Tutaj opisujemy protokół wykorzystujący mutagenezę za pośrednictwem transpozonu mini-himar1 mariner do generowania biblioteki mutantów insercyjnych o wysokiej gęstości do badania, izolacji i identyfikacji nowych regulatorów alginianu w prototypowym szczepie Pseudomonas aeruginosa PAO1.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Identyfikacja nowych genów związanych z produkcją alginianów u Pseudomonas aeruginosa przy użyciu mutagenezy za pośrednictwem transpozonu Mini-himar1 Mariner
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pseudomonas aeruginosa to Gram-ujemna, środowiskowa bakteria o wszechstronnych zdolnościach metabolicznych. P. aeruginosa jest oportunistycznym patogenem bakteryjnym, który wywołuje przewlekłe infekcje płuc u pacjentów z mukowiscydozą (CF). Nadprodukcja polisacharydu otoczkowego zwanego alginianem, znanego również jako śluzówka, sprzyja tworzeniu biofilmów śluzowych, które są bardziej odporne niż komórki planktonowe na chemioterapię antybiotykową i obronę gospodarza. Dodatkowo, konwersja z fenotypu nieśluzowego do mukowisowego jest klinicznym markerem początku przewlekłego zakażenia w mukowiscydozie. Nadprodukcja alginianów przez P. aeruginosa jest procesem endergonicznym, który silnie obciąża energię komórkową. Dlatego produkcja alginianów jest wysoce regulowana u P. aeruginosa. Aby lepiej zrozumieć regulację alginianów, opisujemy protokół wykorzystujący mutagenezę transpozonów mini-himar1 do identyfikacji nowych regulatorów alginianów w prototypowym szczepie PAO1. Procedura składa się z dwóch podstawowych kroków. Najpierw przenieśliśmy transpozon mini-himar1 (pFAC) z gospodarza E. coli SM10 / λpir do biorcy P. aeruginosa PAO1 poprzez koniugację dwurodzicielską, aby stworzyć bibliotekę mutantów insercyjnych o dużej gęstości, które zostały wybrane na płytkach agarowych do izolacji Pseudomonas uzupełnionych gentamycyną. Po drugie, przeprowadziliśmy badania przesiewowe i wyizolowaliśmy kolonie śluzówki, aby zmapować miejsce insercji poprzez odwrotny PCR przy użyciu starterów DNA skierowanych na zewnątrz z kasety gentamycyny i sekwencjonowania DNA. Korzystając z tego protokołu, zidentyfikowaliśmy dwa nowe regulatory alginianu, mucE (PA4033) i kinB (PA5484), w szczepie PAO1 z mucA typu dzikiego kodującym czynnik anty-sigma MucA dla głównego regulatora alginianu AlgU (AlgT, σ22). Ten wysokoprzepustowy protokół mutagenezy może być modyfikowany w celu identyfikacji innych genów związanych ze zjadliwością, powodujących zmiany w morfologii kolonii.
Wprowadzenie
Zdolność oportunistycznego, Gram-ujemnego patogenu Pseudomonas aeruginosa do nadprodukcji alginianu jest głównym czynnikiem wpływającym na jego zdolność do tworzenia biofilmu. Nadprodukcja alginianu jest fenotypem często określanym jako śluzówka. Izolacja kolonii śluzowatych z plwociny osób dotkniętych mukowiscydozą (CF) wskazuje na przewlekłą infekcję i jest bezpośrednio związana z ogólnym pogorszeniem stanu zdrowia pacjenta1. Obecnie przyjmuje się, że regulacja i produkcja alginianu u P. aeruginosa zachodzi głównie w dwóch operonach. Pierwszym z nich jest operon biosyntetyczny alginianu, który zawiera 12 genów (algD-alg8-alg44-algK-algE-algG-algX-algL-algI-algJ-algF-algA), które są odpowiedzialne za syntezę i eksport polimeru alginianowego przez peryplazmę do środowiska zewnątrzkomórkowego2-5. Drugi operon to klaster genów rozpoczynający się od alternatywnego czynnika sigma algU/T i kontynuowany przez mucA, mucB i mucD. AlgU/T jest regulatorem dodatnim, podczas gdy mucAB-D są klasyfikowane jako ujemne regulatory produkcji alginianów6-8. Ponadto wykazano również, że regulatory transkrypcji, takie jak AlgB, AlgQ, AlgR i RpoN, a także modyfikacja potranskrypcyjna i potranslacyjna poprzez kontrolę represji katabolitu, aktywność kinazy (KinB) i proteolizę wewnątrzbłonową, są również zaangażowane w regulację alginianów9-14.
Wektor transpozonu mini-himar1 znany jako pFAC został pierwotnie stworzony w laboratorium dr Mekalanosa w Harvard Medical School15. Plazmid pFAC składa się z transpozycyjnego elementu otoczonego dwoma odwróconymi powtórzeniami 27 bps i kasetą oporności na gentamycynę pośrodku (aacC1: 534 bp), genu kodującego nadpobudliwą transpozazę marynarza 16 i genu kodującego β-laktamazę (bla) (ryc. 1). Informacje o sekwencji dla elementu transpozycyjnego pFAC są dostępne pod numerem dostępu do GenBank:DQ366300 13. W pFAC za genem aacC1 znajduje się miejsce wielokrotnego klonowania (MCS), które służy do identyfikacji miejsca insercji chromosomu za pomocą odwrotnej reakcji PCR. Jedną z głównych zalet stosowania transpozonu mini-himar1 jest to, że do transpozycji (mutagenezy) nie są wymagane żadne specyficzne czynniki gospodarza. Ponadto w całym genomie P. aeruginosa występuje duża obfitość miejsc insercji dinukleotydów TA. Na przykład miejsca insercji dinukleotydów TA występują 94 404 i 100 229 razy w PAO1 (6 264 404 bps, numer akcesyjny GenBank NC_002516,2) i PA14 (6 537 648 bps; GenBank numer dostępu NC_008463) genomów, odpowiednio. Ze względu na obfitość dinukleotydu TA w genomie, transpozon mini-himar1 może powodować mutagenezę o dużej gęstości i losową, co jest szczególnie przydatne do analizy genów wirulencji i genów, które są wysoce regulowane. Teoretycznie transpozon mini-himar1 może wprowadzić się do dowolnego nieistotnego genu w genomie P. aeruginosa. Zapewnia to około 18 miejsc insercji TA na otwartą ramkę odczytu w genomie PAO1.
Tutaj opisujemy protokół wykorzystujący mutagenezę za pośrednictwem transpozonów mini-himar1 do identyfikacji nowych regulatorów śluzowości u P. aeruginosa. Mówiąc dokładniej, dwustronnie skoniugowaliśmy wektor pFAC zawierający transpozon mini-himar1 z E. coli SM10 / λpir do nieśluzowatego szczepu prototroficznego PAO1. Po zintegrowaniu transpozonu z genomem, szczep biorcy jest hodowany na agarze izolacyjnym Pseudomonas (PIA) zawierającym triklosan, który hamuje wzrost E. coli. W ten sposób biblioteka mutantów P. aeruginosa może być wybrana na podstawie wzrostu na płytce PIA uzupełnionej gentamycyną i obecności fenotypu śluzowatego. Należy zauważyć, że prawdziwy mutant za pośrednictwem transpozonu w porównaniu z mutantem integracyjnym będzie miał fenotyp oporny na gentamycynę i wrażliwy na karbenicylinę. W tym badaniu około 80 000 mutantów insercyjnych PAO1 wyizolowano za pomocą czterech oddzielnych koniugacji. Następnie przeprowadziliśmy badania przesiewowe pod kątem izolatów śluzowych i określiliśmy miejsce insercji poprzez trawienie enzymem restrykcyjnym, ligację i odwrotną reakcję PCR. Przeprowadziliśmy analizę Southern blot przy użyciu kasety oporności na gentamycynę jako sondy, aby zobaczyć liczbę insercji w genomie. Ustaliliśmy, że ponad 90% mutantów uzyskanych w konsumacji przy użyciu tego protokołu miało tylko jedną kopię himar1 w genomie i wykazywało fenotyp oporny na gentamycynę i wrażliwy na karbenicylinę. Zidentyfikowano łącznie 32 izolaty śluzówki, z których 22 zmapowano do różnych loci chromosomu PAO1 P. aeruginosa. Ta szybkość insercji zapewnia odpowiednie pokrycie w celu zidentyfikowania kilku nowych regulatorów nadprodukcji alginianów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie szczepów bakteryjnych i koniugacja oburodzicielska
- Zaszczepić E. coli SM10/λpir/pFAC w 5 ml bulionu Luria (LB) uzupełnionego 15 μg/ml gentamycyny i umieścić na noc w inkubatorze do wytrząsania w temperaturze 37 °C.
- Zaszczepić szczep PAO1 P. aeruginosa w 5 ml LB i umieścić na noc w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 42 °C.
- Odmierzyć OD600 z nocnych kultur i wymieszać równe ilości PAO1 i E. coli pFAC tak, aby końcowa objętość wynosiła od 1 do 1,4 ml.
- Odwirować mieszaninę przy 6 000 x g przez 5 min.
- W międzyczasie wysuszyć płytki LB do koniugacji: pozostawić płytki otwarte w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 10-15 minut.
- Usunąć wszystkie z wyjątkiem 50 μl supernatantu z mieszaniny komórek.
- Zawiesić osad komórek w pozostałych 50 μl supernatantu i odpipetować na suchej płytce LB w jednej zwartej kropli.
- Ostrożnie umieść płytkę w dygestorium do wyschnięcia (WAŻNA UWAGA: Nie pozwól, aby komórki rozprzestrzeniły się po płytce, znacznie zmniejszy to skuteczność koniugacji).
- Gdy kropla wyschnie, odwrócić płytkę LB i inkubować w temperaturze 37 °C przez 4-6 godzin.
- Podczas inkubacji mieszaniny komórek przygotuj duże (150 ø zewnętrzna x 15 mm) płytki PIA z 300 μg/ml gentamycyny. Przed użyciem należy usunąć resztki wilgoci, umieszczając je w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 15-20 minut.
- Po zakończeniu inkubacji mieszaniny komórek, zebrać komórki za pomocą sterylnej pętli inokulacyjnej i w probówce mikrowirówki zawierającej 1 ml LB i wirówkę lub pipetę, w celu dokładnego wymieszania.
- Rozłóż komórki równomiernie na dużych płytkach PIA zawierających 300 μg/ml gentamycyny. (WAŻNE: Na tym etapie najlepiej jest dodawać coraz większe objętości mieszaniny komórek do oddzielnych płytek (np. Płytka 1: 10 μl, Płytka 2: 50 μl, Płytka 3: 100 μl, Płytka 4: 500 μl itp.).
- Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
2. Wykrywanie i izolacja kolonii śluzowatych
- Wyjąć płytki z inkubatora i sprawdzić, czy nie ma kolonii śluzów.
- Wyizolować pojedynczą kolonię śluzów i smugę do izolacji na małych płytkach (100 ø zewnętrzna x 10 mm) za pomocą PIA i 300 μg/ml gentamycyny.
- Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
- Powtórz krok 2.2 na poprzedniej hodowli przez noc.
- Powtórz kroki 2.2-2.4 jeszcze dwa razy, aby określić stabilność izolatu śluzówki.
- Po ostatnim etapie izolacji zaszczepić 4,5 ml LB pojedynczą kolonią śluzów i inkubować w wytrząsarce przez noc w temperaturze 37 °C.
- Następnego dnia oznacz 3 probówki do mikrowirówek dla każdego mutanta śluzowego.
- Przygotować dwie porcje 1,25 ml hodowli przez noc do 2 probówek w celu ekstrakcji genomowego DNA i identyfikacji miejsca insercji transpozonu (patrz Protokół 3).
- Dodatkowo zarchiwizuj każdy mutant śluzowy, pipetując 1 ml kultury przez noc do odpowiednio oznakowanego kriowialu zawierającego równą objętość 10% odtłuszczonego mleka. Przechowywać w temperaturze -86 °C.
3. Trawienie i ligacja gDNA
- Ekstrahować gDNA z mutanta śluzowatego przy użyciu dowolnej preferowanej metody (np. fenol-chloroform, kolumna wirowa itp.).
- Oznaczyć stężenie gDNA, strawić łącznie 2 μg z 1 μl endonukleazy restrykcyjnej SalI, 0,5 μl albuminy surowicy bydlęcej, 5 μl buforu enzymatycznego SalI (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM Ditionitrietol (DTT), pH 7,9 w temperaturze pokojowej) i odpowiednią objętością dH2O, aby uzyskać całkowitą objętość 50 μl.
- Trawić DNA przez noc w temperaturze 37 °C. (WAŻNE: W zależności od skuteczności enzymu restrykcyjnego może być konieczne dodanie dodatkowego 1 μl do nocnego trawienia i inkubacja w temperaturze 37 °C przez 1-2 godziny. Jest to dodatek do nocnego trawienia.)
- Oczyścić strawione DNA przy użyciu dowolnej preferowanej metody (np. oczyszczanie w żelu agarozowym, kolumny wirowe) i eluować za pomocą 25 μl buforu.
- Zligować strawione DNA mieszając 11 μl oczyszczonego DNA o preferowanym stężeniu ~10-20 ng/μl, 1,5 μl buforu ligacyjnego (330 mM octan trisu pH 7,5, 660 mM octan potasu, 100 mM octan magnezu, 5 mM DTT), 1,5 μl 100 mM ATP i 1 μl ligazy DNA.
- Inkubować mieszaninę przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dezaktywować enzym przez inkubację przez 15 minut w temperaturze 70 °C. (Uwaga: Inkubacja mieszaniny w temperaturze pokojowej przez dłuższy czas może zwiększyć powodzenie ligacji).
4. Odwrócony PCR (iPCR) i analiza sekwencyjna
- Przeprowadzić iPCR na produkcie ligacji, stosując następujące startery do przodu i do tyłu oraz warunki termocyklingu:
-Podkład do przodu (Gm3OUT): GGGCATACGGGAAGAAGTGA
-Odwrócony podkład (Gm5OUT): GACTGCCCTGCTGCGTAACA
Warunki termocyklera:
1. 94 °C przez 1 min.
2. 94 °C przez 1 minutę
3. 58 °C przez 2 min.
4. 72 °C przez 2 min.
5. 72 °C przez 8 minut
6. 10 °C przytrzymaj
Powtórz kroki 2-4 przez 34 cykle.
(UWAGA: Amplifikowane produkty iPCR mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C.) - Wykonaj elektroforezę w żelu agarozowym, aby potwierdzić pomyślną amplifikację iPCR.
- Wykonaj sekwencjonowanie produktu iPCR przy użyciu starterów Gm3OUT i Gm5OUT. Miejsce wprowadzenia i orientacja himar1 są odwzorowane.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Jak pokazano na Rysunku 1, mini-wektor transpozycyjny mariner himar1, pFAC, zawiera dwie odwrócone powtórzenia o długości 27 bp z miejscami insercyjnymi TA flankującymi kasetę oporności na gentamycynę aacC1 z zależnym od σ70 promotorem oraz wielomiejscowy klonowanie (MCS). Dodatkowo wektor pFAC zawiera geny kodujące wysoce aktywną transpozazę himar1, β-laktamazę (bla) oraz operon transferowy tra. Miejsca insercyjne TA umożliwiają efektywną integracj...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ważne jest, aby zauważyć, że metoda ta może być stosowana u innych gatunków Pseudomonas z tymi zmianami: inkubować P. fluorescens i P. putida w temperaturze 30 °C, a P. stutzeri w temperaturze 42 °C; P. stuzeri należy hodować na płytkach LB uzupełnionych 150 μg/ml gentamycyny; w kroku 1.11 komórki P. stutzeri należy przenieść do 500 μl LB zamiast 1 ml. Ponadto istnieją dwa krytyczne kroki dla tego protokołu. Po pierwsze, szczep biorcy powinien być hodowany w odpowiedn...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autor Hongwei D. Yu jest dyrektorem naukowym i współzałożycielem Progenesis Technologies, LLC.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez National Aeronautics and Space Administration West Virginia Space Grant Consortium (NASA WVSGC), Cystic Fibrosis Foundation (CFF-YU11G0) oraz NIH P20RR016477 i P20GM103434 do West Virginia IDeA Network for Biomedical Research Excellence. Dziękujemy Vonyi M. Eisinger za pomoc techniczną w tej pracy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Bulion Luria | Difco | 240230 | przez Fisher Scientific |
| Pseudomonas agar izolacyjny | Difco | 292710 | przez Fisher Scientific |
| Małe płytki (100 OD x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Duże talerze (150 OD x 15 mm) | Fisher Scientific | 08-757-14 | |
| Glicerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| Inkubator laboratoryjny z wytrząsaniem | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | wstrząs z prędkością 200 obr./min |
| Inkubator szafkowy | VWR | 1540 | |
| Mikrowirówka stołowa | Sorvall | 75-003-287 | za pośrednictwem |
| spektrofotometru Fisher Scientific SmartSpec Plus | Bio-Rad | 170-2525 | lub preferowana metoda/dostawca |
| Jednorazowe pętle do inokulacji | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| 1,5 ml probówki do mikrowirówek | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2,0 ml fiolki kriogeniczne | Corning | 430659 | przez Fisher Scientific |
| 15 ml Probówki | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Odtłuszczone mleko | Difco | DF0032-17-3 | przez Fisher Scientific |
| DNłatwa krew i tkanki (250) | Qiagen | 69506 | lub preferowana metoda/dostawca |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | lub preferowana metoda/dostawca |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | lub preferowana metoda/dostawca |
| Zestaw do ligacji DNA FastLink II | Epicentre Technologies | LK6201H | za pośrednictwem Fisher Scientific |
| Acu block Cyfrowa sucha kąpiel | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Sal1, endonukleaza restrykcyjna | New England BioLabs | R0138L | |
| EasyStart Micro 50 | Molecular BioProducts | 6020 | przez Fisher Scientific |
| Taq DNA Polimeraza New | England BioLabs | M0267L | |
| iCycler, Termocykler | Bio-Rad | 170-8740 | |
| LE agaroza | Genemate | 3120-500 | przez Fisher Scientific |
| Siarczan gentamycyny | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| 2,0 ml Fiolki kriogeniczne | Corning | 430659 | przez Fisher Scientific |
Bibliografia
- Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiol. Rev. 60, 539-574 (1996).
- Chitnis, C. E., Ohman, D. E. Genetic analysis of the alginate biosynthetic gene cluster of Pseudomonas aeruginosa shows evidence of an operonic structure. Mol. Microbiol. 8, 583-593 (1993).
- Franklin, M. J., et al. Pseudomonas aeruginosa AlgG is a polymer level alginate C5-mannuronan epimerase. J. Bacteriol. 176, 1821-1830 (1994).
- Franklin, M. J., Ohman, D. E. Mutant analysis and cellular localization of the AlgI, AlgJ, and AlgF proteins required for O acetylation of alginate in Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 184, 3000-3007 (2002).
- Deretic, V., Gill, J. F., Chakrabarty, A. M. Gene algD coding for GDPmannose dehydrogenase is transcriptionally activated in mucoid Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 169, 351-358 (1987).
- Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN). J. Bacteriol. 179, 3711-3720 (1997).
- Boucher, J. C., Schurr, M. J., Yu, H., Rowen, D. W., Deretic, V. Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis: role of mucC in the regulation of alginate production and stress sensitivity. Microbiology. 143, 3473-3480 (1997).
- Martin, D. W., Holloway, B. W., Deretic, V. Characterization of a locus determining the mucoid status of Pseudomonas aeruginosa: AlgU shows sequence similarities with a Bacillus sigma factor. J. Bacteriol. 175, 1153-1164 (1993).
- Damron, F. H., Goldberg, J. B. Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa. Mol. Microbiol. 84 (4), 595-607 (2012).
- Browne, P., Barret, M., O'Gara, F., Morrissey, J. P. Computational prediction of the Crc regulon identifies genus-wide and species-specific targets of catabolite repression control in Pseudomonas bacteria. BMC Microbiol. 10, 300 (2010).
- Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis. J. Bacteriol. 191, 2285-2295 (2009).
- Damron, F. H., et al. Analysis of the Pseudomonas aeruginosa regulon controlled by the sensor kinase KinB and sigma factor RpoN. J. Bacteriol. 194, 1317-1330 (2012).
- Qiu, D., Eisinger, V. M., Rowen, D. W., Yu, H. D. Regulated proteolysis controls mucoid conversion in Pseudomonas aeruginosa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 8107-8112 (2007).
- Schurr, M. J. Which bacterial biofilm exopolysaccharide is preferred, Psl or alginate. J. Bacteriol. 195, 1623-1626 (2013).
- Wong, S. M., Mekalanos, J. J. Genetic footprinting with mariner-based transposition in Pseudomonas aeruginosa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10191-10196 (2000).
- Lampe, D. J., Akerley, B. J., Rubin, E. J., Mekalanos, J. J., Robertson, H. M. Hyperactive transposase mutants of the Himar1 mariner transposon. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 11428-11433 (1999).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
