Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Konsensus białka pochodzenia mózgowego, protokół ekstrakcji do badania ludzkiego i mysiego proteomu mózgu przy użyciu immunoblottingu zarówno 2D-DIGE, jak i Mini 2DE

15.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51339

⸱

10 kwietnia 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Team Alzheimer & Tauopathies, Jean-Pierre Aubert Research Centre, Inserm UMR 837, 2EA 4308-Department of Reproductive Biology-Spermiology-CECOS, CHRU-Lille, 3EA2686-Laboratorie d'Immunologie, Faculté de Médecine - Pôle Recherche, 4Department of Neurology, CHRU-Lille

W tym artykule

Podsumowanie

Powszechny protokół ekstrakcji białek przy użyciu buforu mocznikowego/tiomocznikowego/SDS dla tkanki mózgowej ludzi i myszy umożliwia identyfikację białek za pomocą 2D-DIGE i ich późniejszą charakterystykę za pomocą mini immunoblottingu 2DE. Metoda ta umożliwia uzyskanie bardziej powtarzalnych i wiarygodnych wyników z biopsji człowieka i modeli eksperymentalnych.

Streszczenie

Dwuwymiarowa elektroforeza żelowa (2DE) jest potężnym narzędziem do odkrywania modyfikacji proteomu potencjalnie związanych z różnymi stanami fizjologicznymi lub patologicznymi. Zasadniczo technika ta opiera się na rozdzieleniu białek według ich punktu izoelektrycznego w pierwszym etapie, a po drugie zgodnie z ich masą cząsteczkową za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym SDS (SDS-PAGE). W niniejszym raporcie opisano zoptymalizowany protokół przygotowania próbki dla niewielkiej ilości ludzkiej tkanki mózgowej pośmiertnej i myszy. Metoda ta umożliwia wykonanie zarówno dwuwymiarowej elektroforezy żelowej różnicowej fluorescencji (2D-DIGE), jak i mini immunoblottingu 2DE. Połączenie tych podejść pozwala nie tylko na znalezienie nowych białek i/lub modyfikacji białek w ich ekspresji dzięki kompatybilności z detekcją za pomocą spektrometrii mas, ale także na nowy wgląd w walidację markerów. W ten sposób mini-2DE w połączeniu z western blotting pozwala na identyfikację i walidację modyfikacji potranslacyjnych, katabolizmu białek i zapewnia jakościowe porównanie między różnymi schorzeniami i / lub leczeniem. W niniejszym artykule przedstawiamy metodę badania składników agregatów białkowych występujących w chorobie Alzheimera i otępieniu z ciałami Lewy'ego, takich jak peptyd beta amyloidu i alfa-synukleina. Dzięki temu nasza metoda może zostać zaadaptowana do analizy ekstraktu proteomu i nierozpuszczalnych białek z ludzkiej tkanki mózgowej oraz modeli mysich. Równolegle może dostarczyć użytecznych informacji do badania szlaków molekularnych i komórkowych zaangażowanych w choroby neurodegeneracyjne, a także potencjalnych nowych biomarkerów i celów terapeutycznych.

Wprowadzenie

Zaburzenia psychiczne i neurologiczne stanowią 13% globalnego obciążenia chorobami, nowe wyzwania, takie jak mechanizmy patofizjologiczne, czynniki ryzyka i biomarkery prodromalne, muszą zostać zbadane1. Zgodnie z tym celem, badania proteomiczne ludzkiego mózgu stają się niezbędne do odkrycia szlaków molekularnych zaangażowanych w procesy takie jak pamięć, zachowanie, emocje i plastyczność neuronalna, nie tylko w stanach fizjologicznych, ale także patologicznych. W związku z tym wykorzystanie modeli zwierzęcych, a dokładniej myszy transgenicznych, daje szeroki wachlarz możliwości naśladowania etiologii zaburzeń neurodegeneracyjnych u ludzi2.

Obecnie dostępne są podejścia proteomiczne, które pozwalają na osiągnięcie tych nowych perspektyw w dziedzinie neuronauki. Dwuwymiarowa elektroforeza żelowa (2DE) jest skuteczną i prawdopodobnie prostą metodą, która umożliwia porównanie proteomu w szerokim zakresie próbek. Co więcej, jest to również potężna metoda izolowania białka ze złożonej mieszaniny w celu identyfikacji i dalszej analizy za pomocą spektrometrii mas. Technika ta składa się zasadniczo z dwóch następujących po sobie etapów: 1) separacji białek zgodnie z ich punktem izoelektrycznym (pI) przez izoelektroogniskowanie (IEF). Mówiąc dokładniej, potencjał elektryczny jest przykładany do pasków immobilyny akrylamidu w gradiencie pH, a następnie białka migrują i skupiają się na określonym pI w funkcji ich globalnego ładunku netto. 2) Białka skoncentrowane izoelektrycznie są denaturowane i naładowane ujemnie przez dodanie dodecylosiarczanu sodu (SDS), w ten sposób białka w ich pierwszej strukturze są rozdzielane w zależności od ich pozornej masy cząsteczkowej (MW) przez SDS-PAGE3. Te dwie odrębne właściwości pozwalają nam zmierzyć się z podwójną wartością, aby pójść dalej w badaniach proteomu. Podejście to daje z jednej strony możliwość przeprowadzenia analizy ilościowej przy użyciu metody 2D-DIGE z minimalną ilością barwników, a z drugiej strony analizę jakościową metodą mini-2DE sprzężoną z western blot.

Analiza ilościowa przeprowadzona przez 2D-DIGE powoduje zmiany ekspresji białek w całym proteomie próbki. Krótko mówiąc, próbki są znakowane trzema cyjaninami (Cy2, Cy3 i Cy5) emitowanymi na trzech różnych długościach fal (niebieskiej, zielonej i czerwonej). Te barwniki o minimalnej zawartości fluoru zawierające grupę estrową N-hydroksysukcynimidylu reagują z grupą ε-aminową reszt lizynowych białek, tworząc kowalencyjne wiązania amidowe4. Reszty lizyny są znakowane tylko w zakresie 1-3%, co zapobiega wielokrotnemu dodawaniu znaczników na białko i głównym modyfikacjom ładunku netto 5,6. Cy3 i Cy5 są często używane do oznaczania dwóch niezależnych próbek, podczas gdy Cy2 oznacza mieszankę równych proporcji próbek do porównania. Dwie główne zalety to to, że wszystkie znakowane próbki są mieszane, a IEF i SDS-PAGE są przeprowadzane w jednym żelu jednocześnie na każdym etapie, co pozwala uniknąć wzajemnej zmienności między eksperymentami wynikającej z porównania żeli. Co więcej, charakteryzuje się wysokim progiem wykrywalności wynoszącym około 1 femtomola białka7. Żele są skanowane, a oprogramowanie 2D porównuje obrazy fluorescencji żelowej 2D, gdzie Cy2 służy jako wewnętrzny wzorzec pozwalający na identyfikację różnic statystycznych między plamkami w celu ich późniejszej identyfikacji za pomocą spektrometrii mas. Oprogramowanie do analizy 2D wykorzystujące wzorzec wewnętrzny osiąga szybkie wykrywanie mniej niż 10% różnic między próbkami przy ponad 95% ufności statystycznej8.

Analiza jakościowa za pomocą mini-2DE jest kluczowym krokiem dla charakterystyki białka. Zasada działania jest taka sama, jak opisana wcześniej dla separacji pI i MW, ale w tym przypadku białka są przenoszone z małego żelu poliakrylamidowego do błony, a następnie przeprowadza się immunoblotting. Podczas gdy jednowymiarowa elektroforeza żelowa zapewnia zmiany w ekspresji białka dla jednego lub kilku epitopów białkowych w funkcji przeciwciała, informacja o mini-2DE zapewnia dwa dodatkowe parametry. Po pierwsze, izowarianty białek zmieniają funkcję pI, co wskazuje, że mogą zachodzić modyfikacje potranslacyjne. Po drugie, identyfikacja za pomocą spektrometrii mas może wskazywać na prawdopodobne zymogeny i produkty kataboliczne białek. W związku z tym modyfikacje zaobserwowane przez 2D-DIGE prawdopodobnie wskazują na mechanizmy leżące u podstaw zmian w globalnym profilu proteomu. Wyrównanie immunoblotów między kilkoma próbkami dla tego samego epitopu białka / epitopów przez mini-2DE może odzwierciedlać zmiany kwasowości, rzucając światło na zmiany potranslacyjne nieznacznie obserwowane lub nawet nie przez jednowymiarowe immunoblotting 9,10. Ponadto analiza ta informuje o potencjalnych miejscach rozszczepienia ze względu na wiedzę o pI i MW reszt metabolicznych11,12.

Połączenie tych dwóch technik zapewnia komplementarną analizę proteomiczną. Z jednej strony 2D-DIGE zapewnia pewien rodzaj różnic pozwalający na precyzyjną izolację polipeptydów, których ekspresja jest różna. Różnice te polegają zasadniczo na pojawieniu się lub zaniku plamki lub zwiększeniu/zmniejszeniu intensywności danej plamki poprzez analizę programową żeli fluorescencyjnych. Jest jednak mało prawdopodobne, aby obserwacje te same w sobie wyjaśniały charakter zaobserwowanej modyfikacji. Z tych powodów, po wyizolowaniu polipeptydu i zidentyfikowaniu go za pomocą spektrometrii mas, zastosowanie mini-2DE umożliwia precyzyjne potwierdzenie 1) tożsamości wyizolowanego białka i 2) charakteru różnicy: na przykład zmiany poziomu ekspresji izowariantu/izoformy, modyfikacji potranslacyjnych i procesów rozszczepienia. Konieczne jest jednak opracowanie wyjściowego buforu do lizy zarówno kompatybilnego z 2D-DIGE, jak i z mini-2DE, w celu ograniczenia potencjalnych dyspersji wynikających z zastosowania bardzo różnych protokołów ekstrakcji.

W tym artykule opisaliśmy dostosowany protokół przygotowania, ekstrakcji i wykonywania technik 2D-DIGE i mini-2DE dla białek mózgowych pochodzących z tkanek ludzkich i mysich.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Homogenizacja i całkowita ekstrakcja białka z tkanki mózgowej człowieka i myszy

  1. Homogenizacja tkanki mózgowej. Homogenizuj tkankę mózgową 10% (w/v) w 8 M moczniku, 2 M tiomoczniku i 1% w/v buforze SDS (UTS) za pomocą szkła garncarskiego (dla próbek ludzkich) lub homogenizatora teflonowego (dla próbek myszy). Sonikacja przy 60 Hz 30 impulsów za pomocą generatora ultradźwięków w ciągu 0,5 sekundy w celu całkowitego rozpadu tkanek13,14.
    1. Określ stężenie białka za pomocą testu Bradforda, używając BSA jako standardu. Ta ekstrakcja buforowa UTS jest całkowicie kompatybilna z jednowymiarową SDS-PAGE, o ile lizaty nie są przegrzane, aby uniknąć karbamylacji15.
    2. Dodać 1% (w/v) Amberlite i inkubować z delikatnym mieszaniem przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przefiltrować na filtry strzykawkowe 0,22 μm i na koniec dodać SDS do roztworu mocznika/tiomocznika. Ten krok zmniejsza ilość kwasu moczowego i kwasu izocyjanowego, które są w równowadze z mocznikiem w roztworze i ułatwiają jego degradację.
  2. Wytrącanie białka chloroformu/metanolu. Wytrącić od 100 do 150 μg białka dla 11 cm pasków IPG i 1-1,5 mg dla 18 cm (niezależnie od zakresu pH wybranego do wykonania IEF).
    1. Wykonać wszystkie czynności na lodzie lub w temperaturze 4 °C. Schłodzić chloroform i metanol w temperaturze 4 °C przez 30 minut przed rozpoczęciem procedury wytrącania.
    2. Dodać trzy objętości metanolu i jedną objętość chloroformu do jednej objętości lizatu UTS. Wstrząśnij ręcznie mieszaniną i dodaj trzy objętości zimnej wody. Wirować przez 1 minutę i granulować białka przez odwirowanie w temperaturze 12 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Odrzucić supernatant za pomocą pipety Pasteura i dodać trzy objętości zimnego MeOH. Ponownie przetworzyć wir i odwirować przy 12 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Na koniec odrzucić supernatant i wysuszyć osad podN2.
  3. Przygotowanie białek do analizy 2D. Zawiesić wysuszony białko osad w buforze 2D (8 M mocznik, 2 M tiomocznik uzupełniony 4% CHAPS). Przemyj roztwór Amberlite, jak wskazano powyżej, i staraj się zachować proporcję 500 μg białka na 200 μl buforu 2D dla 2D-DIGE. Uwaga: Bufor 2D może być przechowywany w temperaturze -80 °C lub w temperaturze 4 °C przez tydzień (w celu zapobieżenia degradacji mocznika).
    1. Sonikować i przechowywać próbki w temperaturze -80 °C do czasu przeprowadzenia następnego etapu. Warto zauważyć, że protokół ten może być stosowany po solubilizacji agregatów białkowych kwasem mrówkowym10. Krótko mówiąc, odparować kwas mrówkowy podN2 i ponownie zawiesić osad zgodnie z opisem.

2. 2D-DIGE

  1. Próbki testują jakość. Ponownie dozować próbki metodą Bradforda. Rozcieńczyć 15 μg białek w buforze do próbek LDS, podgrzać w temperaturze 37 °C15 i załadować na 4-12% żele poliakrylamidowe.
  2. Barwienie Coomassie. Żel poliakrylamidowy barwić 0,1% (w/v) Coomassie Blue G-250, 50% roztworem EtOH i 10% (v/v) kwasu octowego przez co najmniej 1 godzinę. Pozostaw tło na noc do odbarwienia w 7% roztworze kwasu octowego i 10% (v/v) etanolu.
  3. Wstępne znakowanie elektroforetyczne próbek. Przed wykonaniem znakowania barwnikiem cyjaninowym należy sprawdzić pH próbki, które powinno być zasadowe lub nawet obojętne, ponieważ podstawienie N-hydroksysukcynimidu jest bardziej wydajne przy zasadowym pH i optymalne przy pH 8,6.
    1. Oznaczyć minimalnie dwie badane próbki barwnikami fluorescencyjnymi Cy3 lub Cy5 w stosunku 50 μg białka/400 pmol barwnika i przechowywać przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C w ciemności, aby ułatwić NHS reaktywną grupę reaktywną estrów cyjanin z nieprotonowanymi grupami aminowymi lizyn
      2. .
    2. Zmniejsz różnice w próbce, dokonując znakowania krzyżowego barwnikami Cy3 i Cy5, unikając preferencyjnego sprzężenia jednej próbki z określoną cyjaniną. Należy zauważyć, że minimalne znakowanie barwnika cyjaninowego można dostosować do niewielkiej ilości białek przy zachowaniu proporcji 1 μg białka na 8 pmol barwnika cyjaninowego. Jeśli tak, system mini-2DE może być używany zamiast dużego systemu żelowego 2D. Umożliwi to analizę 2D-DIGE dla niewielkiej ilości tkanki mózgowej.
    3. Oznaczyć pulę obu próbek taką samą ilością białka (łącznie 50 μg) barwnikiem fluorescencyjnym Cy2 i zastosować jako wzorzec wewnętrzny. Użyj tych samych warunków, jak wskazano wcześniej.
    4. Uzupełnić do całkowitej objętości 350 μl buforem 2D zawierającym 1,1% odczynnika Destreak, 1,2% buforu IPG i śladowe ilości błękitu bromofenolowego łącznie 150 μg znakowanych białek (50 μg Cy2, 50 μg Cy3 i 50 μg Cy2). Wykonaj ten krok w poczwórnym duplikacji, używając czterech niezależnych pasków. Ponadto należy przygotować dwa dodatkowe nieznakowane paski (po jednym na każdą próbkę) z 350-450 μg białka do żeli preparatywnych.
    5. Pozostaw sześć załadowanych pasków pokrytych olejem mineralnym na noc w celu pasywnego nawodnienia.
  4. Izoelektroogniskowanie. Przeprowadzić IEF w temperaturze 20 °C. Dla paska pH 3-11NL, 18 cm protokół jest następujący: maksymalne ustawienie prądu wynosi 50 μA/pasek podczas 8 etapów: 1) krok 150 V przez 1 godzinę, 2) krok 200 V przez 5 godzin, 3) gradient 500 V przez 2 godziny, 4) gradient 1 000 V przez 2 godziny, 5) gradient 2 000 V przez 2 godziny, 6) Gradient 4 000 V przez 2 godziny, 7) Gradient 8 000 V przez 2 godziny i 8) dla łącznego kroku 24 000 V·h. Po IEF usunąć nadmiar oleju mineralnego za pomocą bibuły chromatograficznej i przechowywać paski w temperaturze -20 °C do drugiego wymiaru.
  5. Równowaga pasków IPG. Równowaga pasków w 6 M moczniku, 2% SDS, 30% Glicerolu, 50 mM buforze Tris-HCl pH 8,6 z 1% DTT przez 15 minut i po 4,7% jodoacetamidem w tym samym buforze, ale bez DTT.
  6. Drugi wymiar lub elektroforeza SDS-PAGE. Sześć 12% żeli SDS-PAGE (1,5 M Tris-HCl pH 8,6, 12% akrylamid/bisakrylamid, 0,1% (w/v) SDS, 0,072% (w/v) APS i 0,1% (v/v) TEMED) należy przygotować w tym samym czasie, używając dużego systemu 2D, z czterema płytkami szklanymi o niskiej fluorescencji dla pasków z próbkami fluorescencyjnymi i dwiema innymi szklanymi płytkami o grubości 1,5 mm dla żeli preparatywnych w celu wycięcia plamek białkowych.
    1. Załaduj sześć pasków IPG na wierzch żeli i ułóż je warstwami 0,5% (w/v) agarozy. Bufor roboczy składa się z 25 mM Tris, 192 mM glicyny i 0,1% (w/v) SDS. Migrację należy przeprowadzić z prędkością 2,5 W/żel przez noc w układzie chłodniczym ustawionym na 4 °C16,17.
  7. Akwizycja i analiza obrazów fluorescencyjnych. Użyj skanera Typhoon 9400, aby uzyskać obrazy żeli fluorescencyjnych (12 obrazów dla jednego eksperymentu). Skanuj obrazy Cy2, Cy3 i Cy5 dla każdego żelu przy długościach fal wzbudzenia/emisji odpowiednio 488/520 nm, 532/580 nm i 630/670 nm. Użyj oprogramowania informatycznego do analizy obrazów. Dane są reprezentatywne dla zmian objętości plamki związanych z dystrybucją sygnału w czterech żelach między dwiema badanymi próbkami.
  8. Barwienie Coomassie dla dużych żeli. Utrwalić żele preparatywne w 50% (v/v) roztworze EtOH i 3% (v/v) kwasu ortofosforowego na co najmniej 24 godziny. Następnie umyj dwukrotnie ultra czystą wodą przez 20 minut. Wykonaj barwienie w 34% (v/v) MeOH, 17% (w/v) siarczanie amonu i 2% kwasie ortofosforowym przez 1 godzinę przed dodaniem 0,1% (w/v) Coomassie Blue G-250. Przechowuj żele w kolorze przez co najmniej 48 godzin i odbarwij je w ultra czystej wodzie.
    1. Miejsca do identyfikacji stwardnienia rozsianego. Po przeanalizowaniu obrazów fluorescencyjnych oprogramowanie dostarcza listę plam, których ekspresja jest statystycznie różna. Ręcznie wytnij te plamy z żeli preparatywnych. Ta procedura wymaga wprawy i pewnej zręczności manualnej, aby uniknąć zanieczyszczenia keratyną. Następnie próbki można przechowywać w wodzie w temperaturze -20 °C do momentu wysłania do MS. Identyfikacja punktowa jest w pełni kompatybilna z tandemową spektrometrią mas (MS/MS), a znaczenie tożsamości białek jest oceniane zgodnie z wynikiem Mowse'a opartym na prawdopodobieństwie, obliczonym przy wartości p 0,05 (p < 0,05)18.

3. Jakościowy test Mini-2DE

  1. Zawiesić maksymalnie 100 μg próbki białka w buforze 2D do uzyskania końcowej objętości 200 μl dla 11-centymetrowego paska IPG. W przypadku systemu nadekspresji lub oczyszczonego białka ilość wyjściowa może być obniżona do 20 μg.
  2. Dodać 1,1% (v/v) odczynnik Destreak, 0,55% (v/v) buforu IPG i śladowe ilości błękitu bromofenolowego do końcowej objętości 200 μl. Następnie wiruj, szybko wiruj i załaduj do paska IPG w celu pasywnego nawodnienia (aby doprowadzić pasek do pierwotnej grubości) przez noc pokryty olejem mineralnym. Uwaga: proporcja buforu IPG jest taka sama dla wszystkich pożądanych przedziałów pH (pH 3-11, 4-7, 7-11 itd.), ale jego skład różni się w zależności od wybranego zakresu pH.
  3. Izoelektrofokalizacja. Wykonać IEF w temperaturze 20 °C. Czas trwania programu zależy od wybranego przedziału pH. Warto zauważyć, że parametry takie jak elektroendosmoza mogą zaburzać profil IEF i w takich przypadkach konieczna jest optymalizacja czasu elektrofokalizacji19. Uwaga: niekoniecznie jest to dłuższy IEF, który zapewnia lepsze wyniki, ale skrócenie czasu IEF może również poprawić rozdzielczość. Po IEF paski IPG mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez wiele miesięcy.
  4. Wyrównanie pasków IPG. Zrównoważyć paski w buforze zawierającym 25 mM Tris-HCl pH 6,8, 20 mM DTT, 10% glicerolu, 5% SDS, 0,05% błękitu bromofenolowego. Wykonać trzy kąpiele równoważące przez 15 minut, zmieniając roztwór buforowy między każdą kąpielą.
  5. STRONA SDS. Ułóż pasek IPG na prefabrykowanym żelu (dołek IPG+1, 11 cm pasek IPG) z procentową zawartością poliakrylamidu wybraną w zależności od MW interesującego białka. Następnie osusz żel na membranie nitrocelulozy/PVDF pod napięciem 100 mV przez 33 minuty.
  6. Inkubuj przez noc z wymaganym przeciwciałem i wizualizuj aktywność peroksydazy. Wykonaj wyrównanie immunoblot przy użyciu niepowiązanych polipeptydów ujawnionych przez przeciwciało drugorzędowe. Osiągnij półilościową analizę za pomocą densytometrii objętości i intensywności śladów/plam za pomocą oprogramowania ImageJ.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Proteomika tkanek mózgu pozostaje wyzwaniem, ponieważ nie istnieje idealny bufor pozwalający na odzyskanie 100% białek, szczególnie białek związanych z błoną komórkową lub białek cytoszkieletu. Pierwszy zestaw eksperymentów skupiał się na poszukiwaniu odpowiedniego buforu do lizy, który byłby kompatybilny z obiema metodami i umożliwiałby odzyskanie szerokiego panelu białek. W związku z tym przetestowano trzy bufory do lizy, aby wyłonić najodpowiedniejszy z nich. Po pierwsze, zastosowano powszechnie używany w biochemii i ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Odkrywanie patologicznych zmian ekspresji białek, poszukiwanie biomarkerów i modulacja potencjalnych szlaków dla celów farmakologicznych to jedne z celów podejść neuroproteomicznych30. Wśród pojawiających się narzędzi, pole 2DE dodaje obiecujące oczekiwanie. Niemniej jednak należy osiągnąć konsensus w celu zminimalizowania zmienności i zwiększenia odtwarzalności w eksperymentach. Zgodnie z tą ideą, szczegółowo opisano tutaj znormalizowany protokół wykonywania 2D-DIGE (ryc. 2) i następującego p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Inserm, University of Lille 2, MEDIALZ, LabEx (laboratorium doskonałości, program inwestycji w przyszłość) i DISTALZ (Opracowanie Innowacyjnych Strategii dla Transdyscyplinarnego podejścia do choroby Alzheimera). F-J. F-G jest obecnie stypendystą ANR (Francuska Narodowa Agencja Badawcza/ NeuroSplice de Tau Projet ANR- 2010-BLAN-1114 01), ale praca ta była również wspierana przez grant z JCCM (Hiszpania).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5 nmol 1 * 5 NmoGE Healtcare25-8010-65
Immobiline DryStripGE HealtcareReference w funkcji przedziału pH/wielkości
buforu IPG, pH X-XGE HealtcareReference w funkcji pożądanego przedziału pH
AMBERLITE IRN-150L ŻYWICA ZE ZŁOŻEM MIESZANYM 1 GE Healtcare551797N
DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 lGE Healtcare17-1335-01
ZESTAW PUDEŁKO IPG 1 * 1 ZESTAWGE Healtcare28-9334-92Plastikowe pudełko do pasywnego nawadniania 
MILLEX GS FilterMilliporeSLGS033SB
Criterion XT Prefabrykaty żelowe 13,3 x 8,7 cm (szer. x dł.)Bio-RadOdniesienie w funkcji MW do oddzielenia
Izoelektryczny moduł ogniskowania IPGphor IIIGE Healtcare11-0033-64
Ettan DALTsix Duży system do elektroforezyGE Healtcare80-6485-08
OneTouch 2D Gel SpotPicker 1,5 mm Żel firmyP2D1.5

Bibliografia

  1. Collins, P. Y., et al. Grand challenges in global mental health. Nature. 475, 27-30 (2011).
  2. De Deyn, P. P., Van Dam, D., Sergeant, N., Buée, L. Animal Models of Dementia Vol. 48 Neuromethods 449-468. , Humana Press. 449-468 (2011).
  3. O'Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J Biol Chem. 250, 4007-4021 (1975).
  4. Riederer, B. M. Non-covalent and covalent protein labeling in two-dimensional gel electrophoresis. J Proteomics. 71, 231-244 (2008).
  5. Marouga, R., David, S., Hawkins, E. The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology. Anal Bioanal Chem. 382, 669-678 (2005).
  6. Westermeier, R., Scheibe, B. Difference gel electrophoresis based on lys/cys tagging. Methods Mol Biol. 424, 73-85 (2008).
  7. Gong, L., et al. Drosophila ventral furrow morphogenesis: a proteomic analysis. Development. 131, 643-656 (2004).
  8. Gharbi, S., et al. Evaluation of two-dimensional differential gel electrophoresis for proteomic expression analysis of a model breast cancer cell system. Mol Cell Proteomics. 1, 91-98 (2002).
  9. Ando, K., et al. Tau pathology modulates Pin1 post-translational modifications and may be relevant as biomarker. Neurobiol Aging. 34, 757-769 (2013).
  10. Bretteville, A., et al. Two-dimensional electrophoresis of tau mutants reveals specific phosphorylation pattern likely linked to early tau conformational changes. PLoS One. 4, 4843(2009).
  11. Sergeant, N., et al. Two-dimensional characterization of paired helical filament-tau from Alzheimer's disease: demonstration of an additional 74-kDa component and age-related biochemical modifications. J Neurochem. 69, 834-844 (1997).
  12. Sergeant, N., et al. Different distribution of phosphorylated tau protein isoforms in Alzheimer's and Pick's diseases. FEBS Lett. 412, 578-582 (1997).
  13. Rabilloud, T., Luche, S., Santoni, V., Chevallet, M. Detergents and chaotropes for protein solubilization before two-dimensional electrophoresis. Methods Mol Biol. 355, 111-119 (2007).
  14. Wrobel, K., Caruso, J. A. Pretreatment procedures for characterization of arsenic and selenium species in complex samples utilizing coupled techniques with mass spectrometric detection. Anal Bioanal Chem. 381, 317-331 (2005).
  15. McCarthy, J., et al. Carbamylation of proteins in 2-D electrophoresis--myth or reality. J Proteome Res. 2, 239-242 (2003).
  16. Chafey, P., et al. Proteomic analysis of beta-catenin activation in mouse liver by DIGE analysis identifies glucose metabolism as a new target of the Wnt pathway. Proteomics. 9, 3889-3900 (2009).
  17. Kahn, J. E., et al. Comparative proteomic analysis of blood eosinophils reveals redox signaling modifications in patients with FIP1L1-PDGFRA-associated chronic eosinophilic leukemia. J Proteome Res. 10, 1468-1480 (2011).
  18. Pottiez, G., et al. A large-scale electrophoresis- and chromatography-based determination of gene expression profiles in bovine brain capillary endothelial cells after the re-induction of blood-brain barrier properties. Proteome Sci. 8, 57(2010).
  19. Stochaj, W. R., Berkelman, T., Laird, N. Preparative 2D Gel Electrophoresis with Immobilized pH Gradients: IPG Strip Equilibration. CSH Protoc. , (2006).
  20. Azimzadeh, O., et al. Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) proteome analysis using gel-free and gel-based proteomics. J Proteome Res. 9, 4710-4720 (2010).
  21. Singh, S., et al. Identification of the p16-Arc subunit of the Arp 2/3 complex as a substrate of MAPK-activated protein kinase 2 by proteomic analysis. J Biol Chem. 278, 36410-36417 (2003).
  22. Rabilloud, T. Use of thiourea to increase the solubility of membrane proteins in two-dimensional electrophoresis. Electrophoresis. 19, 758-760 (1998).
  23. Molloy, M. P., et al. Extraction of membrane proteins by differential solubilization for separation using two-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis. 19, 837-844 (1998).
  24. Ericsson, C., Peredo, I., Nister, M. Optimized protein extraction from cryopreserved brain tissue samples. Acta Oncol. 46, 10-20 (2007).
  25. Shaw, M. M., Riederer, B. M. Sample preparation for two-dimensional gel electrophoresis. Proteomics. 3, 1408-1417 (2003).
  26. Ye, X., et al. Optimization of protein solubilization for the analysis of the CD14 human monocyte membrane proteome using LC-MS/MS. J Proteomics. 73, 112-122 (2009).
  27. Centlow, M., Hansson, S. R., Welinder, C. Differential proteome analysis of the preeclamptic placenta using optimized protein extraction. J Biomed Biotechnol. 2010, 458-748 (2010).
  28. Perdew, G. H., Schaup, H. W., Selivonchick, D. P. The use of a zwitterionic detergent in two-dimensional gel electrophoresis of trout liver microsomes. Anal Biochem. 135, 453-455 (1983).
  29. Schindowski, K., et al. Alzheimer's disease-like tau neuropathology leads to memory deficits and loss of functional synapses in a novel mutated tau transgenic mouse without any motor deficits. Am J Pathol. 169, 599-616 (2006).
  30. Veenstra, T. D., Marcus, K. Multidimensional advancement of neuroproteomics. Expert Rev Proteomics. 5, 149-151 (2008).
  31. Hernandez-Hernandez, O., et al. Myotonic dystrophy CTG expansion affects synaptic vesicle proteins, neurotransmission and mouse. 136, 957-970 (2013).
  32. Deramecourt, V., et al. Biochemical staging of synucleinopathy and amyloid deposition in dementia with Lewy bodies. J Neuropathol Exp Neurol. 65, 278-288 (2006).
  33. Tofaris, G. K., Razzaq, A., Ghetti, B., Lilley, K. S., Spillantini, M. G. Ubiquitination of alpha-synuclein in Lewy bodies is a pathological event not associated with impairment of proteasome function. J Biol Chem. 278, 44405-44411 (2003).
  34. Sergeant, N., et al. Truncated beta-amyloid peptide species in pre-clinical Alzheimer's disease as new targets for the vaccination approach. J Neurochem. 85, 1581-1591 (2003).
  35. Le Freche, H., et al. Tau phosphorylation and sevoflurane anesthesia: an association to postoperative cognitive impairment. Anesthesiology. 116, 779-787 (2012).
  36. Leboucher, A., et al. Detrimental effects of diet-induced obesity on tau pathology are independent of insulin resistance in tau transgenic mice. Diabetes. 62, 1681-1688 (2013).
  37. Deramecourt, V., et al. Clinical, neuropathological, and biochemical characterization of the novel tau mutation P332S. J Alzheimers Dis. 31, 741-749 (2012).
  38. Birdsill, A. C., Walker, D. G., Lue, L., Sue, L. I., Beach, T. G. Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue. Cell Tissue Bank. 12, 311-318 (2011).
  39. Bell, J. E., et al. Management of a twenty-first century brain bank: experience in the BrainNet Europe consortium. Acta Neuropathol. 115, 497-507 (2008).
  40. Crecelius, A., et al. Assessing quantitative post-mortem changes in the gray matter of the human frontal cortex proteome by 2-D DIGE. Proteomics. 8, 1276-1291 (2008).
  41. Swatton, J. E., Prabakaran, S., Karp, N. A., Lilley, K. S., Bahn, S. Protein profiling of human postmortem brain using 2-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2-D DIGE). Mol Psychiatry. 9, 128-143 (2004).
  42. Viswanathan, S., Unlu, M., Minden, J. S. Two-dimensional difference gel electrophoresis. Nat Protoc. 1, 1351-1358 (2006).
  43. Tannu, N. S., Hemby, S. E. Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis for comparative proteomics profiling. Nat Protoc. 1, 1732-1742 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

2D DIGEwytr canie w chloroformie i metanoluogniskowanie izoelektryczneSDS PAGEWestern blottingmodyfikacje potranslacyjnechoroby neurodegeneracyjne
Konsensus białka pochodzenia mózgowego, protokół ekstrakcji do badania ludzkiego i mysiego proteomu mózgu przy użyciu immunoblottingu zarówno 2D-DIGE, jak i Mini 2DE
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.