polaryzacji. QW można obrócić, aby skompensować to odchylenie. Ta regulacja spowoduje powstanie wiązki spolaryzowanej eliptycznie. QW jest konieczne, ponieważ sama wiązka laserowa jest wysoce spolaryzowana liniowo (pionowo), gdy wyłania się z apertury.
8. Umieść kostkę polaryzacyjną (PC1) za wiązką spolaryzowaną eliptycznie. Kostka polaryzacyjna odbija składową pionową (y) pola elektrycznego i przechodzi przez składową poziomą (x). Kostkę polaryzacyjną umieszcza się na małym stoliku translacyjnym, aby ułatwić późniejsze wyrównanie ścieżek wiązki polaryzacyjnej.
9. Użyj drugiego sześcianu polaryzacyjnego (PC2) i luster (Rysunek 1A), aby ponownie połączyć wiązki.
10. Umieść przesłonę między pierwszą kostką polaryzacyjną (PC1) a lustrem składowym pionowym. Umieść drugą przesłonę między zwierciadłem składowym poziomym a drugą kostką polaryzacyjną (PC2). Migawki te są sterowane przez oprogramowanie do obrazowania, które umożliwia użytkownikowi szybki wybór między polaryzacjami wiązki.
11. Użyj filtra polaryzacyjnego, aby sprawdzić orientację pola elektrycznego w każdej ścieżce wiązki. Filtr polaryzacyjny pozwoli na transmisję tylko w linii z osią filtra.
12. Sprawdź, czy pionowe i poziome składowe wiązki laserowej są wyrównane ze sobą i wiązką 488 nm. W razie potrzeby wprowadź poprawki. Wszystkie trzy wiązki powinny być skupione na BFP i wyłaniać się skolimowane od celu do tego samego miejsca na suficie. To miejsce można oznaczyć znakiem X, aby ułatwić przyszłe wyrównanie.
13. Umieść kroplę olejku immersyjnego na obiektywie. Umieść naczynie zawierające mikrosfery fluorescencyjne (patrz krok 4 powyżej) na obiektywie.
14. Wejdź do TIR, przesuwając lusterko galwanometru X. W TIR składową pionową belki jest teraz s-pol, a składową poziomą belki jest teraz p-pol. Dostosuj względną intensywność między belkami, obracając płytę QW. Wyświetl każde spolaryzowane ulotne pole z próbką rodaminy, która według prognoz jest zorientowana losowo. Obróć płytkę QW, aby dopasować ją do średniej intensywności pikseli. W razie potrzeby dodaj filtr o neutralnej gęstości w jednej spolaryzowanej ścieżce wiązki, aby złagodzić jego intensywność.

2. Izolacja komórek chromafinowych

Procedura izolowania zdrowych komórek chromochłonnych z nadnerczy cielęcia jest podana poniżej. Jest on adaptacją wcześniej opublikowanych protokołów przez Wicka, Sentera i wsp. ¹⁹ oraz O'Connor, Mahata i wsp. ²⁰ Po izolacji komórki są elektroporowane plazmidem (plazmidami) będącym przedmiotem zainteresowania przy użyciu systemu elektroporacji. W wyniku tego układu 20-30% komórek wykazuje ekspresję pożądanych białek fluorescencyjnych. Zazwyczaj 70% ogniw przeżywa proces elektroporacji. Szczegółowe informacje na temat komponentów PSS i nośników znajdują się w tabelach 2, 3 i 4.

1. Dwa dni przed przygotowaniem komórek potraktuj naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm (0,17 mm grubości) 1 ml poli-D-lizyny (0,1 mg / ml), a następnie 1,25 ml kolagenu bydlęcego. Pozostaw naczynia do wyschnięcia na powietrzu w kapturze do hodowli tkankowych.
2. Pozyskać nadnercza bydlęce z rzeźni. Utrzymuj gruczoły na lodzie podczas transportu z powrotem do laboratorium. Nadnercza bydła mogą być pokryte grubą warstwą tłuszczu. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby usunąć nadmiar tłuszczu i odsłonić otwór żyły nadnerczy. Kilkakrotnie wykonuj perfuzję żyły za pomocą prep-PSS, aż gruczoł zostanie oczyszczony z krwi.
3. Następnie powoli odpipetuj pipetą 2 ml roztworu TH-PSS do otworu żylnego, aż gruczoł stanie się puchnięty. Inkubować napompowane gruczoły w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Powtórzyć zabieg TH-PSS i ponownie inkubować.
4. Przetnij nożyczkami zewnętrzną korę nadnerczy wokół krawędzi gruczołu i oderwij gruczoł, aby odsłonić rdzeń. Użyj skalpela, aby delikatnie zeskrobać i oddzielić rdzeń od tkanki korowej.
5. Miel rdzeń za pomocą ostrzy skalpela przez 5-10 minut.
6. Ostatni etap trawienia jest niezbędny do wyizolowania poszczególnych komórek chromochłonnych. Wlać zawiesinę z komórek mielonych do kolby wirowej. Częściowo napełnić kolbę w stosunku 2:1 TH-PSS (30 ml) do TL-PSS (15 ml) i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C, wirując z prędkością około 100 obr./min.
7. Oddziel poszczególne komórki chromochłonne od niestrawionej tkanki, filtrując przez siatkę 400 μm. Zebrać filtrat. Odwirować przy 200 x g, aby zagnieździć komórki, a następnie ponownie zawiesić w lodowatym PSS.
8. Przefiltruj ogniwa przez siatkę 250 μm, osad i na koniec ponownie zawieś w buforze elektroporacyjnym (patrz krok 2.9).
9. Policz komórki za pomocą hemocytometru i przygotuj się do transfekcji.
10. Ogniwa transfekcyjne z systemem elektroporacji zgodnie z zaleceniami producenta. Dokładne warunki elektroporacji muszą być określone empirycznie. Uwaga: Ustawienia, które zapewniają najlepszą równowagę między wydajnością transfekcji a wskaźnikiem przeżycia komórek dla tego preparatu bydlęcych komórek chromochłonnych, to 1,100 V, 40 ms i 1 impuls. Szacujemy, że w tych warunkach 20-30% komórek ulega transfekcji. Około 30% ogniw nie przeżywa procesu elektroporacji.
11. Delikatnie ułóż komórki na naczyniach poddanych działaniu poli-D-lizyny i kolagenu w 1 ml podgrzanego podłoża elektroporacyjnego.
12. Umieść naczynia w inkubatorze o temperaturze 37 °C (5% CO₂ ). Dodaj 1 ml 2x pożywki antybiotykowej do każdego naczynia po 6 godzinach. Następnego dnia zmień nośnik na normalny.
13. Ogniwa chromochłonne są zwykle obrazowane 2-5 dni po elektroporacji.

3. Akwizycja obrazu pTIRF

1. Włącz system obrazowania i uruchom oprogramowanie do akwizycji.
2. Sprawdź, czy lasery są wyrównane. Sprawdź profil pola ulotnego za pomocą mikrosfer.
3. Przygotuj globalny i lokalny system perfuzji. Oczyść zbiorniki roztworu przefiltrowanym dejonizowanym_H2Oi napełnij podstawowymi i stymulującymi roztworami PSS.
4. Przed obrazowaniem komórek chromochłonnych sprawdź, czy wzbudzenia p-pol i s-pol oświetlają ten sam obszar pola widzenia i czy intensywności oświetlenia są w przybliżeniu równoważne. Aby to zrobić, napełnij naczynie ze szklanym dnem 2 ml PSS zawierającego rodaminę o końcowym stężeniu 10 mM. Sekwencyjnie wzbudzić próbkę rodaminy światłem p-pol i s-pol i uchwycić obrazy. W praktyce emisje P i S z diD są znormalizowane do średniej emisji rodaminy P i S. Więcej informacji można znaleźć w sekcjach Analiza obrazu i Dyskusja.
5. Teraz przystąp do barwienia bydlęcych komórek chromochłonnych za pomocą diD. Wypłukać pożywkę hodowlaną z naczynia zawierającego komórki chromochłonne i zastąpić 2 ml basel-PSS. Dodać 10 μl 10 mM diD (rozcieńczonego w etanolu) bezpośrednio do naczynia zawierającego komórki. Delikatnie mieszaj naczynie przez 2-10 sekund i usuń roztwór diD + PSS.
6. Umyj naczynie 3-4 razy za pomocą basal-PSS, aby usunąć wszelkie pozostałości diD. Komórki są teraz wybarwione i gotowe do użycia.
7. Dodaj kroplę olejku immersyjnego do obiektywu. Umieść naczynie zawierające komórki chromochłonne barwione diD na wierzchu obiektywu.
8. Oglądając naczynie przez obiektyw lub na kamerze, znajdź komórkę, która jest transfekowana interesującym białkiem i wybarwiona diD. Dobrze wybarwiona komórka wykazuje emisję P, która wyraźnie podkreśla krawędzie komórki; emisja S powinna być w przybliżeniu jednolita w całym śladzie ogniwa (tj. w obszarze ogniwa, który jest przyklejony do szkła i zobrazowany w TIRF).
9. Umieść igłę do perfuzji miejscowej tak, aby znajdowała się w odległości około 100 μm od komórki.
10. Skoncentruj się na błonie komórkowej i aktywuj sprzęt autofokusa bezpośrednio przed stymulacją komórki/akwizycją obrazu.
11. Rozpocznij akwizycję obrazu. Perfuzjować komórki przez 10 sekund roztworem podstawowym, a następnie przez 60 sekund depolaryzującym roztworem KCl o stężeniu 56 mM. Rejestruj obrazy podczas szybkiego zamykania migawki między 561 nm p-pol, 561 nm s-pol (w celu monitorowania zmian emisji P i S diD) a wzbudzeniem 488 nm (w celu zobrazowania transfekowanej sondy pęcherzykowej). Przykłady obrazów uzyskanych podczas eksperymentów pokazano na rys. 2 i ryc. 3.

4. Analiza obrazu

Obliczenia do przetwarzania obrazów mogą być wykonywane za pomocą ImageJ, ale użycie skryptów w elastycznym języku programowania, takim jak IDL lub Matlab, może znacznie zwiększyć wydajność analizy poprzez automatyzację zadania. Aby uzyskać informacje topologiczne z surowych obrazów emisji, należy obliczyć dwa typy obrazów - P/S i P+2S. P/S informuje o lokalnych deformacjach membrany, podczas gdy suma P+2S informuje o całkowitym barwniku membranowym w danym regionie pola.

1. Wszystkie obrazy powinny być odjęte tło. Wybierz ROI poza komórką, zmierz średnią intensywność pikseli w ROI, a następnie odejmij tę wartość od wszystkich pikseli w stosie obrazów.
2. Aby obliczyć współczynnik P/S, podziel każdą ramkę emisji "P" przez kolejną ramkę emisji "S" (piksel-piksel). P/S zmienia się wraz ze względną intensywnością wzbudzeń p- i s-pol, odchyleniami w układzie optycznym i prążkami interferencyjnymi. Aby zmniejszyć te efekty, należy znormalizować współczynniki P/S z uzyskanych z emisji diD do stosunku uzyskanego roztworem zawierającym 10 mM rodaminy¹⁸.
3. Egzocytoza poszczególnych DCV jest widoczna w wyniku nagłej zmiany intensywności białka pęcherzyka fluorescencyjnego, takiego jak pHluorin Synaptotagmin-1 (Figura 2B). Określ zmiany w P/S i P+2S, uśredniając piksele w promieniu 240 nm ROI wyśrodkowane nad zlokalizowanymi wzrostami stosunku P/S w miejscach egzocytozy. Gdy fuzja zachodzi bez widocznego wzrostu P/S, ROI jest wyśrodkowany w regionie fuzji DCV.
4. Symulacje komputerowe mogą być wykonywane w celu interpretacji zmian intensywności membrany P/S i P+2S pod względem prostych geometrii rozszerzających się porów fuzyjnych. Szczegółowe informacje na temat symulacji można znaleźć w Anantharam et al. ^{Rozdział 18}

Wyniki

Konwencjonalne i spolaryzowane techniki obrazowania TIRFM są implementowane na tym samym stole powietrznym. Konfiguracja elementów optycznych jest podobna, z tą różnicą, że światło wzbudzenia jest spolaryzowane (rysunek 1A). Światło spolaryzowane preferencyjnie wzbudza fluorofory z dipolami absorpcyjnymi w kierunku polaryzacji. Tak więc, aby pTIRFM był skuteczny w monitorowaniu zmian topologicznych membrany, używana sonda musi interkalować w membranie o ustalonej orientacji. Fluorescencyjne barwniki karbocyjaninowe (diI, diD) interkalują w dwuwarstwy lipidowe w sposób zorientowany z dipolami przejściowymi w płaszczyźnie błony (ryc. 1B). Oświetlenie o polaryzacji P (ryc. 1C) membran znakowanych diD selektywnie wzbudza fluorofory nakrywkowo-ukośne (CZERWONY na rysunkach 1B i 1D).

Żywiołowe znakowanie błonowe komórek chromochłonnych osiąga się po krótkiej inkubacji z diD. Rysunek 2A przedstawia przykład błony komórkowej, która jest dobrze wybarwiona. Zdrowa, przylegająca komórka będzie wykazywać wyraźne różnice w emisjach P i S. Obraz emisji P pokazuje jaśniejszą granicę komórki w stosunku do reszty komórki. Obraz emisji S pokazuje mniej więcej jednolitą fluorescencję na całym śladzie komórki. Obliczone obrazy P/S i P+2S piksel-piksel są wrażliwe odpowiednio na krzywiznę membrany i stężenie barwnika. Pokazana komórka chromochłonna została również transfekowana pHluoryną Synaptotagmin-1 (Syt-1) w celu oznakowania pęcherzyków wydzielniczych (Figura 2B).

Komórka chromochłonna jest stymulowana przez 56 mM KCl w celu depolaryzacji błony komórkowej i wywołania egzocytozy. Szereg jaskrawo fluorescencyjnych plamek pHluorin Syt-1 nagle staje się widocznych, gdy DCV łączą się (Rysunek 2B, prawy panel). Wokół jednego ze zdarzeń fuzji narysowana jest biała ramka (Rysunek 2B, prawy panel). To zdarzenie fuzji jest analizowane na rysunkach 2C i 2D. Rysunek 2C przedstawia zmiany intensywności obrazu Syt-1-pHluorin, P/S i P+2S klatka po klatce. Intensywność fluorescencji Syt-1 szybko maleje, gdy białko dyfunduje z miejsca fuzji (ryc. 2D). Wgłębienie reprezentujące zrośnięty kompleks pęcherzyk/błona plazmatyczna zmniejsza się w stosunkowo wolniejszym tempie (zwróć uwagę na wykresy na rysunku 2D). Ilustracja (Rysunek 2E) przedstawia jedną z interpretacji tych pomiarów.

Szybkie i zlokalizowane deformacje błony pokazane na rysunku 2 są wynikiem wywołanego bodźcem napływu Ca²⁺. Jest to pokazane na rysunku 3A. Komórka chromochłonna jest transfekowana genetycznym wskaźnikiem Ca^{2 +} GCaMP5G^21,22 i stymulowana 56 mM KCl. Depolaryzacja błony powoduje znaczny wzrost fluorescencji GCaMP5G (ryc. 3A i 3B), co oznacza wzrost subplazmalemmalnych poziomów Ca^{2 +}. Zaznaczony jest obszar komórki o wymiarach 30 x 20 pikseli, a zmiany intensywności pikseli GCaMP5G, P/S i P+2S klatka po klatce są pokazane na obrazach (Rysunek 3B) i wykresach (Rysunek 3C). Czas "0" oznacza klatkę przed zmianą, w której widoczny jest P/S (tj. klatka przed egzocytozą). Białe groty strzałek wskazują, że deformacji membrany (wzrostowi P/S) towarzyszy spadek emisji P+2S. Cytozolowe białko GCaMP5G jest wykluczane z obszaru przez skondensowany DCV. Zwróć również uwagę na nagły spadek intensywności GCaMP5G w czasie 0 na rysunku 3C, lewy panel. Długotrwały wzrost P/S i spadek P+2S sugeruje pory fuzyjne, które rozszerzają się powoli (ryc. 3D).

Rysunek 1. Ilustracje do techniki pTIRFM. A) Przedstawiono schemat łączenia obrazowania konwencjonalnego z obrazowaniem TIRF opartym na polaryzacji. Płytka ćwierćfalowa (QW) jest umieszczona przed laserem szafirowym o długości fali 561 nm, aby eliptycznie spolaryzować wiązkę laserową. Sześcian polaryzacyjny (PC1) służy do rozdzielania polaryzacji na liniowe składowe pionowe (v) i poziome (h). Składowe pionowe i poziome stają się odpowiednio belkami wzbudzenia p-pol i s-pol na powierzchni TIR. Tory p-pol i s-pol są niezależnie przesłonięte (S1 i S2). Są one rekombinowane ze zwierciadłami i drugą kostką polaryzacyjną (PC2). Łączą się one z wiązką o długości fali 488 nm (również z niezależnym przesłonięciem, S3) za pośrednictwem elementu sterującego wiązką składającą się z lustra i niepolaryzacyjnego zwierciadła dichroicznego (DC). Soczewki (L) służą do rozszerzania i skupiania wiązek. Połączone wiązki 488 nm i 561 nm są kierowane do bocznego portu oświetleniowego mikroskopu za pomocą zwierciadeł galwanometrycznych (GM). Skupiają się na tylnej płaszczyźnie ogniskowej (BFP) obiektywu. Fotony emitowane przez fluorofory są rejestrowane za pomocą kamery EMCCD podłączonej do komputera. ZA)Znakowanie DiD odbywa się poprzez krótką inkubację komórek z barwnikiem i wielokrotne mycie w celu usunięcia nadmiaru. DiD interkaluje się w membranie ze swoimi przejściowymi momentami dipolowymi mniej więcej w płaszczyźnie membrany. C)Światło padające spolaryzowane w płaszczyźnie padania (p-pol) tworzy ulotne pole, które jest w przeważającej mierze spolaryzowane normalnie do interfejsu, jak pokazano. d)Oświetlenie membrany znakowanej diD światłem spolaryzowanym p selektywnie wzbudzi te fluorofory, które są ukośne (RED). Gdyby było to pole ulotne spolaryzowane s, te fluorofory, które są równoległe do szkła nakrywkowego, byłyby wzbudzone (CZARNE).

Rysunek 2. Monitorowanie deformacji błony komórkowej za pomocą pTIRFM. A) Pokazane są surowe obrazy emisji P i S wraz z obliczonymi obrazami emisji P/S i P+2S. Pasek skali, 3,2 μm. B) Komórka chromochłonna eksprymująca pHluorynę Syt-1 jest depolaryzowana za pomocą KCl. Szereg jasno fluorescencyjnych plam (prawy panel) wskazuje na fuzję poszczególnych DCV. Pasek skali, 3,2 μm. C) Obrazy klatka po klatce fuzji Syt-1 pHluorin DCV. Czasy (powyższe obrazy) podane są w sekundach. Czas 0 oznacza klatkę przed fuzją DCV. Pokazane są również odpowiednie obrazy emisji P/S i P+2S. Podziałka liniowa wynosi 1 μm. D) Wykresy dla obrazów w C. Linia przerywana to czas 0 - ramka fuzji. E)Pokazano jedną z możliwych interpretacji wyników w C i D. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Deformacje są wynikiem wywołanego bodźcem napływu^Ca2+. A) Komórka chromochłonna transfekowana GCaMP5G jest depolaryzowana za pomocą 56 mM KCl. Wynikający z tego wzrost fluorescencji GCaMP5G oznacza wzrost subplazmalemmalnego poziomu Ca²⁺. ZA)Obrazy klatka po klatce obszaru komórki o wymiarach 30 x 20 pikseli w A. Czasy nad obrazami są podane w sekundach. Białe groty strzałek wskazują obszar wzrostu P/S i spadku P+2S. Cytozolowe białko GCaMP5G jest wykluczane z regionu przez łączący DCV. Podziałka skali, 1 μm. C) Wykresy dla obrazów pokazanych w B. D) Pokazano jedną z możliwych interpretacji wyników w B i C. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

SZT. szt. powiedział: powiedział: powiedział:

Kamera iXon3 EMMCD	Andor	897
Mikroskop odwrócony IX81	Olympus		Montaż boczny zespołu Filtercube
Laser Ar-Ion serii 43	Optyka laserowa CVI Milles Griot	543-AP-A01	Regulowany do 488 nm
Laser diodowy Sapphire 561 LP	Spójne		561 nm
Skanowanie systemu luster Galvo	Tholabs powiedział:	Zobacz materiał GVS102
VC 3-kanałowy system perfuzji ogniskowej	Instrumenty naukowe ALA	ALA VC3X4PP
QMM Kwarcowy mikrokolektor	Instrumenty naukowe ALA	ALA QMM-4
Regulator ciśnienia 10 psi	Instrumenty naukowe ALA	ALA PR10
Manipulator	Burleigh	TS 5000-150
Zamontowana achromatyczna płyta ćwierćfalowa	Tholabs powiedział:	AQWP05M-600
420-680 nm Polaryzacyjny sześcian rozdzielacza wiązki	Tholabs powiedział:	Odbiornik PBS201
Sześciopozycyjne koło o neutralnej gęstości	Tholabs powiedział:	FW1ORAZ
SmartShutter napędzany silnikiem krokowym	Instrumenty Sutter	IQ25-1219
Filtr dichroiczny HQ412lp	Chroma	NC255583	Łączy wiązki 488 nm i 561 nm
Powlekana soczewka płasko-wklęsła	Edmund Optyka	PCV 100mm VIS 0	Rozchodzi wiązka 488 nm
Powlekana soczewka płasko-wklęsła	Edmund Optyka	PCV 250mm VIS 0	Rozchodzi wiązka 561 nm
Powlekana soczewka płasko-wypukła	Edmund Optyka	PCX 125mm VIS 0	Skupia obie wiązki
Powlekana soczewka płasko-wypukła	Edmund Optyka	PCX 50mm VIS 0	Cementowany do zespołu kostki filtracyjnej
z488/561rpc dichroiczny	Chroma	Z488/561RPC	Filtercube dichroiczny
Filtr spalin z488/561_TIRF	Chroma	z488/561m_TIRF	Emisja Filtercube
Obiektyw UIS2 60X	Olympus	UPLSAPO 60XO	NA 1.37
System transfekcji neonów	Invitrogen	Zobacz materiał MPK 5000
Oprogramowanie do obrazowania MetaMorph	Urządzenia molekularne
Barwnik membranowy DiI	Invitrogen	V-22885	Do celów wyrównania
TH Liberase	Roche	5401135001
TL Liberse	Roche	5401020001
DNAza I typu IV od bydła	Sigma	Zobacz materiał D5025
Hemocytometr	rybak	0267110
Barwnik membranowy DiD	Invitrogen	D-7757
Rodamina	Invitrogen	Czynnik R634
Membranowy filtr strzykawkowy 0,22 μm	Milipory	SLGS033SS
Fluoresbrite Polichromatyczne czerwone mikrosfery	Nauki polilogiczne	Rok 19507	0,5 μm
Olejek immersyjny	Sigma	Numer katalogowy: 56822
Widok LabVIEW	Instrumenty krajowe		Steruje lustrami galvo
Kolba obrotowa	Bellco powiedział:	1965-00250

Tabela 1. Sprzęt do mikroskopii pTIRF.

treść	Przygotowanie PSS	Podstawowy-PSS	Stim-PSS
Zawartość NaCl	145 mM	145 mM	95 mM
Kcl	5,6 mM	5,6 mM	56 mM
MgCl2	-	0,5 mM	0,5 mM
CaCl2	-	2,2 mln	5 mM
HEPESY	15 mM	15 mM	15 mM
ph	7,4	7,4	7,4
glukoza	2,8 mM	5,6 mM	5,6 mM
Pióro-paciorkowiec	1x	-	-

Tabela 2. Roztwory do przygotowania komórek perfuzyjnych i chromochłonnych.

treść	Media do elektroporowania	Normalne media galwaniczne	2x Pożywka z antybiotykiem
1x DMEM/F-12	1 ml/talerz	2 ml/talerz	1 ml/talerz
FBS (Sieć Usługowa	10%	10%	10%
Arabinofuranozyd cytozyny (CAF)	-	1 μl/ml z 10 mM Zapas	-
penicylina	-	100 jednostek/ml	200 jednostek/ml
Streptomycyny	-	100 μg/ml	200 μg/ml
Gentamycyna	-	25 μg/ml	50 μg/ml

Tabela 3. Pożywki komórkowe Chromaffin.

treść	TH-PSS	TL-PSS
Liberase TH	Pojemność 2 ml	-
Liberase TL	-	Pojemność 0,85 ml
Przygotowanie PSS	98,0 ml	Pojemność 84,0 ml
Strefa DNaza	8,75 mg tabletki powlekania	7,4 mg tabletki powlekania

Tabela 4. Rozwiązania TH-PSS i TL-PSS.

Dyskusja

Oparty na polaryzacji TIRFM wykrywa szybkie, submikroskopijne zmiany w topologii membrany. Wdrożenie tej techniki jest stosunkowo proste, zwłaszcza jeśli optyka TIRF jest już na miejscu. Wystarczy płyta ćwierćfalowa, dwie kostki polaryzacyjne oraz przesłony do wydzielenia torów świetlnych p-pol i s-pol. Dokładne położenie tych komponentów na stole jest zwykle podyktowane dostępną przestrzenią.

W celu uzyskania informacji topologicznych membrany, zastosowana sonda fluorescencyjna powinna interkalować ze stałą lub znaną orientacją. Technika, opisana w tym artykule, zakłada użycie barwników karbocyjaninowych, ale można również stosować inne barwniki, takie jak FM1-43¹⁴. Sama procedura barwienia membrany jest prosta. Hodowane komórki wymagają jedynie bardzo krótkiej ekspozycji (mniej niż 10 sekund) na niewielką ilość diI/diD, aby uzyskać bujne znakowanie błony. Dodanie nadmiaru barwnika prowadzi do rozpraszania światła na szkle, co pogarsza jakość obrazu. Nadmierna inkubacja komórek z barwnikiem prowadzi do internalizacji barwnika, co ma szkodliwy wpływ na jakość obrazu i prawdopodobnie żywotność komórek. Jeśli komórka jest dobrze zabarwiona, na obrazach emisyjnych P i S będzie wyraźne rozróżnienie. Jak pokazano na rysunku 2A, emisja P będzie wyraźnie podkreślać obszary błony, które są ukośne szkiełkiem nakrywkowym (tj. krawędzie śladu komórki), podczas gdy intensywność emisji S będzie w przybliżeniu jednolita na powierzchni komórki. Jeśli wyraźne rozróżnienie między P i S nie jest widoczne, możliwe, że komórka jest słabo przylegająca do substratu lub błona komórkowa nie jest zdrowa i komórka nie jest używana do eksperymentów.

Nasze poprzednie badania opisujące pTIRFM wykorzystywały diI jako fluorescencyjną sondę membranową. W tym przypadku używamy diD, ponieważ nadaje się do eksperymentów obrazowania dwukolorowego, w których wykorzystuje się GFP / pHluorin jako drugi fluorofor. Wzbudzamy diD laserem o długości fali 561 nm, a nie laserem o długości fali 640 nm (który jest bliższy szczytowi wzbudzenia), ponieważ fluorofor blednie szybciej przy długości fali 640 nm. Pomimo tego, że laser o długości fali 561 nm znajduje się na końcu opublikowanego przez diD widma wzbudzenia, fluorescencja jest skutecznie emitowana. Kolejną zaletą lasera 561 nm jest to, że wzbudza on zarówno diI, jak i diD, co pozwala nam na użycie tej samej konfiguracji polaryzacji dla obu sond. Należy pamiętać, że orientacja fluoroforu w membranie będzie miała wpływ na interpretację topologii membrany. Na przykład, jeśli fluorofor byłby zorientowany tak, aby jego dipole przejściowe były prostopadłe do płaszczyzny błony (a nie równolegle lub prawie równolegle, jak ma to miejsce w przypadku diI lub diD), wówczas niepłaskie obszary błony będą łatwiej uwydatnione przez emisję S niż P.

Opisaliśmy również techniki izolacji i elektroporacji komórek chromochłonnych nadnerczy bydlęcych. Komórka chromafinowa bydlęca jest doskonałym modelem wydzielniczym. Ma tę zaletę, że jest łatwy do utrzymania w hodowli, reaguje na różne sekretogogi i posiada duże pęcherzyki wydzielnicze, które można łatwo uwidocznić za pomocą konwencjonalnej mikroskopii świetlnej. Aby uzyskać ekspresję białek fluorescencyjnych, komórki są elektroporowane w zawiesinie przed posiewem na szalkach hodowlanych traktowanych kolagenem. Z naszego doświadczenia wynika, że skuteczność wyrażania jest znacznie wyższa w przypadku elektroporacji niż w przypadku odczynników Ca²+-fosforanu lub lipofeektaminy. Wadą elektroporacji jest to, że wymaga większej liczby ogniw (ponieważ wiele z nich nie przeżywa tego procesu) i drogich komercyjnych odczynników. Z niejasnych dla nas powodów nie każda membrana zawiera diD. Ponadto tylko część komórek na naczyniu jest transfekowana. Znalezienie komórek, które są transfekowane ORAZ są dobrze wybarwione diD, może być czasochłonne, dlatego optymalizacja warunków barwienia i elektroporacji jest warta wysiłku.

Podsumowując, w tym artykule opisano, w jaki sposób pTIRFM jest wdrażany do monitorowania szybkich i miejscowych deformacji błony, które występują podczas fuzji gęstych pęcherzyków rdzeniowych w bydlęcych komórkach chromochłonnych. Chociaż omówiono tylko jedno zastosowanie, technika ta idealnie nadaje się do badania innych procesów biologicznych, które obejmują zmiany kształtu błony, w tym endocytozy, cytokinezy i ruchliwości komórek.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kamera iXon3 EMMCD	Andor	897
IX81 Mikroskop odwrócony	Olympus		Boczny zespół kostki filtracyjnej
Laser Ar-Ion serii 43	CVI Milles Griot Laser Optyka	543-AP-A01	Przestrajany do 488nm
Sapphire 561 LP Diodowy	laserowy spójny		561nm
skanujący system luster Galvo	Thorlabs	GVS102
VC3 Kanałowy system perfuzji ogniskowej	ALA Scientific Instruments	ALA VC3X4PP
QMM Mikrokolektor kwarcowy	ALA Scientific Instruments	ALA QMM-4
10 PSI Regulator ciśnienia	ALA Scientific Instruments	ALA PR10
Manipulator	Burleigh	TS 5000-150
Zamontowany achromatyczny Ćwierćfalowa płyta	Thorlabs	AQWP05M-600
420-680nm Polaryzacyjny rozdzielacz wiązki Cube	Thorlabs	PBS201
Sześciopozycyjne koło o neutralnej gęstości	Thorlabs	FW1AND
napędzane silnikiem krokowym SmartShutter	Sutter Instruments	IQ25-1219
HQ412lp Filtr dichroiczny	Chroma	NC255583	Łączy wiązki 488nm i 561nm
Powlekana soczewka płasko-wklęsła	Edmund Optics	PCV 100mm VIS 0	Diverges 488nm beam
Powlekana soczewka plano-wklęsła	Edmund Optics	PCV 250mm VIS 0	Rozbieżna wiązka 561nm
Powlekana soczewka plano-wypukła	Edmund Optics	PCX 125mm VIS 0	Skupia obie wiązki
Powlekana soczewka płasko-wypukła	Edmund Optics	PCX 50mm VIS 0	Cementowany do zespołu kostki filtracyjnej
z488/561rpc Dichroic	Chroma	z488/561rpc	Filtercube dichroic
z488/561_TIRF Filtr emisyjny	Chroma	z488/561m_TIRF	Emisja Filtercube
UIS2 60x Obiektyw	Olympus	UPLSAPO 60XO	NA 1.37
System transfekcji neonowej	Invitrogen	MPK 5000
Oprogramowanie do obrazowania MetaMorph	Urządzenia molekularne
DiI Membrane Dye	Invitrogen	V-22885	do celów wyrównania
TH Liberase	Roche	5401135001
TL Liberse	Roche	5401020001
DNAzyda I typu IV z bydlęcego	Hemocytometru Sigma	D5025
	Fisher	0267110
DiD Membrane Dye	Invitrogen	D-7757
Rodamina	Invitrogen	R634.22
μ m Membranowy filtr strzykawkowy	Millipore	SLGS033SS
Fluoresbrite Polichromatyczne czerwone mikrosfery	Polysciences	19507	0,5 mikrona
Olejek immersyjny	Sigma	56822
LabVIEW	National Instruments		Controlls Lustra galvo
Kolba obrotowa	Bellco	1965-00250