Konfiguracja prostego mikroskopu z arkuszami świetlnymi do obrazowania in toto rozwoju C. elegans

Podsumowanie

Ten protokół opisuje konfigurację mikroskopu z arkuszem świetlnym i jego implementację do obrazowania in vivo zarodków C. elegans.

Streszczenie

Szybkie i nisko stosowane techniki obrazowania fototoksycznego są niezbędne do badania rozwoju organizmów in toto. Mikroskopia oparta na arkuszach świetlnych zmniejsza efekty fotowybielania i fototoksyczności w porównaniu z mikroskopią konfokalną, zapewniając jednocześnie obrazy 3D o rozdzielczości subkomórkowej. Tutaj przedstawiamy konfigurację mikroskopu opartego na arkuszu świetlnym, który składa się z mikroskopu pionowego i niewielkiego zestawu elementów optomechanicznych do generowania arkusza świetlnego. Protokół opisuje, jak zbudować, ustawić mikroskop i scharakteryzować arkusz świetlny. Ponadto szczegółowo opisano, w jaki sposób można wdrożyć metodę obrazowania in toto zarodków C. elegans przy użyciu prostej komory obserwacyjnej. Metoda ta pozwala na uchwycenie dwukolorowych filmów poklatkowych 3D w ciągu kilku godzin wywoływania. Powinno to ułatwić śledzenie kształtu komórki, podziałów komórkowych i znakowanych białek w długich okresach czasu.

Wprowadzenie

Formowanie i kształtowanie organizmu obejmuje ruchy komórek, zmiany kształtu komórki, podział komórek i różnicowanie komórek. Zrozumienie postępu i koordynacji tych procesów wymaga szybkich narzędzi do obrazowania z możliwością trójwymiarowości i rozdzielczością subkomórkową. Wśród technik wykorzystujących te możliwości obrazowania in vivo, mikroskopia oświetlenia arkuszami świetlnymi, zwana również mikroskopią oświetlenia pojedynczego/selektywnego płaszczyzny, ma wyjątkową zaletę polegającą na wytwarzaniu efektów o niskiej toksyczności i niskim poziomie fotowybielania^1,2.

W mikroskopii z oświetleniem arkuszy, próbka jest oświetlana z boku przez arkusz świetlny, który wykonuje sekcję optyczną. Ścieżka oświetlenia i ścieżka wykrywania są prostopadłe do siebie, a arkusz świetlny jest wyrównany tak, aby pokrywał się z płaszczyzną ogniskową obiektu soczewki obiektywu detekcji. Próbka jest umieszczana na przecięciu dwóch ścieżek i może być przesuwana wzdłuż osi detekcji, aby umożliwić obrazowanie 3D. Oświetlona jest tylko płaszczyzna zainteresowania i wszystkie punkty tej płaszczyzny są wykrywane w tym samym czasie. To znacznie zwiększa szybkość akwizycji i zmniejsza fotowybielanie, a także fototoksyczność w porównaniu z mikroskopią konfokalną³.

Praktycznie, mikroskopia z oświetleniem arkuszy jest łatwa do ustawienia i wyrównania: dla obrazowania dwuwymiarowego nie jest konieczne skanowanie ani dla części detekcyjnej, ani dla części oświetleniowej; jako technika szerokokątna z możliwością cięcia, trójwymiarowe obrazowanie można uzyskać poprzez pojedynczy ruch osi stolika trzymającego próbkę.

Tutaj prezentujemy ustawienie prostego mikroskopu z arkuszem świetlnym i jego implementację do obrazowania in toto zarodków C. elegans. Zarodki C. elegans są dobrze przystosowane do obrazowania in vivo ze względu na ich przezroczystość, niezmienniczą linię genealogiczną i stereotypowe pozycje komórek^4,5. Opracowany układ arkuszy świetlnych opiera się na standardowym mikroskopie pionowym do detekcji. Przedstawiony poniżej protokół szczegółowo opisuje, jak zbudować i wyrównać moduł/ścieżkę wzbudzenia, przetestować i scharakteryzować arkusz świetlny oraz zamontować próbkę do obrazowania 3D. Zawiera również przykłady filmów poklatkowych uzyskanych za pomocą konfiguracji na różnych szczepach wyrażających markery fluorescencyjne.

Protokół

1. Konfiguracja arkusza świetlnego i ścieżki wykrywania

Rysunek 1 przedstawia ogólny schemat układu optycznego.

1. Umieść i zamocuj mikroskop i lasery na stole optycznym.
2. Połącz lasery 488 nm, 561 nm i 405 nm z odpowiednimi zwierciadłami dichroicznymi. Po zwierciadłach dichroicznych lasery muszą być precyzyjnie ustawione. Należy zauważyć, że wybór długości fal laserowych, zwierciadeł dichroicznych i filtrów optycznych jest określany na podstawie widm absorpcyjnych określonych znaczników fluorescencyjnych użytych w eksperymentach.
3. Umieść przestrajalny filtr akustyczno-optyczny (AOTF). Skorzystaj z arkusza testowego dostarczonego przez dostawcę, aby dostosować częstotliwość i moc AOTF. Przy dobrym ustawieniu około 90% mocy lasera jest przesyłane przy maksymalnym strojeniu, mierzonym przez miernik mocy. Należy pamiętać, że niektóre lasery mogą być w pełni kontrolowane przez oprogramowanie, co może sprawić, że AOTF stanie się niepotrzebny.
4. Umieść i zamocuj teleskop. Należy pamiętać, że teleskop składa się z dwóch soczewek, które rozszerzają wiązkę do szerokości równej lub większej niż średnica tylnego otworu soczewki obiektywu oświetlającego. Na pierwszym miejscu powinien znaleźć się obiektyw o najmniejszej ogniskowej.
5. Umieść, wyrównaj i zamocuj peryskop, zbliżając ścieżkę optyczną do tylnego otworu cylindrycznej soczewki. Należy zauważyć, że dwa zwierciadła peryskopu są zamontowane w taki sposób, że ich długa oś leży na nachyleniu lustra, aby odbijać w pełni rozciągniętą wiązkę.
6. Umieść soczewkę cylindryczną obok wyjścia z peryskopu. Zwróć uwagę, że soczewka cylindryczna skupia wiązkę w jednym kierunku i pozostawia ją skolimowaną w drugim kierunku, tworząc w ten sposób arkusz światła.
7. Ponownie ustaw ostrość powstałego arkusza światła za pomocą soczewki obiektywu oświetlającego. Należy pamiętać, że ogniskowy obrazu obiektywu oświetleniowego powinien pokrywać się z punktem ogniskowym obiektu wykrywania. Rzuć wiązkę na ekran (np. ścianę) z dużej odległości. Przesuń obiektyw oświetlający wzdłuż osi wiązki świetlnej, aby uzyskać na ekranie ostre kontury arkusza świetlnego.
8. Umieść filtr emisyjny z poczwórną linią (405/488/561/638) w miejscu zarezerwowanym w mikroskopie (kostce).
9. Umieść kamerę EMCCD w porcie wyjściowym mikroskopu.
10. Zamocuj pierwszy ręczny stolik translacyjny na stoliku mikroskopu za pomocą w otworach wywierconych w stoliku mikroskopu. Należy pamiętać, że krawędź stolika translacyjnego musi być umieszczona w odległości około 2 cm od środka stolika mikroskopu, tak aby kuweta była wyśrodkowana poniżej soczewki obiektywu detekcyjnego.
11. Napraw drugi etap ręcznego tłumaczenia na pierwszym. Kierunki obu etapów muszą być prostopadłe (translacje X i Y).
12. Zamocuj stopień piezoelektryczny Z na górze dwóch poprzednich etapów. Należy pamiętać, że zamiast stopnia piezoelektrycznego można użyć stopnia zmotoryzowanego.
13. Zamocuj uchwyt kuwety (patrz rysunek 2) w górnej części stages. Kuweta zostanie zatem umieszczona na przecięciu ścieżki oświetlenia i ścieżki detekcji, które są do siebie prostopadłe.

2. Sprawdzanie arkusza świetlnego

1. Napełnij szklaną kuwetę roztworem fluorescencyjnym i umieść ją na uchwycie próbki na przecięciu dwóch ścieżek optycznych. Arkusz świetlny jest więc widoczny. Musi być poziomy i symetryczny/wyśrodkowany w stosunku do soczewki obiektywu detekcyjnego.
2. Zdejmij cylindryczną soczewkę i uzyskaj obraz, aby zmierzyć grubość arkusza światła. Należy pamiętać, że grubość arkusza światła zależy od apertury numerycznej (NA) soczewki obiektywu oświetlającego (około 3-4 μm dla NA = 0,3). Należy pamiętać, że dla danej soczewki grubość arkusza światła można zwiększyć, zmniejszając rozmiar wiązki wchodzącej przez szczelinę do tylnego otworu. Należy pamiętać, że mikrosfery fluorescencyjne mogą być używane do pomiaru rozdzielczości osiowej i bocznej mikroskopu.
3. Włóż z powrotem cylindryczną soczewkę przed rozpoczęciem eksperymentu.

3. Montaż zarodków C. elegans

Następujące kroki są pokazane na rysunku 3.

1. Za pomocą pisaka do znakowania diamentów wyciąć kawałek szkiełka o wymiarach 10 x 20 x 1 mm.
2. Przygotuj 5% bakto-agar w wodzie, zagotuj go i przechowuj w bloku grzewczym w temperaturze 60 °C.
3. Dodaj 50 μl poli-L-lizyny po jednej stronie wyciętego kawałka szkiełka, pozostaw do wyschnięcia.
4. Umieść szkiełko mikroskopowe na stole i zamocuj je.
5. Porównaj wycięty kawałek szkiełka ze szkiełkiem stałym i dodaj kroplę stopionego agaru na wierzch. Ściśnij agar za pomocą innego czystego szkiełka mikroskopowego, aby uzyskać cienką podkładkę agarową.
6. Poczekaj, aż podkładka agarowa wyschnie przed wyjęciem górnego szkiełka.
7. Odciąć podkładkę agarową z boku szkiełka stałego, aby pozostawić nadmiar około 3 mm agaru i delikatnie usunąć szkiełko stałe.
8. Dodaj 50 μl poli-L-lizyny na agar i pozostaw do całkowitego wyschnięcia.
9. Umieść robaki gravid w podłożu M9 w szkiełku zegarkowym.
10. Przetnij robaki na poziomie sromu skalpelem, aby uwolnić zarodki.
11. Pod lornetką zidentyfikuj zarodki na etapie zainteresowania i zbierz je za pomocą pipety mikrokapilarnej.
12. Umieść zarodki na części agaru pokrytej poli-L-lizyną, która wystaje z wyciętego kawałka szkiełka. Umieść zarodki tuż przy granicy szkiełka. Nie umieszczaj zarodków na granicy agaru, ponieważ nie będą wystarczająco stabilne. Delikatnie usuń płyn, aby zarodki przykleiły się do warstwy poli-L-lizyny.
13. Szybko wyrównaj zarodki, aby uniknąć wysuszenia.
14. Umieść wycięte szkiełko na plastikowej szalce Petriego i delikatnie dodaj podłoże M9, aby przykryć szkiełko.
15. Sprawdź przez lornetkę, czy jaja nadal utknęły na agarze
.

4. Rejestracja rozwoju C. elegans

1. Umieścić poprzedni preparat (wycięte szkiełko, agar i zarodki) w uchwycie na próbkę i umieścić go w kuwecie. Rysunek 4 przedstawia uchwyt domowej roboty, a rysunek 5 przedstawia widok kuwety w kontekście obserwacji.
2. Zamocuj kuwetę na stoliku piezoelektrycznym.
3. Zidentyfikuj położenie zarodków przy jasnym oświetleniu pola.
4. Uruchom domowe oprogramowanie sterujące AOTF, kamerą i stolikiem piezoelektrycznym. Pamiętaj, że można również użyć darmowego oprogramowania, takiego jak mikromenedżer.
5. Wybierz linię i moc lasera (AOTF).
6. Dostosuj położenie arkusza świetlnego za pomocą stolika w 3 kierunkach podtrzymującego soczewkę cylindryczną i soczewkę oświetleniową. Przesuń stolik w kierunku bocznym (X), aby uzyskać najjaśniejszy sygnał. Następnie wyreguluj pozycję Z arkusza świetlnego i pozycję wzdłużną (Y), aby uzyskać najlepszy stosunek sygnału do szumu. Należy pamiętać, że może być konieczne dostosowanie położenia ostrości arkusza świetlnego z jednego zarodka na drugi, aby skorygować różnice w długościach ścieżki światła.
7. Aby uzyskać zdjęcia poklatkowe, wybierz czas ekspozycji, wzmocnienie, czas między dwoma obrazami, a także liczbę obrazów do uzyskania oraz moc lasera. W przypadku akwizycji 2 kolorów wybierz drugą linię lasera. Dwa kolorowe obrazy są rejestrowane kolejno.
8. Aby uzyskać stos z, wybierz również odległość między dwoma wycinkami oraz pozycję początkową i końcową piezoelektryka.

Wyniki

Trzy eksperymenty z rejestracją time-lapse w 3D z trzech różnych szczepów C. elegans ilustrują rodzaj danych, jakie można uzyskać przy użyciu opisanego powyżej zestawu mikroskopu z arkuszem światła. Sprawdziliśmy, że w tych warunkach zarodki rozwijają się z normalną prędkością i przeżywają obrazowanie, co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami wskazującymi, że obrazowanie SPIM powoduje jedynie niski poziom fototoksyczności w zarodkach C. elegans^6,7.

Pierwszy szczep wykazuje ekspresję histonu połączonego z GFP (zuIs178;stIs10024). Rejestracja była prowadzona przez 2 godziny z wykorzystaniem stosu 20 przekrojów (odległość między przekrojami 1 μm) wykonywanych co 37 sec. Rysunek 6 przedstawia jedną płaszczyznę stosu w różnych punktach czasowych. Wyraźnie widoczne są zarówno jądra w fazie interfazy (strzałka), jak i skondensowana chromatyna mitotyczna (grot strzałki).

Drugi szczep wykazuje ekspresję tubuliny połączonej z GFP (ruIs57) oraz histony połączonej z mCherry (itIs37; stIs10226). Rejestracja była prowadzona przez 16 min przy użyciu stosu 20 warstw (odległość między warstwami 1 μm) pobieranych co 105 sec. Rysunek 7 przedstawia różne płaszczyzny stosu oraz różne punkty czasowe. Powiązany film 1 ukazuje rekonstrukcje 3D w 3 kolejnych punktach czasowych. Podczas podziału wrzeciono mitotyczne (zielone) i skondensowane chromosomy (czerwone) są wyraźnie widoczne, co pozwala na śledzenie orientacji podziałów komórkowych podczas rozwoju.

Trzeci szczep wykazuje ekspresję apolipoproteiny VIT-2 połączonej z GFP (pwIs23) oraz mCherry związanej z błoną (ltIs44). Rejestracja była prowadzona przez 25 min przy użyciu stosu 10 warstw (odległość między warstwami 1 μm) pobieranych co 30 sec. Rysunek 8 przedstawia różne płaszczyzny stosu oraz różne punkty czasowe. Można łatwo śledzić szybkie ruchy cząsteczek lipoprotein żółtkowych (zielone) wewnątrz komórek.

Rysunek 1: Układ optyczny SPIM składający się z jednostki oświetlenia i detekcji, widok z przodu i z dołu. W jednostce oświetlenia lasery łączone za pomocą luster dichroicznych wchodzą do AOTF, który niezależnie kontroluje moc każdego lasera. Następnie teleskop powiększa wiązkę 4-krotnie, a peryskop wprowadza ją na wysokość mikroskopu. Soczewka cylindryczna tworzy arkusz światła, który jest refokusowany przez obiektyw oświetlający. Jednostka detekcji jest zintegrowana z mikroskopem prostym i składa się głównie z soczewki detekcyjnej, filtra, soczewki tubusowej oraz EMCCD. Próbka jest umieszczona na przecięciu ścieżek oświetlenia i detekcji. Stolik piezoelektryczny umożliwia przemieszczanie próbki w pionie (Z) w celu akwizycji 3D.

Rycina 2: Uchwyt kuwety. Uchwyt składa się z 3 aluminiowych płytek i jest przykręcony do stopnia piezoelektrycznego. Kuweta szklana jest utrzymywana przez sprężynę (zaznaczona na czerwono).

Rycina 3: Protokół montażu embrionów C. elegans do eksperymentów SPIM. Odcięty kawałek szkła jest powlekany poli-L-lizyną. Na powlekanej powierzchni umieszcza się plaster agarowy. Następnie na plaster agarowy nanosi się poli-L-lizynę. Na koniec embriony C. elegans są ustawiane w rzędzie na powlekonym poli-L-lizyną plastrze agarowym.

Rysunek 4: Uchwyt do próbek. Uchwyt jest dopasowany do wymiarów wewnętrznych kuwety szklanej. Dwie sprężyny (zaznaczone na czerwono) utrzymują szkiełko przedmiotowe (opisane na Rysunku 3). Następnie uchwyt ten umieszcza się wewnątrz kuwety szklanej.

Rysunek 5: Uchwyt próbki w kontekście obserwacyjnym. Zarodki zostają unieruchomione na szkiełku przedmiotowym zgodnie z protokołem przedstawionym na Rysunku 3. Szkiełko jest trzymane przez uchwyt próbki opisany na Rysunku 4. Uchwyt próbki jest włożony do szklanej kuwety, trzymanej przez uchwyt opisany na Rysunku 2. Arkusz światła przebiega poziomo i oświetla zarodki z boku. Obiektyw detekcyjny jest ustawiony pionowo, nad próbką.

Rysunek 6: Nagranie zarodka C. elegans wyrażającego fuzję histonu::GFP. Obrazy pojedynczej płaszczyzny transgenicznego zarodka wyrażającego fuzję histonu::GFP (zuIs178; stIs10024) w różnych punktach czasowych. Obrazy wyekstrahowane z trójwymiarowego nagrania time-lapse: stosy składające się z 20 przekrojów (odległość między przekrojami 1 µm); czas ekspozycji na przekrój: 30 msec; odstęp czasu między stosami: 37 sec; całkowity czas akwizycji: 2 hr. Strzałka: jądro w interfazie, grot strzałki: skondensowana chromatyna mitotyczna. W t = 0 min zarodek znajduje się w stadium 2 komórek, a w t = 120 min zarodek zawiera około 70 komórek, co jest zgodne z normalną prędkością rozwoju (należy zauważyć, że na zdjęciach widoczne są tylko komórki znajdujące się w jednej płaszczyźnie, a nie wszystkie komórki zarodka). Moc oświetlenia wynosiła 30 µW przy 488 nm (mierzona na wyjściu z obiektywu oświetlającego). Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film.

Rysunek 7: Rejestracja zarodka C. elegans wykazującego ekspresję fuzji Tubulin::GFP oraz fuzji Histone::mCherry. Obrazy wyekstrahowane z trójwymiarowego nagrania time-lapse zarodka C. elegans wykazującego ekspresję fuzji Tubulin::GFP (ruIs57) oraz fuzji Histone::mCherry (itIs37 ; stIs10226). Warunki rejestracji: akwizycja stosu 20 przekrojów (odległość między przekrojami 1 µm) co 105 sec; całkowity czas akwizycji: 16 min; czas ekspozycji: 200 msec dla każdego kanału. Panel a przedstawia 10 przekrojów z tego samego stosu. Panel b przedstawia ten sam przekrój co 210 sec. Moc oświetlenia wynosiła odpowiednio 30 µW i 300 µW dla laserów 488 i 561 nm (mierzona na wyjściu obiektywu oświetlającego). Kliknij tutaj, aby obejrzeć to wideo.

Rycina 8: Rejestracja zarodka C. elegans wyrażającego fuzję VIT-2::GFP oraz mCherry skierowaną do błony komórkowej. Obrazy wyodrębnione z 3D time-lapse rejestracji zarodka C. elegans wyrażającego fuzję VIT-2::GFP (pwIs23) oraz mCherry skierowaną do błony komórkowej (ltIs44). Warunki rejestracji: akwizycja stosu 10 warstw (odległość między warstwami 1 µm) co 30 sec; całkowity czas akwizycji: 25 min; czas ekspozycji na kanał: 200 msec. Panel a przedstawia 5 pierwszych warstw tego samego stosu. Panel b przedstawia tę samą warstwę co 30 sec. Kliknij tutaj, aby obejrzeć to wideo.

Dyskusja

Protokół ten opisuje łatwą konfigurację mikroskopii arkuszowej światła do obrazowania in vivo zarodków C. elegans . Elementy optyczne niezbędne do stworzenia i wyrównania arkusza świetlnego, w tym lasery, ekspander wiązki, soczewki kolimacyjne i skupiające, można łatwo zamontować na stole optycznym. W połączeniu z pionowym mikroskopem dla ścieżki detekcji i kamerą zapewnia to proste rozwiązanie do konfiguracji mikroskopu z arkuszami świetlnymi.

Ta geometria sprawia, że przykładowe środowisko jest proste. Żywy okaz umieszcza się w szklanej kuwecie, która jest trzymana, ustawiana i przesuwana przez mały zestaw mechanicznych elementów. Ponieważ mikroskopia oświetlenia arkuszy jest techniką szerokokątną z możliwością cięcia, do obrazowania 3D wymagany jest tylko jednoosiowy ruch zmotoryzowany. Ogranicza to wymóg synchronizacji do jednego elementu skanującego i ułatwia tworzenie oprogramowania. W porównaniu z iSPIM⁶ nasza pionowa geometria pozwala na użycie soczewki obiektywu o wysokiej NA do detekcji. W porównaniu z konfiguracjami SPIM z soczewkami obiektywowymi w płaszczyźnie poziomej, montaż próbki i obrazowanie serii zarodków są łatwiejsze. Ogólnie rzecz biorąc, wdrożenie tej techniki jest proste i można je osiągnąć przy niewielkiej wiedzy z zakresu optyki. Jest to tańsza alternatywa dla mikroskopów konfokalnych, której zaletą jest większa prędkość i zmniejszona fototoksyczność, ale wadą jest niższa rozdzielczość osiowa.

Opracowaliśmy również łatwy i powtarzalny sposób montowania zarodków C. elegans do obrazowania in vivo za pomocą tego systemu. Procedura montażu jest szybka (15 min) i nadaje się do codziennych eksperymentów. W przypadku obrazowania C. elegans zalety tej prostej konfiguracji są co najmniej dwojakie: (i) obrazowanie in toto jest możliwe bez rotacji, a zatem rekonstrukcja 3D jest prosta; (ii) montaż próbki jest łatwy, a wiele zarodków można sekwencyjnie obrazować na tym samym szkiełku. Pokazaliśmy przykłady filmów poklatkowych z wystarczającą rozdzielczością czasową, aby zaobserwować podziały komórek i zmiany kształtu komórek. Moc mikroskopii arkuszowej światła w badaniu rozwoju C. elegans została również niedawno zilustrowana przez innych^{6, 7, 8}. Dlatego ta technika będzie bardzo przydatna do badania morfogenezy i wzorca zarodka C. elegans .

Czy system ten może być również wykorzystywany do analizy rozwoju innych organizmów modelowych? Ważne jest, aby zdać sobie sprawę, że wdrożenie mikroskopii oświetlenia arkuszowego dla małych i przezroczystych organizmów, takich jak C. elegans, jest mniej rygorystyczne niż dla większych organizmów, takich jak zarodki Drosophila . Obrazowanie in toto Drosophila zwykle wymaga rekonstrukcji rotacyjnych i wielowidokowych^{9, 10}. Wzbudzenie z dwóch stron za pomocą współliniowych soczewek obiektywowych wzbudzenia może również zmniejszyć efekty cienia spowodowane tłumieniem światła¹¹. Jednak przedstawiona tutaj konfiguracja jest nadal przystosowana do obrazowania jednej strony zarodków Drosophila , z niskim poziomem bielenia i niską fotoksycznością. Ta konfiguracja może być również przydatna do obrazowania małych i przezroczystych zarodków, takich jak workowate lub danio pręgowany.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
SPIM
Pionowy mikroskop detekcyjny
	Obiektyw ZEISS	Axiophot 1
100x W (NA 1.1, W.D. 2.5mm)	NIKON
EMCCD podświetlany tylnie	ANDOR	DU-885K-CS0-#VP
Illumination
LASER 488 nm / 60 mW	TOPTICA	iBeam smart
LASER 405 nm / 120 mW	TOPTICA	iBeam smart
LASER 561 nm / 500 mW	COBOLT	JIVE 500	do obrazowania poklatkowego wystarczy filtr 50 lub 100 mW
Poczwórny liniowy laser odrzucający ZET 405/488/561/638	AHF	F57-405
Dichroic 405	AHF	F38-405
Dichroic 488	SEMROCK	Di01-R488
AOTF	AA	AOTFnC-400.650-TN
lustrzana soczewka 50
mm	THORLABS		teleskop 5X
obiektyw 200 mm	THORLABS		teleskop 5X
peryskop	THORLABS	RS99/M
soczewka cylindryczna f=100mm	THORLABS	ACY254-100-A
10X NA 0,3	NIKON
xyz stage	NEWPORT
Próbka
Bacto Agar	Bectkton Dickinson	214010	5% w wodzie
roztwór poli-L-lizyny	Sigma	P8920
Kapilary GC100F-10, 1.0mm ød, 0,58mm ID, 100 mm L	Havard Appartus	30-0019
Rurka aspiracyjna (pipeta doustna)	Dutsher	55005
M9 medium:
KH2PO4 (3g/L)	Dowolny dostawca
Na2HPO4 (6g/L)	Dowolny dostawca
NaCL (5g/L)	Dowolny dostawca
MgSO4 (1 mM final)	Dowolny dostawca
uchwyt na kuwetę	HOME MADE		made by Brice Detailleur
uchwyt na próbki	HOME MADE		wykonany przez Claude'a Morettiego
x stage	NEWPORT
szkiełko nakrywkowe 50x20x1 mm	MARIENFELD		następnie cięte w 10x20x1mm
stolik piezoelektryczny ze wzmacniaczem/sterownikiem	PI	P-622. Kuweta ZCD / E-625.CR
40mmx40mmx10mm	HELLMA	704.002-OG.40 mm- Ołówek
	VWR
Software
C++ (Qt) domowe oprogramowanie			opracowane przez Oliviera Blanca i Claire Chardè s, dostępne na zamówienie. Alternatywne rozwiązania: mikromenedżer lub labview