Strategia dla wrażliwej, wielkoskalowej metabolomiki ilościowej

Podsumowanie

Profilowanie metabolitów było cennym atutem w badaniach nad metabolizmem w zdrowiu i chorobie. Wykorzystując chromatografię cieczową z fazami normalnymi sprzężoną ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości ze zmianą polaryzacji i szybkim cyklem pracy, opisujemy protokół analizy polarnego składu metabolicznego materiału biologicznego z wysoką czułością, dokładnością i rozdzielczością.

Streszczenie

Profilowanie metabolitów było cennym atutem w badaniach nad metabolizmem w zdrowiu i chorobie. Jednak obecne platformy mają różne czynniki ograniczające, takie jak pracochłonne przygotowanie próbek, niskie limity wykrywalności, niskie prędkości skanowania, intensywna optymalizacja metod dla każdego metabolitu oraz niemożność pomiaru zarówno dodatnio, jak i ujemnie naładowanych jonów w pojedynczych eksperymentach. W związku z tym nowy protokół metabolomiczny może przyczynić się do postępu w badaniach metabolomicznych. Chromatografia hydrofilowa na bazie amidu umożliwia analizę metabolitów polarnych bez derywatyzacji chemicznej. MS o wysokiej rozdzielczości wykorzystujący Q-Exactive (QE-MS) ma ulepszoną optykę jonową, zwiększoną prędkość skanowania (256 ms przy rozdzielczości 70 000) i ma możliwość przeprowadzania przełączania dodatniego/ujemnego. Zastosowanie strategii ekstrakcji metanolem na zimno i sprzężenie kolumny amidowej z QE-MS umożliwia niezawodne wykrywanie 168 docelowych metabolitów polarnych i tysięcy dodatkowych cech jednocześnie. Przetwarzanie danych odbywa się za pomocą komercyjnie dostępnego oprogramowania w bardzo wydajny sposób, a nieznane cechy wyodrębnione z widm masowych mogą być wyszukiwane w bazach danych.

Wprowadzenie

Metabolomika, definiowana jako eksperyment, który mierzy wiele metabolitów jednocześnie, była obszarem intensywnego zainteresowania. Metabolomika dostarcza bezpośredniego odczytu fizjologii molekularnej i dostarcza wglądu w rozwój i choroby, takie jak rak^1-4. Magnetyczny rezonans jądrowy (NMR) i chromatografia gazowo-spektrometria mas (GC-MS) należą do najczęściej używanych instrumentów^5-9. NMR, szczególnie używany do eksperymentów z topnikiem, ponieważ związki znakowane ciężkimi izotopami, takie jak metabolity znakowane ¹³C, są aktywne w NMR^10,11. Strategia ta wymaga jednak stosunkowo wysokiej czystości próbki i dużej ilości próbek, co ogranicza jej zastosowania w metabolomice. Tymczasem dane zebrane z NMR wymagają intensywnej analizy, a przypisanie złożonych widm NMR do złożonych związków jest trudne. GC-MS jest szeroko stosowany do badań metabolitów polarnych i lipidów, ale wymaga związków lotnych, a zatem często derywatyzacji metabolitów, co czasami wiąże się ze złożoną chemią, która może być czasochłonna i wprowadza szum eksperymentalny.

Chromatografia cieczowa (LC) sprzężona z potrójną kwadrupolową spektrometrią mas wykorzystuje pierwszy kwadrupol do wyboru nienaruszonych jonów rodzicielskich, które są następnie fragmentowane w drugim kwadrupolu, podczas gdy trzeci kwadrupol służy do wyboru charakterystycznych fragmentów lub jonów potomnych. Ta metoda, która rejestruje przejście od jonów macierzystych do określonych jonów potomnych, jest określana jako monitorowanie reakcji wielokrotnych (MRM). MRM jest bardzo czułym, specyficzna i solidna metoda oznaczania ilościowego zarówno małych cząsteczek, jak i białek^12-15,21. MRM ma jednak swoje ograniczenia. Aby osiągnąć wysoką swoistość, należy opracować metodę MRM dla każdego metabolitu. Metoda ta polega na identyfikacji określonego fragmentu i odpowiadającej mu zoptymalizowanej energii zderzenia, co wymaga wstępnej wiedzy na temat właściwości metabolitów będących przedmiotem zainteresowania, takich jak informacje o strukturze chemicznej. W związku z tym, z pewnymi wyjątkami związanymi z neutralną utratą wspólnych fragmentów, nie jest możliwa identyfikacja nieznanych metabolitów za pomocą tej metody.

W ostatnich latach pojawiły się instrumenty do spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (HRMS), takie jak LTQ-orbitrap i Exactive series, QuanTof i TripleTOF 5600^16-18,22. HRMS może zapewnić stosunek masy do ładunku (m/z) nienaruszonych jonów z błędem kilku ppm. W związku z tym przyrząd HRMS działający na zasadzie wykrywania wszystkich jonów prekursorowych (tj. w trybie pełnego skanowania) może uzyskać bezpośrednie informacje strukturalne z dokładnej masy i wynikowego składu pierwiastkowego analitu, a informacje te można wykorzystać do identyfikacji potencjalnych metabolitów. Rzeczywiście, wszystkie informacje o związku można uzyskać z dokładną masą, aż do poziomu izomerów strukturalnych. Ponadto metoda pełnego skanowania nie wymaga wcześniejszej wiedzy na temat metabolitów i nie wymaga optymalizacji metody. Ponadto, ponieważ można analizować wszystkie jony, których m/z mieszczą się w zakresie skanowania, HRMS ma prawie nieograniczoną zdolność pod względem liczby metabolitów, które można określić ilościowo w jednym przebiegu, w porównaniu z metodą MRM. HRMS jest również porównywalny z potrójnym kwadrupolem MRM pod względem pojemności ilościowej ze względu na krótki cykl pracy, co skutkuje porównywalną liczbą punktów danych, które można uzyskać w pełnym skanowaniu MS. W związku z tym HRMS stanowi alternatywne podejście do metabolomiki ilościowej. Ostatnio ulepszona wersja HRMS zwana spektrometrią mas Q-Exactive (QE-MS) może być obsługiwana przy przełączaniu między trybami dodatnim i ujemnym z wystarczająco krótkimi czasami cyklu w jednej metodzie, co rozszerza zakres wykrywania¹⁹. Tutaj opisujemy naszą strategię metabolomiki z wykorzystaniem QE-MS.

Protokół

1. Przygotowanie odczynników LC-MS, opracowanie metody chromatograficznej i opracowanie procedur obsługi przyrządów

1. Przygotowanie rozpuszczalników LC
   1. Przygotuj 500 ml faz ruchomych. A to 20 mM octanu amonu i 15 mM wodorotlenku amonu w 3% acetonitrylu/wody, końcowe pH 9,0; a B to 100% acetonitryl.
   2. Luźno zakręć butelkę, umieść ją w sonikatorze łaźni wodnej i sonikuj przez 10 minut bez dodatkowego podgrzewania. (Ten krok ma na celu upewnienie się, że wszystkie sole amonowe całkowicie się rozpuszczają i że nie ma resztkowych pęcherzyków powietrza.)
   3. Przenieść 250 ml rozpuszczalnika do szklanej butelki o pojemności 250 ml do stosowania LC-MS, a pozostałą część przechowywać w temperaturze 4 °C.
2. Przygotować roztwór kalibracyjny o niskim zakresie masy. Ważne jest, aby używać dostosowanej mieszaniny kalibracyjnej o niskim zakresie mas do zastosowań metabolomicznych, aby zapewnić wykrywanie dokładnych mas przy niskich masach cząsteczkowych.
   1. Odważyć 5 mg zarówno fluorooctanu sodu, jak i kwasu homowanilinowego i rozpuścić je w 5 ml wody, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mg/ml. Rozpuścić diazynon w metanolu, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mg/ml.
   2. Aby przygotować 1 ml ujemnego roztworu kalibracyjnego o niskiej masie, należy zmieszać 960 ml roztworu kalibracyjnego termoujemnego z 20 ml roztworu fluorooctanu sodu i kwasu homowanilinowego. Aby przygotować 1 ml dodatniego roztworu kalibracyjnego o niskiej masie, należy zmieszać 990 ml termododatniego roztworu kalibracyjnego i 10 ml roztworu diazynonu. (Roztwór do kalibracji o niskiej masie powinien być przechowywany w temperaturze 4 °C i przygotowywany w stanie świeżym co 2 miesiące).
3. Kalibracja QE-MS w małym zakresie masowym
   1. Przed wykonaniem wzorcowania w małym zakresie mas należy przeprowadzić wzorcową kalibrację masy (m/z, 150-2 000) zarówno w trybie dodatnim, jak i ujemnym zgodnie z instrukcjami producenta.
   2. Po pomyślnym przejściu normalnej kalibracji wzorcowania masy należy dostosować zakres skanowania do 60–900 m/z w panelu sterowania przyrządu i zastosować źródłowy CID 25 eV dla trybu dodatniego i 35 eV dla trybu ujemnego. (Da to silne sygnały jonu fragmentu kofeiny i jonu siarczanowego. Zakres skanowania jest tutaj stały, ponieważ ostatni m/z nie powinien być większy niż 15x początkowy m/z)
   3. Gdy źródło jonów ustabilizuje się, wykonaj niestandardową kalibrację. Uwaga: Stabilne źródło definiuje się jako mniej niż 10% całkowitej zmiany prądu jonowego w trybie dodatnim i mniej niż 15% w trybie ujemnym. Dostosowane jony kalibracyjne i odpowiadające im m/z są wymienione w tabeli 1.
4. Ustanowić oprzyrządowanie LC-MS do analizy metabolitów polarnych. LC jest sprzężony z QE-MS w celu separacji i wykrywania metabolitów.
   1. Wyposaż QE-MS w podgrzewaną sondę jonizacyjną z elektrorozpylaniem (H-ESI). Ustaw odpowiednie parametry strojenia sondy zgodnie z podaną listą: temperatura grzałki, 120 °C; gaz osłonowy, 30; gaz pomocniczy, 10; gaz do wymiatania, 3; napięcie natrysku, 3,6 kV dla trybu dodatniego i 2,5 kV dla trybu ujemnego. Ustaw temperaturę kapilary na 320 °C, a soczewkę S na 55.
   2. Zbuduj metodę pełnego skanowania w następujący sposób: Pełny zakres skanowania: od 60 do 900 (m/z); rozdzielczość: 70 000; maksymalny czas wtrysku: 200 ms przy typowych czasach wtrysku około 50 ms; automatyczna kontrola wzmocnienia (AGC): 3 000 000 jonów. Te ustawienia skutkują cyklem pracy wynoszącym około 550 ms, aby przeprowadzić skanowanie zarówno w trybie pozytywnym, jak i negatywnym.
   3. Ustalić metodę chromatograficzną. Zastosować kolumnę amidową (100 x 2,1 mm średnica wewn., 3,5 mm) do separacji związków w temperaturze pokojowej^13,15. Faza ruchoma A jest opisana powyżej, a faza ruchoma B to acetonitryl. Użyj gradientu liniowego w następujący sposób: 0 min, 85% B; 1,5 min, 85% B, 5,5 min, 35% B; 10 min, 35% B, 10,5 min, 35% B, 14,5 min, 35% B, 15 min, 85% B i 20 min, 85% B. Natężenie przepływu wynosi 0,15 ml/min od 0 do 10 min i od 15 do 20 min oraz 0,3 ml/min od 10,5 do 14,5 min.

2. Przygotowanie próbek metabolitów

1. Przygotować rozpuszczalnik ekstrakcyjny. Wymieszaj 40 ml metanolu (klasa LC-MS) i 10 ml wody (klasa LC-MS) w probówce o pojemności 50 ml i przechowuj w zamrażarce w temperaturze -80 °C przez co najmniej 1 godzinę przed użyciem. Uwaga: Ta procedura i poniższe kroki mogą być modyfikowane w celu ekstrakcji próbek tkanek biologicznych i płynów.
   1. Hodowla komórek raka jelita grubego HCT 8 w trzech 10-centymetrowych szalkach lub 6-dołkowych płytkach z pełną pożywką wzrostową, RPMI 1640 uzupełnioną 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą i 100 000 jednostek/l penicyliny i 100 mg/l streptomycyny.
   2. Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, szybko usuń podłoże i umieść naczynie lub talerz na suchym lodzie^13,15. Natychmiast dodać 1 ml rozpuszczalnika ekstrakcyjnego (80% metanolu/wody) i przenieść płytkę do zamrażarki o temperaturze -80 °C. Na naczynie o średnicy 10 cm dodaj 3 ml rozpuszczalnika ekstrakcyjnego do każdej studzienki. (Staraj się usunąć pożywkę tak bardzo, jak to możliwe, aby uniknąć efektu tłumienia jonów z powodu resztkowych soli z pożywki.)
   3. Pozostaw talerz na 15 minut. Wyjmij go z zamrażarki i zeskrob komórki do rozpuszczalnika na suchym lodzie. Przenieść roztwór do probówek Eppendorfa o pojemności 1,7 ml i odwirować z prędkością 20 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. (Przygotować metabolity komórkowe z trzech oddzielnych szalek w celu uzyskania trzech powtórzonych próbek. Celem przechowywania dwóch probówek jest posiadanie jednej jako kopii zapasowej.)
   4. Przenieś supernatant do dwóch nowych probówek Eppendorfa i wysusz je w próżni o dużej prędkości. Zajmuje to około 3-6 godzin, w zależności od używanej próżni. (Próbki można również suszyć przez noc w atmosferze azotu).
   5. Po wysuszeniu probówki z każdą próbką należy przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C. Gdy wszystko będzie gotowe, rozpuść jedną próbkę w 20 ml wody (klasa LC-MS) i wstrzyknij 5 ml do LC-QE-MS w celu analizy.

3. Ustawienie sekwencji próbek

1. Po prawidłowym przeprowadzeniu kalibracji na QE-MS, zrównoważyć kolumnę LC przez 5 minut z 85% A przy natężeniu przepływu 0,15 ml/min, co jest warunkiem początkowym gradientu LC.
2. Ustaw sekwencję próbek w kolejności losowej. Uwaga: W ten sposób rozkłada fluktuacje wprowadzone przez LC-MS do każdej próbki i zapewnia dokładniejsze porównanie między różnymi próbkami. Co 6 próbek dodać przebieg mycia, który ma tę samą metodę MS, z wyjątkiem gradientu LC wynosi 95% A przez 10 minut, a następnie następuje 5-minutowa równowaga kolumny przy 85% A przy natężeniu przepływu 0,15 ml/min. Dodaj ślepe próbki (100% wody) po każdym uruchomieniu mycia, aby ocenić tło systemu i przenieść poziomy.
3. Zapisz sekwencję, a gdy kolumna LC pokaże stabilne ciśnienie, około 400 psi, rozpocznij przebieg sekwencji. Jeżeli po tej sekwencji nie ma innej próbki, należy dodać przebieg zatrzymania na końcu sekwencji, który ma natężenie przepływu 0 ml/min na końcu gradientu i wybrać opcję "czuwania" po zakończeniu sekwencji.
4. Uruchom ponownie ten sam zestaw próbek 12 godzin po kalibracji. (Ma to na celu ocenę fluktuacji błędu masy po kalibracji).

4. Czyszczenie i konserwacja przyrządów do analizy końcowej

1. Pod koniec sekwencji przepłukać kolumnę 95% A przy natężeniu przepływu 0,2 ml/min przez 2 godziny i jeśli to konieczne, odwrócić kolumnę przed myciem.
2. Wyjmij kolumnę LC i bezpośrednio podłącz LC do źródła jonów za pomocą złączki. Przygotuj rozpuszczalnik czyszczący, wodę/metanol/kwas mrówkowy (v:v:v, 90:10:0,2), ustaw MS w trybie czuwania i umyj system LC-MS z natężeniem przepływu 0,1 ml/min przez 1 godzinę, aby usunąć resztki wytrąconych soli lub innych zanieczyszczeń. Zmniejsz natężenie przepływu, jeśli ciśnienie w układzie jest zbyt duże.
3. Ustawić temperaturę kapilary na 50 °C i wyjąć klatkę jonową. Ostrożnie wyjmij stożek jonowy i rurkę do wymiany jonów, gdy temperatura kapilary spadnie do 50 °C. Użyj szorstkiej siatki, takiej jak papier ścierny, aby usunąć zanieczyszczenia pozostawione na powierzchni stożka jonowego.
4. Umieścić probówkę do przenoszenia jonów w 15 ml probówce Falcon zawierającej 10 ml 90% wody/metanolu z 0,1% kwasem mrówkowym. Po sonikacji probówki w łaźni wodnej przez 20 minut, zdekantować rozpuszczalnik do środka, zastąpić go 10 ml czystego metanolu i sonikować przez kolejne 20 minut. (Jeśli to konieczne, sonikację można przeprowadzić w temperaturze 40 °C lub nawet wyższej, aby osiągnąć lepsze wyniki czyszczenia).

5. Analiza danych LC-MS

1. Aby upewnić się, że sekwencja próbki przebiega płynnie, po zakończeniu pierwszych dwóch próbek w sekwencji należy sprawdzić piki pod kątem nieznanych metabolitów. Użyj pliku csv zawierającego nazwy metabolitów, neutralny wzór chemiczny i tryb wykrywania (dodatni lub ujemny) jako plik wejściowy, a plik wyjściowy zawiera wyodrębnione piki i błąd masy w ppm. Jeśli kształt piku jest nieprawidłowy lub błąd masy jest opóźniony o więcej niż 5 ppm, należy zatrzymać resztę sekwencji i rozwiązać problem.
2. Wybierz metodę "wyrównania pików i ekstrakcji ramy" w dostępnym na rynku oprogramowaniu. Wybierz surowe dane z LC-MS i pogrupuj je. Pobrać próbki w środku sekwencji serii jako chromatograficzną próbkę referencyjną w celu wyrównania pików. Prześlij ziarno ramkowe zawierające znane metabolity do analizy metabolitów docelowych wraz z zebranymi danymi i odpowiadającym im zasiewem ramkowym.
3. Analizę danych w trybie dodatnim i ujemnym należy wykonywać oddzielnie. Użyj ustawienia domyślnego dla innych parametrów. Wyłącz funkcję przeszukiwania bazy danych i uruchom przepływ pracy. Eksportuj przetworzone dane jako arkusz Excela zawierający obszar piku każdej klatki. Pierwsze zestawy ramek odpowiadają metabolitom znajdującym się na liście docelowej. Uwaga: W przypadku celowanej analizy metabolitów informacje o metabolitach uzyskuje się na podstawie poprzednich badań^13,15.
4. W przypadku nieukierunkowanej analizy metabolitów należy wybrać metodę "ekstrakcji składników". Załaduj puste próbki do odejmowania tła. Ustaw próg natężenia szczytowego na 10⁵, szerokość m/z 10 ppm i stosunek sygnału do szumu 3.
5. Użyj bazy danych ludzkiego metabolomu do identyfikacji nieznanych związków. Użyj filtru CV, aby usunąć składniki z dużymi CV w powtórzonych próbkach. Ręcznie przejrzyj każdy komponent i wybierz te z dobrze zdefiniowanym szczytem lub stosunkowo dużą różnicą w różnych typach próbek do przeszukiwania bazy danych. Eksport danych z trafieniami w bazie danych. (Wyrównanie wartości szczytowej można pominąć, jeśli wynik wyrównania wartości szczytowej jest zbyt niski).

Wyniki

Dokładność danych metabolomicznych w dużym stopniu zależy od wydajności urządzenia LC-QE-MS. Aby ocenić, czy przyrząd działa w dobrym stanie i czy zastosowana metoda jest właściwa, z chromatografii jonów całkowitych (TIC) ekstrahuje się kilka znanych pików LC metabolitów, jak pokazano na rysunku 1. Metabolity polarne, w tym aminokwasy, produkty pośrednie glikolizy, produkty pośrednie TCA, nukleotydy, witaminy, ATP, NADP⁺ i tak dalej, mają dobrą retencję na kolumnie i dobre kształty pików w kol...

Dyskusja

Najważniejszymi etapami skutecznego profilowania metabolitów w komórkach przy użyciu tego protokołu są: 1) kontrolowanie pożywki wzrostowej i ostrożna ekstrakcja komórek; 2) dostosowanie metody LC w oparciu o konfigurację metody MS w celu zapewnienia, że w całym piku jest wystarczająca liczba (zwykle co najmniej 10) punktów danych do oceny ilościowej; 3) wykonanie kalibracji o niskiej masie przed uruchomieniem próbek; 4) wstrzykiwanie nie więcej niż 5 ml w celu uniknięcia przesunięcia czasu retencji i poszerzenia piku sp...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pozytywna mieszanka kalibracyjna	Thermo Scientific	#88323	Jest wrażliwy na światło. Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C
Ujemna mieszanka kalibracyjna	Thermo Scientific	#88324	Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C
Diazinon	Sant Cruz Biotechnology	#C0413	Powoduje podrażnienie oczu, więc pracuj w kapturze. Przechowywać w temperaturze 4 & deg;
Wkładka igły C H-ESI	Fisher Scientific	#1303200	Można ją wymienić lub wyczyścić 5% kwasem mrówkowym/wodą (usunąć gumowy pierścień), jeśli jest zatkana.
Kolumna amidowa	Xbridge Waters	#186004860	Kolumna ochronna jest zalecana w celu wydłużenia żywotności kolumny.