Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie pierwotnych miogennych kultur komórek prekursorowych/mioblastów z bazalnych linii kręgowców

20.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51354

⸱

30 kwietnia 2014

 ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Alabama at Birmingham, 2Nutrition Métabolisme Aquaculture, INRA UR1067, 3Laboratoire de Physiologie et Genomique des Poissons, INRA UR1037

W tym artykule

Podsumowanie

Systemy hodowli in vitro okazały się niezbędne dla naszego zrozumienia miogenezy kręgowców. Jednak wiele pozostaje do nauczenia się na temat rozwoju i wzrostu mięśni szkieletowych innych niż ssaki, szczególnie w taksonach podstawowych. Skuteczny i solidny protokół izolowania dorosłych komórek macierzystych tej tkanki, miogennych komórek prekursorowych (MPC) i utrzymywania ich samoodnawiania, proliferacji i różnicowania w warunkach hodowli pierwotnej, pozwala na identyfikację konserwatywnych i rozbieżnych mechanizmów regulacyjnych w całej linii kręgowców.

Streszczenie

Ze względu na nieodłączną trudność i czas związany z badaniem programu miogennego in vivo, pierwotne systemy hodowlane pochodzące z rezydentnych dorosłych komórek macierzystych mięśni szkieletowych, miogennych komórek prekursorowych (MPC), okazały się niezbędne dla naszego zrozumienia rozwoju i wzrostu mięśni szkieletowych ssaków. Jednak szczególnie wśród podstawowych taksonów kręgowców dane opisujące mechanizmy molekularne kontrolujące samoodnowę, proliferację i różnicowanie MPC są ograniczone. Szczególnie interesujące są potencjalne mechanizmy, które leżą u podstaw zdolności podstawowych kręgowców do przechodzenia znacznego przerostu włókien szkieletowych po larwach (np. ryb teleostowych) i pełnej regeneracji po utracie przydatków (np. urodele). Ponadto zastosowanie hodowanych mioblastów może pomóc w zrozumieniu regeneracji i podsumowania programu miogennego oraz różnic między nimi. W tym celu szczegółowo opisujemy solidny i skuteczny protokół (i jego odmiany) do izolowania i utrzymywania MPC i ich potomstwa, mioblastów i niedojrzałych miotub, w hodowli komórkowej jako platformę do zrozumienia ewolucji programu miogennego, zaczynając od bardziej podstawowych kręgowców. Opierając się na modelowym statusie organizmu danio pręgowanego (Danio rerio), przedstawiamy informacje na temat zastosowania tego protokołu do małych ryb z kladu karpiowatych Danioninae. W połączeniu protokół ten może być wykorzystany do realizacji szerszego podejścia porównawczego poprzez izolację MPC od meksykańskiego aksolotla (Ambystomamexicanum), a nawet gryzoni laboratoryjnych. Protokół ten jest obecnie szeroko stosowany w badaniu miogenezy u kilku gatunków ryb, w tym pstrąga tęczowego, łososia i dorady1-4.

Wprowadzenie

Znaczne zrozumienie miogenezy ssaków uzyskano dzięki rekapitulacji tego procesu zarówno w pierwotnych hodowlach mysich (Mus musculus), jak i w dobrze opisanej linii komórkowej pochodzącej od myszy, C2C125. Począwszy od lat pięćdziesiątychXX wieku, kultury te doprowadziły do znacznego postępu w zrozumieniu programu mysiego, a co za tym idzie, miogenezy u innych kręgowców. Ponadto techniki eksplantacji włókien miokomórkowych z pojedynczych komórek zwiększyły zrozumienie interakcji między komórkami satelitarnymi a otaczającymi włóknami mięśniowymi7-9. Hodowle komórkowe są szczególnie atrakcyjne do badań miogenezy ze względu na krótki czas od komórki prekursorowej do komórki zróżnicowanej10, względną łatwość transfekcji RNAi11-14, transgeniczne15,16 i badania nadekspresji14,17,18 , ekspansję in vitro, a następnie przeszczep in vivo 18-20, a nawet porównanie miogennych komórek prekursorowych i ich czynników regulujących w taksonach21,22. Chociaż opisano różnice wynikające ze sztucznego środowiska systemu hodowli5,23 , te systemy in vitro okazały się niezbędne do naszej analizy skomplikowanego programu rządzącego tworzeniem wielojądrowych, ostatecznie zróżnicowanych włókien mięśniowych z monojądrowych proliferacyjnych komórek progenitorowych znanych jako komórki miosatelitarne (MSC) wśród ssaków.

Poza klasą Mammalia, zachowanie i/lub rozbieżność mechanizmów kontrolujących miogenezę są słabo poznane, głównie z powodu trudności w hodowli miogennych komórek prekursorowych (MPC) i mioblastów z różnych taksonów. Rzeczywiście, pierwotne kultury mioblastów opisano tylko u trzech ptakóww wieku 24-26 lat, jednego27, kilkuw wieku 28-30 lat i niektórych rybw wieku 1,3,4,31-33 lat. Ciągłe miogenne linie komórkowe od kręgowców innych niż gryzonie34-36są jeszcze rzadsze, a jedyna niessakowa linia komórek miogennych pochodzi z przepiórki japońskiej (Cortunix japonica), QM737. Pomimo wielu prób unieśmiertelnienia, teleostyczna miogenna linia komórkowa pozostaje nieuchwytna, a protokół skutecznej transfekcji tych komórek został opublikowany dopiero w tym roku15. W związku z tym jasne i dobrze zoptymalizowane protokoły hodowli pierwotnych MPC i mioblastów od różnych kręgowców są bardzo potrzebne, aby nie tylko dalej poszerzać naszą wiedzę na temat ewolucji programu miogennego, ale także wykorzystywać moc fizjologii porównawczej do dokonywania przełomów w leczeniu chorób i zaburzeń mięśni szkieletowych u ludzi.

Chociaż literatura zawiera wiele doniesień o izolacji MPC/mioblast38-49, często zdarza się, że autorzy opisują protokoły takich izolacji w krótkich, często niekompletnych formatach. Co więcej, najbardziej pouczające protokoły zostały opracowane dla myszy50-53, a niektóre z nich opierają się na selekcji przeciwciał54,55 lub transgenach fluorescencyjnych56,57, co czyni te protokoły bezużytecznymi lub niepraktycznymi w większości gatunków niebędących gryzoniami wykorzystywanych przez biologów mięśniowych. Ponieważ niewiele wiadomo na temat miogenezy ryb, i, szczegółowy i dokładny protokół, opisany pod wskazówkami audiowizualnymi i wykazany z wykazaną skutecznością u daleko spokrewnionych gatunków, byłby najbardziej pomocny w terenie.

Po raz pierwszy opisany przez Powella i współpracowników w 1989 roku58, początkowo opracowano następujący protokół do izolowania MPC i mioblastów od ryb łososiowatych (mianowicie pstrąga tęczowego, Oncorhynchus mykiss, i łososia atlantyckiego, Salmo salar) oraz niektórych większych karpiowatych (np. złotej rybki, Carassiusauratusauratus). W 2000 roku Fauconneau i Paboeuf zoptymalizowali pierwotną hodowlę mioblastów dla pstrąga tęczowego59, a drobne optymalizacje sprawiły, że protokół ten stał się możliwy do zastosowania u kilku mniejszych rybek z kladu Danioninae (danio pręgowany, Danio rerio i danio olbrzymi, Devario aequipinnatus)32 ze względu na wiele narzędzi genetycznych dostępnych dla pracy danio pręgowanego, a tym samym jego bliskich krewnych. Ryby teleost są atrakcyjnymi organizmami do badań ze względu na ich rozbieżną strategię wzrostu (przynajmniej u większości gatunków). Duże łososie, podobnie jak większość ryb, rosną w nieskończoność, z potencjałem wzrostu nieskrępowanym asymptotą w okresie dojrzałości, nawet w starszym wieku60-62 lata. W przeciwieństwie do danio pręgowanego, duże danioniny, takie jak gigantyczny danio63 i wąsaty danio, wykazują potencjał wzrostu typowy dla ryb teleostowych, co sprawia, że ich bezpośrednie zestawienie jest idealną platformą do zrozumienia, czy wybór losu komórek MPC odgrywa rolę w hiperplazji mięśni szkieletowych w porównaniu z hipertrofią.

Podobnie, wykazaliśmy, że ten protokół może być stosowany u myszy i aksolotlów, o stosunkowo wysokiej wydajności komórek i wskaźnikach żywotności. Salamandry urodele, takie jak aksolotl meksykański (Ambystomamexicanum), posiadają niezwykłą zdolność do regeneracji tkanek, w tym całych kończyn i ogonów64-66. Ta cecha sprawia, że te są interesującymi modelami zaniku i starzenia się mięśni szkieletowych. Korzystając z opisanego poniżej protokołu, można zastosować podobne podejście, jak to miało miejsce w przypadku wielu gatunków ryb, zapewniając jeszcze szerszy kontekst porównawczy dla takich badań. Wielu prawdziwych biologów porównawczych zdaje sobie sprawę, że najbardziej znaczące postępy w biologii podstawowej i biomedycynie translacyjnej można osiągnąć, gdy dane są analizowane w najszerszym spektrum (w tym przypadku całej linii kręgowców).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Wszystkie eksperymenty z udziałem kręgowców opisane tutaj zostały wcześniej zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Alabama w Birmingham i są zgodne z wytycznymi ustalonymi przez Biuro ds. Dobrostanu Zwierząt Laboratoryjnych, Narodowe Instytuty Zdrowia Departamentu Zdrowia i Opieki Społecznej Stanów Zjednoczonych.

1. Przygotowanie do kultury

  1. Przygotuj podłoże bazowe w następujący sposób: 9 mM NaHCO3 (1,51 g na 2 l), 20 mM HEPES (9,53 g na 2 l) w DMEM (13,48 g/l; 26,96 g na 2 l).
    1. Oznaczyć pH i dostosować do 7,40 za pomocą HCl lub NaOH.
    2. Określ osmolalność i dostosuj do ~ 300 mOsm za pomocą NaCl (w razie potrzeby).
    3. Filtr sterylizować za pomocą (2) 1 L systemów sterylizacji próżniowej i przechowywać w temperaturze 4 °C w chronić przed światłem przez okres do 2-3 miesięcy.
      UWAGA: Patrz tabele 1 i 2, aby uzyskać pełne informacje o odczynnikach, narzędziach, materiałach eksploatacyjnych i sprzęcie.
  2. Przygotować płytki poddane działaniu poli-L-lizyny, rozpuszczając 5 mg napromieniowanej γ poli-L-lizyny (> 300 000 mw) w 50 ml ultraczystej sterylnej wody. Mieszać delikatnie przez odwrócenie przez 10 minut w temperaturze pokojowej, zapewniając pełne rozpuszczenie polimerów lizyny.
  3. Odpipetować odpowiednią ilość roztworu poli-L-lizyny do każdego dołka, zgodnie z typem płytki (Tabela 3). Pozostaw płytki w okapie z przepływem laminarnym na 5 minut.
  4. Następnie usuń roztwór poli-L-lizyny i przemyj dwukrotnie sterylną wodą. Pozostaw płytki do wyschnięcia na powietrzu w okapie z przepływem laminarnym przez 20 minut.
  5. Otrzymać 1 mg lamininy (pochodzenie Engelbreth-Holm-Swarm) i rozpuścić w 50 ml pożywki zasadowej do końcowego stężenia 20 μg/ml. Nałożyć roztwór lamininy na płytki do hodowli komórkowych poddanych działaniu poli-L-lizyny w stężeniu 2 μg/cm2. (patrz tabela 3 dla różnych rozmiarów płyt)
  6. Delikatnie zamieszaj roztwór, aby zapewnić pełne pokrycie studni. Uszczelnij płytki taśmą laboratoryjną i umieść w inkubatorze na 24 godziny. W inkubatorze należy ustawić temperaturę odpowiednią dla wykorzystywanych gatunków (zob. tabela 7) i nie ma potrzeby dodawania do niego dodatkowych gazów.
    UWAGA: Laminina musi przylegać do płytek przez 24 godziny przed wysiewem komórek. Niezastosowanie się do tego spowoduje słabe przyleganie komórek lub jego brak.
  7. Przygotować pożywkę zgodnie z opisem w Tabeli 4. Kompletne podłoża najlepiej przygotować w dniu użycia.
  8. Przygotowując się do izolacji tkanek, zbierz następujące elementy i przeprowadź autoklaw: 300-500 ml zlewki, szklane szalki Petriego, trzonki skalpela, kleszcze (cienkie i grube), nożyczki do preparowania i kilka arkuszy wodoodpornego papieru do autoklawu.
    UWAGA: Dla każdej osoby pomagającej w procesie preparacji wystarczą (2) uchwyty skalpela, (1) kleszcze (rodzaj w zależności od osobistych preferencji), (1) nożyczki preparacyjne i (5-10) arkuszy wodoodpornego papieru autoklawu.
  9. Oprócz powyższych autoklawowanych przedmiotów, zbierz 70% etanolu, wagę wagową, sterylne stożkowe probówki o pojemności 50 ml (liczba zależy od wielkości kultury) i lód.

2. Sekcja tkanek

  1. Przed rozpoczęciem upewnij się, że dostępny jest wystarczający zapas ryb.
    UWAGA: Wiek ryby, która ma być użyta, ma kluczowe znaczenie. Podczas gdy ryby dwóch różnych gatunków mogą mieć podobną wagę, młodsza ryba jednego gatunku będzie miała więcej MPC niż starsza ryba innego gatunku. Z reguły najlepsze są młodsze ryby, zwłaszcza podczas pracy z łososiowatymi. W przypadku danionin optymalnie można wykorzystać ryby w wieku jednego roku, podczas gdy ryby łososiowate w wieku 4-6 miesięcy lub młodsze (do 15 g) są optymalne.
  2. Na każde 5 g tkanki przeznaczonej do wycięcia, podwielokrotność 25 ml pożywki izolacyjnej do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
  3. Zważyć, zapisać masę i ponumerować probówkę (rurki). Umieść probówki na lodzie.
  4. Eutanazja 2-3 ryb na raz przez zanurzenie w > 300 mg/l buforowanym wodorowęglanem sodu metanosulfonianu trikainy. Pozostawić ruch operkularny do ustania na > 5 minut, a następnie zanurzyć ryby w 70% etanolu (zawartym w sterylnych zlewkach) na 30 sekund.
  5. Usuń rybę z 70% etanolu i umieść na wodoodpornym bibułie autoklawu. Bezpośrednio za wieczkiem użyj skalpela, aby wykonać powierzchowne, płytkie nacięcie. Usuń łuski i skórę, chwytając skórę w wyżej wymienionym nacięciu i pociągnij w kierunku ogona ryby.
  6. Po usunięciu skóry należy wyciąć eposadny, szybko glikolityczny "biały" mięsień ryby z obu stron (unikając wolno utleniającego się "czerwonego" mięśnia znajdującego się w pobliżu linii bocznej) i umieścić w pożywce izolacyjnej. Pozostałą część ryb należy wyrzucić zgodnie z wymogami instytucji.
    UWAGA: Chociaż hodowla MPC pochodzących z czerwonego mięśnia jest całkowicie możliwa, prawie każda publikacja wykorzystująca teleost MPC wykorzystuje komórki wyizolowane z miotomii osiowej.
  7. Powtarzaj kroki 2.4-2.6, aż uzyskasz wystarczającą ilość mięśni. Podczas sekcji upewnij się, że zgromadzona tkanka mięśniowa pozostaje na lodzie, aby utrzymać żywotność komórek.

3. Dysocjacja mechaniczna

  1. Wlej jedną probówkę z 25 ml/5 g tkanki mięśniowej do szklanej szalki Petriego. Używając dwóch uchwytów skalpela z dołączonymi ostrzami skalpela #10, zmiel tkankę do konsystencji zawiesiny lub purée. Najlepiej sprawdza się ruch "w przód iw tył" polegający na przeciąganiu ostrzy skalpela obok siebie.
    UWAGA: Chociaż homogenizatory tkankowe mogą wydawać się odpowiednie, liczba żywotnych komórek zostanie znacznie zmniejszona, jeśli nie zniesiona.
  2. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml i pipetora serologicznego usunąć zawiesinę tkanki i umieścić ją w oryginalnej stożkowej probówce.
  3. Powtarzać kroki 3.1-3.2, aż wszystkie tkanki we wszystkich probówkach zostaną mechanicznie zdysocjowane.
  4. Odwirowywać tkankę przez 5 minut w temperaturze 300 x g i temperaturze 10 °C.
  5. Po odwirowaniu odrzucić 25 ml supernatantu z pożywką za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml, aspiratora próżniowego lub przez staranną dekantację.
  6. Dodać 25 ml pożywki myjącej do każdej probówki, ponownie zawiesić tkankę i ponownie odwirować jak powyżej.
  7. Przemyć dwukrotnie środkiem myjącym, za każdym razem usuwając supernatant.

4. Dysocjacja enzymatyczna

  1. W kroku 3.4 przygotuj roztwór kolagenazy, łącząc 0,22 g kolagenazy typu IV i 44 ml pożywki zasadowej (lub wystarczającą ilość 0,11 g/0,22 ml).
  2. Mieszać w zlewce przez 10-15 minut w temperaturze 4 °C. Filtrować sterylizować za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml i filtra strzykawkowego 0,45 μm.
    UWAGA: Może być potrzebny więcej niż jeden filtr strzykawkowy, w zależności od preparatu kolagenazy. Kolagenaza uzyskana od dostawców innych niż Worthington Biochemical stwarza większe trudności podczas filtracji. Kolagenaza służy do dysocjacji wiązań peptydowych w kolagenie, które tworzą endomysium. To trawienie usunie tę barierę ochronną włókien mięśniowych.
  3. Na każdy g tkanki mięśniowej należy ponownie zawiesić tkankę w 0,2% roztworze kolagenazy. Na 5 g tkanki mięśniowej dodaj 10 ml roztworu kolagenazy i 15 ml pożywki bazowej.
  4. Dodać 10 μl PSF na ml roztworu kolagenazy/podłoża bazowego (np. 250 μl do 25 ml). Upewnij się, że tkanka jest dobrze zawieszona, ponieważ wpłynie to na efektywność trawienia enzymatycznego.
  5. Inkubować tkankę mięśniową w kolagenazie przez 60 minut w temperaturze 18 °C, delikatnie kołysząc. W zależności od stopnia dysocjacji mechanicznej i gatunku, trawienie kolagenazy może być wydłużone do 90 minut, chociaż może to wpływać na żywotność komórek.
  6. Po wytrawieniu kolagenazą odwirować stożkowe probówki o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze 12 °C. Odrzucić sklarowany osad i ponownie zawiesić tkankę w 25 ml pożywki do mycia.
  7. Odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 12 °C. Powtórzyć z medium myjącym po raz drugi.
  8. Po dwukrotnym umyciu tkanki, ponownie zawiesić tkankę mięśniową w 25 ml pożywki myjącej i rozcierać pipetą serologiczną o pojemności 10 ml, aż jednorodność tkanki/pożywki będzie wchodzić i wychodzić z pipety ze względną łatwością. Zwykle wystarcza 5-10 rozcierań.
    1. Powtórzyć za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml, a następnie metalowej kaniuli o rozmiarze 16 dołączonej do strzykawki.
  9. Odwirować stożkowe probówki o stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 12 °C. Dekantować supernatant.
  10. Podczas powyższego 5-minutowego wirowania przygotuj roztwór do wytrawiania trypsyny, łącząc 0,25 g trypsyny z 5 ml pożywki zasadowej.
  11. Mieszać w temperaturze 4 °C przez 10-15 minut i przesączyć sterylizować za pomocą strzykawki o pojemności 20 ml i filtra strzykawkowego 0,45 μm.
  12. Pobrać stożkowe probówki i dodać 100 μl roztworu trypsyny i 4,9 ml pożywki dysocjacyjnej na każdy 1 g tkanki mięśniowej do każdej probówki. Na przykład dodaj 500 μl roztworu trypsyny i 24,5 ml pożywki dysocjacyjnej do 5 g tkanki mięśniowej.
    UWAGA: Trypsyna jest proteazą serynową , która oddziela miogenne komórki prekursorowe od blaszki podstawnej.
  13. Ponownie zawiesić tkankę w pożywce trypsyna/dysocjacja. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 18 °C.
  14. Po pierwszej inkubacji trypsyny odwirować stożkowe probówki o masie 300 x g przez 1 minutę w temperaturze 12 °C.
  15. Zneutralizować trypsynę, łącząc supernatanty z pożywką izolacyjną o stężeniu 1 objętość supernatantu na 4 objętości pożywki izolacyjnej. Przechowywać w temperaturze 4 °C podczas drugiego trawienia trypsyny.
  16. Do pozostałej osadki tkanki powtórzyć kroki 4.12-4.15, łącząc supernatant następujący po kroku 4.15 z supernatantem/pożywką izolacyjną z pierwszego trawienia trypsyną.
  17. ALTERNATYWNIE: Trawienie kolagenazy i trypsyny można łączyć, aby zmaksymalizować wydajność komórek.
    1. Aby to zrobić, rozcieraj trawienie kolagenazy za pomocą metalowej kaniuli (najlepiej o długości 6 i rozmiarze 16) przymocowanej do strzykawki o pojemności 20 ml, aż homogenat łatwo przejdzie przez kaniulę.
    2. Do homogenatu dodać 500 μl roztworu trypsyny (przygotowanego w kroku 4.10) i inkubować w temperaturze 18 °C przez 20 minut.
    3. Po inkubacji odwirować stożkowe probówki o masie 300 x g przez 1 minutę w temperaturze 12 °C.
    4. Zneutralizować trypsynę, łącząc supernatanty z pożywką izolacyjną o stężeniu 1 objętość supernatantu na 4 objętości pożywki izolacyjnej.
    5. Przechowywać w temperaturze 4 °C podczas drugiego trawienia trypsyny.
    6. Postępuj zgodnie z krokiem 4.18, tak jak w przypadku standardowego protokołu.
  18. Dozować końcową mieszaninę sklarowanego osadu/pożywki izolacyjnej do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i odwirowywać przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 12 °C.
  19. Usunąć supernatanty, uważając, aby nie naruszyć osadów komórkowych. Odpipetować pipetą 2 ml kompletnego podłoża do każdej probówki, rozpuszczając każdą osadkę komórkową.
  20. Połączyć komórki zawieszone w kompletnym podłożu w jednej stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
  21. Przepłukać każdą probówkę 1 ml kompletnego podłoża, łącząc je z pulą komórek ponownie zawieszonych uprzednio.
  22. Rozcierać metalową kaniulą i strzykawką 5-10 razy.
  23. Zawiesinę komórek filtracyjnych przez sitko o wielkości 100 μm, przepłukać kompletnym podłożem.
  24. Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 40 μm.
  25. Dodać wystarczającą ilość kompletnego podłoża do 50 ml i odwirowywać przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 15 °C.

5. Liczenie, rozcieńczanie i rozsiewanie komórek

  1. Po ostatnim odwirowaniu w kroku 4.25 usunąć supernatant przez staranną dekantację lub za pomocą pipety serologicznej. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml kompletnego podłoża.
  2. Po całkowitym zawieszeniu komórek usunąć 20 μl zawiesiny komórek i umieścić w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
  3. Dodaj 5 μl barwnika Trypan Blue i odczekaj 5 minut. Za pomocą hemocytometru określ liczbę żywotnych komórek.
  4. Po oznaczeniu rozcieńczyć komórki do wymaganego stężenia. Teleost MPC najlepiej wysiewać się przy 150 000-200 000 komórek na cm2. W przypadku strategii posiewu z sześcioma dołkami, rozcieńczanie komórek do 1,5 x 106 - 2,0 x 106 na ml wspiera wystarczającą proliferację i różnicowanie.
  5. Pobrać płytki i komórki nasienne nasączone poli-L-lizyną, pokryte lamininą. (Patrz Tabela 5 dla rozcieńczeń i objętości posiewu specyficznych dla płytki). UWAGA: Tabela 6 przedstawia średnią liczbę komórek wyizolowanych na gram tkanki mięśniowej wyizolowanej od różnych gatunków teleostów. Pstrąg tęczowy (O. mykiss) wykazuje mniej MPC na gram tkanki mięśniowej niż danio pręgowany (D. rerio) i dlatego będzie wymagał większej liczby ryb do odizolowania w celu prawidłowego wysiewu.
  6. Uszczelnić płytki taśmą laboratoryjną i umieścić w inkubatorze chłodzącym o odpowiedniej temperaturze. MPC ze wszystkich wymienionych tu gatunków (z wyjątkiem myszy) mogą być inkubowane w normalnych warunkach atmosferycznych bez suplementacji dwutlenkiem węgla (CO2 ). (Patrz Tabela 7.)
  7. ALTERNATYWNIE: Niektóre laboratoria przyjęły protokół, który wzywa do zezwolenia MPC na przyleganie do substratów hodowlanych przez 40 minut.
    1. Następnie opłucz płytki środkiem myjącym, aby usunąć luźno przylegające i nieprzylegające komórki. Ostrzeżenie: Ten krok jest bardzo ważny, aby uniknąć "niespecyficznego" przylegania innych komórek (np. fibroblastów) do podłoża hodowli.
    2. Dodaj kompletną pożywkę i umieść komórki w inkubatorze i pielęgnuj zgodnie z opisem poniżej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Dwadzieścia cztery godziny po wysianiu, prekursorowe komórki mięśniowe (MPCs) powinny być widoczne jako przytwierdzone do podłoża z lamininy (patrz Rysunki 1a oraz 1d). Po wysianiu komórki (MPCs) przyjmują wrzecionowaty kształt charakterystyczny dla tego typu komórek (Rysunek 1) i wykazują obecność MyoD1+ (Rysunek 2). W gatunkach Danio komórki MPC wydają się być bardziej zwarte i mają mniejsze wypustki binarne niż MPC pochodzące od gatunków ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Program miogenny, niezależnie od tego, jaki badany gatunek, może być najłatwiej zbadany za pomocą systemu in vitro . Rzeczywiście, po izolacji, miogenne komórki prekursorowe (MPC) w rybach lub komórkach miosatelitarnych (MSC) u ssaków łatwo wchodzą w ten wysoce regulowany proces obejmujący proliferację, wycofanie cyklu komórkowego i końcowe różnicowanie mioblastów oraz fuzję tych mioblastów z powstającymi miotubami. Ogólny brak transgenicznych genów reporterowych gatunków ryb (być może z wyjątkiem danio pręgowan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie ma nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby bardzo podziękować doktorom Josepowi Planasowi i Juanowi Castillo za ich profesjonalną wiedzę w zakresie rozwoju i zastosowania tego protokołu hodowlanego do małych ryb i. Podziękowania należą się również niezliczonym osobom, które niestrudzenie pomagały w rozwarstwianiu i dysocjacji tkanki mięśniowej wielu ryb (zarówno pod względem gatunku, jak i liczby), w tym Matthew Charging, Delci Christensen, Zachary Fowler, Brooke Franzen, Nathan Froehlich, Kira Marshall, Ben Meyer, Ethan Remily i Sinibaldo Romero. Praca ta była wspierana przez fundusze startowe University of Alabama at Birmingham Department of Biology, Center for Protease Research NIH Grant # 2P20 RR015566, NIH NIAMS Grant # R03AR055350 oraz NDSU Advance FORWARD NSF Grant #HRD-0811239 dla PRB. Wsparcia udzieliło również Centrum Badań nad Otyłością UAB nagroda # P30DK056336, NIH NIDDK. Wyłączną odpowiedzialność za jego treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy NIH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tabela 1. Szczegółowe informacje o odczynnikach
odczynnikowa(preferowana v. alternatywna)Numer katalogowy (preferowana alternatywna)Ilość na kulturę
γ-napromieniowana poli-L-lizynaSigma-Aldrich (MP Biomedicals)P5899 (ICN19454405)5 mg
DMEM (wysoka glukoza)Sigma-Aldrich (cellgro)MT-50-003-PB (D7777)2 L
LamininBD Biosciences ( Sigma-Aldrich)CB-40232 (L2020)1 mg
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)BP328-500 (S5761)1.51 g
HEPES (C8H18N2O4S)Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)BP310-1 (H6147)9.53 g
Antybiotyk/Środek przeciwgrzybiczyThermo Scientific (Sigma-Aldrich)SV3007901 (A5955)17-20 ml
siarczanugentamycynyLonza (Sigma-Aldrich)BW17-519Z (G1397)2-3 mL
Surowice koni dawcyThermo Scientific (Sigma-Aldrich)SH3007403 (H1270)75 mL
Surowice bydlęcepłodu Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)SH3007103 (F2442)25 ml
Kolagenaza (Typ IV)Worthington (Sigma-Aldrich)LS004189 (C9891)0,44 g
Trypsyna (z trzustki)MP Biomedicals (Sigma-Aldrich)ICN15357125 (T5266)1 g
Tabela 2. Materiały eksploatacyjne, narzędzia i sprzęt
Narzędzia eksploatacyjneSprzęt
Płytki do hodowli komórkowychKleszcze (gruboziarniste)Pipetor
Sterylne 50 ml Probówki stożkowe Kleszcze(drobne)pH-metr
Taśma laboratoryjnaUchwyty skalpelaInkubator chłodzący (Echotherm)
0,2 μ m Systemy sterylizacji próżniowejOstrza skalpela (#10, #11)przepływem laminarnym
Wodoodporny autoklaw PapierNożyczki chirurgiczneKolektor
Pipety serologiczneSzklane szalki PetriegoMiernik
12-16 G Kaniule z zamkami Luer <
Rozmiar płytki cm^2 na dołekPoli-L-lizyna*Laminina**
6 dołek9,51,6 ml1
24 dołek1,90,320,2
48 dołek0,950,160,1
96 dołek0,320,060,03
*0,1 mg/ml koncentracja** Stężenie 0,020 mg/ml
Tabela 4. Pożywki do izolacji, dysocjacji i hodowli
Odczynnikdo izolacjiPożywkabazowa dysocjacji do płukania
419,25 ml395,40 ml297,00 ml
siarczanu gentamycyny**0,75 ml0,60 ml
-Surowica koni dawcy75,00 ml-
-Surowica bydlęca płodu***---
* PSF: koktajl penicylina/streptomycyna/fungizone (100x); ** Stężenie 50 mg/ml; Charakteryzowane
Tabela 5. Zalecane rozcieńczenia i objętości posiewu
Rozmiar płytkicm^2 na dołekRozcieńczenieObjętość posiewu
6 dołka9,51,5-2,0x10^6 komórek/ml1 ml
24 dołki1,91,5-2,0x10^6 komórek/ml250 μ L
48 dobrze0,951,5-2,0x10^6 komórek/ml150 μ L
96 studzienka0,321,5-2,0x10^6 komórek/ml50-100 μ L
Tabela 6. Średnia liczba komórek w tkance
g GatunkiŚrednia # komórek/g tkanki
Danio rerio6 400 000
Danio dangila1 783 000
Devario aequipinnatus1 797 000
Oncorhynchus mykiss66 800
Tabela 7. Zalecane temperatury inkubacji
GatunkiTemperatura
Danio/ Devario spp.26 - 28 stopni C
Oncorhynchus/Salmo spp.10* - 18 & C
Ambystoma mexicanum18° C
* Niższe temperatury sprzyjają niższym wskaźnikom proliferacji.
FirmaserologicznyKaptur z próżniowy mikroosmolalności td colspan="4">Tabela 3. Zoptymalizowane objętości do powlekania płytek do hodowli komórkowych

Bibliografia

  1. Rescan, P. Y., Gauvry, L., Paboeuf, G. A gene with homology to myogenin is expressed in developing myotomal musculature of the rainbow trout and in vitro during the conversion of myosatellite cells to myotubes. FEBS Letters. 362 (1), 89-92 (1995).
  2. Castillo, J., Codina, M., Martinez, M. L., Navarro, I., Gutierrez, J. Metabolic and mitogenic effects of IGF-I and insulin on muscle cells of rainbow trout. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 286 (5), 935-941 (2004).
  3. Bower, N. I., Johnston, I. A. Paralogs of Atlantic salmon myoblast determination factor genes are distinctly regulated in proliferating and differentiating myogenic cells. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 298 (6), 1615-1626 (2010).
  4. Funkenstein, B., Balas, V., Skopal, T., Radaelli, G., Rowlerson, A. Long-term culture of muscle explants from Sparus aurata. Tissue & Cell. 38 (6), 399-415 (2006).
  5. Cornelison, D. D. Context matters: in vivo and in vitro influences on muscle satellite cell activity. Journal of Cellular Biochemistry. 105 (3), 663-669 (2008).
  6. Harris, M. Quantitative growth studies with chick myoblasts in glass substrate cultures. Growth. 21 (3), 149-166 (1957).
  7. Cornelison, D. D., Wold, B. J. Single-cell analysis of regulatory gene expression in quiescent and activated mouse skeletal muscle satellite cells. Developmental Biology. 191 (2), 270-283 (1997).
  8. Yablonka-Reuveni, Z., et al. The transition from proliferation to differentiation is delayed in satellite cells from mice lacking MyoD. Developmental Biology. 210 (2), 440-455 (1999).
  9. Yablonka-Reuveni, Z., Seger, R., Rivera, A. J. Fibroblast growth factor promotes recruitment of skeletal muscle satellite cells in young and old rats. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 47 (1), 23-42 (1999).
  10. Le Moigne, A., et al. Characterization of myogenesis from adult satellite cells cultured in vitro. The International Journal of Developmental Biology. 34 (1), 171-180 (1990).
  11. Tripathi, A. K., Ramani, U. V., Patel, A. K., Rank, D. N., Joshi, C. G. Short hairpin RNA-induced myostatin gene silencing in caprine myoblast cells in vitro. Applied Biochemistry and Biotechnology. 169 (2), 688-694 (2013).
  12. Ghahramani Seno,, M, M., et al. Transcriptomic analysis of dystrophin RNAi knockdown reveals a central role for dystrophin in muscle differentiation and contractile apparatus organization. BMC Genomics. 11, 345(2010).
  13. Honda, M., Hosoda, M., Kanzawa, N., Tsuchiya, T., Toyo-oka, T. Specific knockdown of delta-sarcoglycan gene in C2C12 in vitro causes post-translational loss of other sarcoglycans without mechanical stress. Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 323-321 (2009).
  14. Rochard, P., et al. Mitochondrial activity is involved in the regulation of myoblast differentiation through myogenin expression and activity of myogenic factors. The Journal of Biological Chemistry. 275 (4), 2733-2744 (2000).
  15. Jackson, M. F., Hoversten, K. E., Powers, J. M., Trobridge, G. D., Rodgers, B. D. Genetic manipulation of myoblasts and a novel primary myosatellite cell culture system: comparing and optimizing approaches. The FEBS Journal. 280 (3), 827-839 (2013).
  16. McGrew, M. J., Rosenthal, N. Transgenic analysis of cardiac and skeletal myogenesis. Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (6), 251-256 (1994).
  17. Dong, Y., Pan, J. S., Zhang, L. Myostatin suppression of Akirin1 mediates glucocorticoid-induced satellite cell dysfunction. PLoS ONE. 8 (3), (2013).
  18. Chen, Y., Melton, D. W., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. MiR-351 transiently increases during muscle regeneration and promotes progenitor cell proliferation and survival upon differentiation. Physiological Genomics. 44 (21), 1042-1051 (2012).
  19. Shadrach, J. L., Wagers, A. J. Stem Cells for skeletal muscle repair. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 366 (1575), 2297-2306 (2011).
  20. Wu, X., Wang, S., Chen, B., An, X. Muscle-derived stem cells: isolation, characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. Cell and Tissue Research. 340 (3), 549-567 (2010).
  21. Farini, A., Razini, P., Erratico, S., Torrente, Y., Meregalli, M. Cell based therapy for Duchenne muscular dystrophy. Journal of Cellular Physiology. 221 (3), 526-534 (2009).
  22. Kim, H. J., Archer, E., Escobedo, N., Tapscott, S. J., Unguez, G. A. Inhibition of mammalian muscle differentiation by regeneration blastema extract of Sternopygus macrurus. Developmental Dynamics: an Official Publication of the American Association of Anatomists. 237 (10), 2830-2843 (2008).
  23. McGann, C. J., Odelberg, S. J., Keating, M. T. Mammalian myotube dedifferentiation induced by newt regeneration extract. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13699-13704 (2001).
  24. Cosgrove, B. D., Sacco, A., Gilbert, P. M., Blau, H. M. A home away from home: challenges and opportunities in engineering in vitro muscle satellite cell niches. Differentiation; Research in Biological Diversity. 78 (2-3), 2-3 (2009).
  25. Colbert, D. A., Edwards, K., Coleman, J. R. Studies on the organisation of the chicken genome and its expression during myogenesis in vitro. Differentiation; Research in Biological Diversity. 5 (2-3), 91-96 (1976).
  26. Bowman, L. H., Emerson, C. P. Post-transcriptional regulation of ribosome accumulation during myoblast differentiation. Cell. 10 (4), 587-596 (1977).
  27. Sun, S. S., McFarland, D. C., Ferrin, N. H., Gilkerson, K. K. Comparison of insulin-like growth factor interaction with satellite cells and embryonic myoblasts derived from the turkey. Comparative Biochemistry and Physiology. Comparative Physiology. 102 (2), 235-243 (1992).
  28. Marusich, M. F., Simpson, S. B. Changes in cell surface antigens during in vitro lizard myogenesis. Developmental Biology. 97 (2), 313-328 (1983).
  29. Schrag, J. A., Cameron, J. A. Regeneration of adult newt skeletal muscle tissue in vitro. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 77, 255-271 (1983).
  30. Hinkle, L., McCaig, C. D., Robinson, K. R. The direction of growth of differentiating neurones and myoblasts from frog embryos in an applied electric field. The Journal of Physiology. 314, 121-135 (1981).
  31. Yamane, H., Nishikawa, A. Differential muscle regulatory factor gene expression between larval and adult myogenesis in the frog Xenopus laevis: adult myogenic cell-specific myf5 upregulation and its relation to the notochord suppression of adult muscle differentiation. In vitro Cellular & Developmental Biology Animal. , (2013).
  32. Alexander, M. S., et al. Isolation and transcriptome analysis of adult zebrafish cells enriched for skeletal muscle progenitors. Muscle & Nerve. 43 (5), 741-750 (2011).
  33. Froehlich, J. M., Galt, N. J., Charging, M. J., Meyer, B. M., Biga, P. R. In vitro indeterminate teleost myogenesis appears to be dependent on Pax3. In vitro Cellular & Developmental Biology Animal. , (2013).
  34. Gabillard, J. C., Sabin, N., Paboeuf, G. In vitro characterization of proliferation and differentiation of trout satellite cells. Cell and Tissue Research. 342 (3), 471-477 (2010).
  35. Blau, H. M., Chiu, C. P., Webster, C. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons. Cell. 32 (4), 1171-1180 (1983).
  36. Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 477-483 (1968).
  37. Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
  38. Antin, P. B., Ordahl, C. P. Isolation and characterization of an avian myogenic cell line. Developmental Biology. 143 (1), 111-121 (1991).
  39. Malatesta, M., Giagnacovo, M., Cardani, R., Meola, G., Pellicciari, C. Human myoblasts from skeletal muscle biopsies: in vitro culture preparations for morphological and cytochemical analyses at light and electron microscopy. Methods in Molecular Biology. 976, 67-79 (2013).
  40. Scott, I. C., Tomlinson, W., Walding, A., Isherwood, B., Dougall, I. G. Large-scale isolation of human skeletal muscle satellite cells from post-mortem tissue and development of quantitative assays to evaluate modulators of myogenesis. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. , 10-1007 (2013).
  41. Baquero-Perez, B., Kuchipudi, S. V., Nelli, R. K., Chang, K. C. A simplified but robust method for the isolation of avian and mammalian muscle satellite cells. BMC Cell Biology. 13, (2012).
  42. Lu, A., et al. Isolation of myogenic progenitor populations from Pax7-deficient skeletal muscle based on adhesion characteristics. Gene Therapy. 15 (15), 1116-1125 (2008).
  43. Rouger, K., et al. Progenitor cell isolation from muscle-derived cells based on adhesion properties. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 55 (6), 607-618 (2007).
  44. Michal, J., et al. Isolation and characterization of canine satellite cells. In vitro cellular & Developmental Biology Animal. 38, 467-480 (2002).
  45. McFarland, D. C., et al. Isolation and characterization of myogenic satellite cells from the muscular dystrophic hamster. Tissue & Cell. 32 (3), 257-265 (2000).
  46. Burton, N. M., Vierck, J., Krabbenhoft, L., Bryne, K., Dodson, M. V. Methods for animal satellite cell culture under a variety of conditions. Methods in Cell Science: an Official Journal of the Society for In vitro Biology. 22 (1), 51-61 (2000).
  47. Pavlath, G. K. Isolation, purification, and growth of human skeletal muscle cells. Methods in Molecular Medicine. 2, 307-317 (1996).
  48. Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).
  49. Doumit, M. E., Merkel, R. A. Conditions for isolation and culture of porcine myogenic satellite cells. Tissue & Cell. 24 (2), 253-262 (1992).
  50. Barjot, C., Jbilo, O., Chatonnet, A., Bacou, F. Expression of acetylcholinesterase gene during in vitro differentiation of rabbit muscle satellite cells. Neuromuscular Disorders: NMD. 3 (5-6), 443-446 (1993).
  51. Pasut, A., Oleynik, P., Rudnicki, M. A. Isolation of muscle stem cells by fluorescence activated cell sorting cytometry. Methods in Molecular Biology. 798, 53-64 (2012).
  52. Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells: background and methods for isolation and analysis in a primary culture system. Methods in Molecular Biology. 798, 21-52 (2012).
  53. Musaro, A., Barberi, L. Isolation and culture of mouse satellite cells. Methods in Molecular Biology. 633, 101-111 (2010).
  54. Sherwood, R. I., et al. Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle. Cell. 119 (4), 543-554 (2004).
  55. Yi, L., Rossi, F. Purification of progenitors from skeletal muscle. J. Vis. Exp. (49), (2011).
  56. Tamaki, T., et al. Skeletal muscle-derived CD34+/45- and CD34-/45- stem cells are situated hierarchically upstream of Pax7+ cells. Stem Cells and Development. 17 (4), 653-667 (2008).
  57. Bosnakovski, D., et al. Prospective isolation of skeletal muscle stem cells with a Pax7 reporter. Stem Cells. 26 (12), 3194-3204 (2008).
  58. Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
  59. Powell, R. L., Dodson, M. V., Cloud, J. G. Cultivation and differentiation of satellite cells from skeletal muscle of the rainbow trout Salmo gairdneri. Journal of Experimental Zoology. 250 (3), 333-338 (1989).
  60. Fauconneau, B., Paboeuf, G. Effect of fasting and refeeding on in vitro muscle cell proliferation in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Cell and Tissue Research. 301 (3), 459-463 (2000).
  61. Rescan, P. Y. Muscle growth patterns and regulation during fish ontogeny. General and Comparative Endocrinology. 142 (1-2), 111-116 (2005).
  62. Johnston, I. A., Bower, N. I., Macqueen, D. J. Growth and the regulation of myotomal muscle mass in teleost fish. The Journal of Experimental Biology. 214, 1617-1628 (2011).
  63. Mommsen, T. P. Paradigms of growth in fish. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 129 (2-3), 207-219 (2001).
  64. Biga, P. R., Goetz, F. W. Zebrafish and giant danio as models for muscle growth: determinate vs. indeterminate growth as determined by morphometric analysis. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 291 (5), 1327-1337 (2006).
  65. Roy, S., Gatien, S. Regeneration in axolotls: a model to aim for! Experimental Gerontology. 43 (11), 968-973 (2008).
  66. Echeverri, K., Tanaka, E. M. Ectoderm to mesoderm lineage switching during axolotl tail regeneration. Science. 298 (5600), 1993-1996 (2002).
  67. Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Developmental Cell. 21 (1), 172-185 (2011).
  68. Froehlich, J. M., Galt, N. J., Charging, M. J., Meyer, B. M., Biga, P. R. In vitro indeterminate teleost myogenesis appears to be dependent on Pax3. In vitro Cellular & Developmental Biology Animal. 49 (5), 371-385 (2013).
  69. Seger, C., et al. Analysis of Pax7 expressing myogenic cells in zebrafish muscle development, injury, and models of disease. Developmental Dynamics: an Official Publication of the American Association of Anatomists. 240 (11), 2440-2451 (2011).
  70. Gabillard, J. C., Ralliere, C., Sabin, N., Rescan, P. Y. The production of fluorescent transgenic trout to study in vitro myogenic cell differentiation. BMC Biotechnology. 10, (2010).
  71. Bond, M. D., Van Wart, H. E. Purification and separation of individual collagenases of Clostridium histolyticum using red dye ligand chromatography. Biochemistry. 23 (13), 3077-3085 (1984).
  72. Garikipati, D. K., Rodgers, B. D. Myostatin inhibits myosatellite cell proliferation and consequently activates differentiation: evidence for endocrine-regulated transcript processing. The Journal of Endocrinology. 215 (1), 177-187 (2012).
  73. Sanchez-Gurmaches, J., Cruz-Garcia, L., Gutierrez, J., Navarro, I. mRNA expression of fatty acid transporters in rainbow trout: in vivo and in vitro regulation by insulin, fasting and inflammation and infection mediators. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Molecular & Integrative Physiology. 163 (2), 177-188 (2012).
  74. Garikipati, D. K., Rodgers, B. D. Myostatin stimulates myosatellite cell differentiation in a novel model system: evidence for gene subfunctionalization. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (9), 1059-1066 (2012).
  75. Vraskou, Y., et al. Direct involvement of tumor necrosis factor-α in the regulation of glucose uptake in rainbow trout muscle cells. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (3), 716-723 (1152).
  76. Cleveland, B. M., Weber, G. M. Effects of insulin-like growth factor-I, insulin, and leucine on protein turnover and ubiquitin ligase expression in rainbow trout primary myocytes. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 298 (2), 341-350 (2010).
  77. Seiliez, I., et al. Amino acids downregulate the expression of several autophagy-related genes in rainbow trout myoblasts. Autophagy. 8 (3), 364-375 (2012).
  78. Chapalamadugu, K. C., et al. Dietary carbohydrate level affects transcription factor expression that regulates skeletal muscle myogenesis in rainbow trout. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 153 (1), 66-72 (2009).
  79. Seiliez, I., et al. Myostatin induces atrophy of trout myotubes through inhibiting the TORC1 signaling and promoting Ubiquitin-Proteasome and Autophagy-Lysosome degradative pathways. General and Comparative Endocrinology. 186, 9-15 (2013).
  80. Codina, M., et al. Metabolic and mitogenic effects of IGF-II in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) myocytes in culture and the role of IGF-II in the PI3K/Akt and MAPK signalling pathways. General and Comparative Endocrinology. 157 (2), 116-124 (2008).
  81. Seiliez, I., Sabin, N., Gabillard, J. C. Myostatin inhibits proliferation but not differentiation of trout myoblasts. Molecular and Cellular Endocrinology. 351 (2), 220-226 (2012).
  82. Averous, J., Gabillard, J. C., Seiliez, I., Dardevet, D. Leucine limitation regulates myf5 and myoD expression and inhibits myoblast differentiation. Experimental Cell Research. 318 (3), 217-227 (2012).
  83. Fauconneau, B., Paboeuf, G. Sensitivity of muscle satellite cells to pollutants: an in vitro and in vivo comparative approach. Aquatic Toxicology. 53 (3-4), 247-263 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Miogenne kom rki prekursorowepierwotna hodowla kom rkowasekcja tkanekdysocjacja mechanicznadysocjacja enzymatycznatraktowanie kolagenazpod o e lamininowewysiew kom rektest miogenezymodel rybki danao
Przygotowanie pierwotnych miogennych kultur komórek prekursorowych/mioblastów z bazalnych linii kręgowców
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.