Konsensus białka pochodzenia mózgowego, protokół ekstrakcji do badania ludzkiego i mysiego proteomu mózgu przy użyciu immunoblottingu zarówno 2D-DIGE, jak i Mini 2DE

Summary

Powszechny protokół ekstrakcji białek przy użyciu buforu mocznikowego/tiomocznikowego/SDS dla tkanki mózgowej ludzi i myszy umożliwia identyfikację białek za pomocą 2D-DIGE i ich późniejszą charakterystykę za pomocą mini immunoblottingu 2DE. Metoda ta umożliwia uzyskanie bardziej powtarzalnych i wiarygodnych wyników z biopsji człowieka i modeli eksperymentalnych.

Abstract

Dwuwymiarowa elektroforeza żelowa (2DE) jest potężnym narzędziem do odkrywania modyfikacji proteomu potencjalnie związanych z różnymi stanami fizjologicznymi lub patologicznymi. Zasadniczo technika ta opiera się na rozdzieleniu białek według ich punktu izoelektrycznego w pierwszym etapie, a po drugie zgodnie z ich masą cząsteczkową za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym SDS (SDS-PAGE). W niniejszym raporcie opisano zoptymalizowany protokół przygotowania próbki dla niewielkiej ilości ludzkiej tkanki mózgowej pośmiertnej i myszy. Metoda ta umożliwia wykonanie zarówno dwuwymiarowej elektroforezy żelowej różnicowej fluorescencji (2D-DIGE), jak i mini immunoblottingu 2DE. Połączenie tych podejść pozwala nie tylko na znalezienie nowych białek i/lub modyfikacji białek w ich ekspresji dzięki kompatybilności z detekcją za pomocą spektrometrii mas, ale także na nowy wgląd w walidację markerów. W ten sposób mini-2DE w połączeniu z western blotting pozwala na identyfikację i walidację modyfikacji potranslacyjnych, katabolizmu białek i zapewnia jakościowe porównanie między różnymi schorzeniami i / lub leczeniem. W niniejszym artykule przedstawiamy metodę badania składników agregatów białkowych występujących w chorobie Alzheimera i otępieniu z ciałami Lewy'ego, takich jak peptyd beta amyloidu i alfa-synukleina. Dzięki temu nasza metoda może zostać zaadaptowana do analizy ekstraktu proteomu i nierozpuszczalnych białek z ludzkiej tkanki mózgowej oraz modeli mysich. Równolegle może dostarczyć użytecznych informacji do badania szlaków molekularnych i komórkowych zaangażowanych w choroby neurodegeneracyjne, a także potencjalnych nowych biomarkerów i celów terapeutycznych.

Introduction

Zaburzenia psychiczne i neurologiczne stanowią 13% globalnego obciążenia chorobami, nowe wyzwania, takie jak mechanizmy patofizjologiczne, czynniki ryzyka i biomarkery prodromalne, muszą zostać zbadane¹. Zgodnie z tym celem, badania proteomiczne ludzkiego mózgu stają się niezbędne do odkrycia szlaków molekularnych zaangażowanych w procesy takie jak pamięć, zachowanie, emocje i plastyczność neuronalna, nie tylko w stanach fizjologicznych, ale także patologicznych. W związku z tym wykorzystanie modeli zwierzęcych, a dokładniej myszy transgenicznych, daje szeroki wachlarz możliwości naśladowania etiologii zaburzeń neurodegeneracyjnych u ludzi².

....

Protocol

1. Homogenizacja i całkowita ekstrakcja białka z tkanki mózgowej człowieka i myszy

1. Homogenizacja tkanki mózgowej. Homogenizuj tkankę mózgową 10% (w/v) w 8 M moczniku, 2 M tiomoczniku i 1% w/v buforze SDS (UTS) za pomocą szkła garncarskiego (dla próbek ludzkich) lub homogenizatora teflonowego (dla próbek myszy). Sonikacja przy 60 Hz 30 impulsów za pomocą generatora ultradźwięków w ciągu 0,5 sekundy w celu całkowitego rozpadu tkanek^13,14.
   1. Określ stężenie białka za pomocą testu Bradforda, używając BSA jako standardu. Ta ekstrakcja buforowa UTS jest całkowicie kompatybilna z jednowymiarową SDS-PAGE, o ile lizaty nie....

Results

Proteomika tkanki mózgowej pozostaje wyzwaniem, ponieważ nie istnieje idealny bufor do odzyskania 100% białek, zwłaszcza białek związanych z błoną lub cytoszkieletem. Pierwszy zestaw eksperymentów koncentrował się na poszukiwaniu odpowiedniego buforu do lizy, kompatybilnego z tymi dwoma podejściami i umożliwiającego odzyskanie dużego panelu białka. W związku z tym przetestowano trzy do lizy, aby określić najbardziej odpowiedni. Po pierwsze, wykorzystano powszechny bufor biochemiczny i biologii molekularnej Tris-HCl^2.......

Discussion

Odkrywanie patologicznych zmian ekspresji białek, poszukiwanie biomarkerów i modulacja potencjalnych szlaków dla celów farmakologicznych to jedne z celów podejść neuroproteomicznych³⁰. Wśród pojawiających się narzędzi, pole 2DE dodaje obiecujące oczekiwanie. Niemniej jednak należy osiągnąć konsensus w celu zminimalizowania zmienności i zwiększenia odtwarzalności w eksperymentach. Zgodnie z tą ideą, szczegółowo opisano tutaj znormalizowany protokół wykonywania 2D-DIGE (ryc. 2) i następującego p.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5 nmol 1 * 5 Nmo	GE Healtcare	25-8010-65
Immobiline DryStrip	GE Healtcare		Reference w funkcji przedziału pH/wielkości
buforu IPG, pH X-X	GE Healtcare		Reference w funkcji pożądanego przedziału pH
AMBERLITE IRN-150L ŻYWICA ZE ZŁOŻEM MIESZANYM 1	GE Healtcare	551797N
DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l	GE Healtcare	17-1335-01
ZESTAW PUDEŁKO IPG 1 * 1 ZESTAW	GE Healtcare	28-9334-92	Plastikowe pudełko do pasywnego nawadniania
MILLEX GS Filter	Millipore	SLGS033SB
Criterion XT Prefabrykaty żelowe 13,3 x 8,7 cm (szer. x dł.)	Bio-Rad		Odniesienie w funkcji MW do oddzielenia
Izoelektryczny moduł ogniskowania IPGphor III	GE Healtcare	11-0033-64
Ettan DALTsix Duży system do elektroforezy	GE Healtcare	80-6485-08
OneTouch 2D Gel SpotPicker 1,5 mm	Żel firmy	P2D1.5