Method Article

Znakowanie biocytyny Juxtasomal w celu zbadania zależności struktura-funkcja poszczególnych neuronów korowych

DOI:

10.3791/51359

⸱

February 25th, 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Integrative Neurophysiology, Center for Neurogenomics and Cognitive Research, Neuroscience Campus Amsterdam, VU University Amsterdam

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zrozumieć strukturę sieci neuronowych, konieczna jest funkcjonalna i morfologiczna charakterystyka poszczególnych neuronów. Tutaj demonstrujemy znakowanie biocytyny przykłasomalnej, które umożliwia zapisy elektrofizjologiczne w konfiguracji zewnątrzkomórkowej, zachowując jednocześnie zdolność do wewnątrzkomórkowego znakowania neuronu w celu rekonstrukcji post hoc architektury dendrytycznej i aksonalnej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kora mózgowa charakteryzuje się wieloma warstwami i wieloma różnymi typami komórek, które razem jako sieć są odpowiedzialne za wiele wyższych funkcji poznawczych, w tym podejmowanie decyzji, zachowania sterowane sensorycznie lub pamięć. Aby zrozumieć, w jaki sposób tak skomplikowane sieci neuronowe wykonują takie zadania, kluczowym krokiem jest określenie funkcji (lub aktywności elektrycznej) poszczególnych typów komórek w sieci, preferencyjnie, gdy zwierzę wykonuje odpowiednie zadanie poznawcze. Dodatkowo równie ważne jest określenie budowy anatomicznej sieci i architektury morfologicznej poszczególnych neuronów, aby umożliwić inżynierię wsteczną sieci korowej. Dostępne obecnie przełomowe rozwiązania techniczne pozwalają na rejestrowanie aktywności komórkowej u obudzonych, zachowujących się zwierząt z cenną opcją identyfikacji post hoc zarejestrowanych neuronów. Tutaj demonstrujemy technikę znakowania biocytyny przez juktasomalną, która polega na rejestrowaniu skoków potencjału czynnościowego w konfiguracji zewnątrzkomórkowej (lub luźnej) za pomocą konwencjonalnych pipet z plastrami. Konfiguracja zapisu przybuksomalnego jest stosunkowo stabilna i ma zastosowanie w różnych warunkach behawioralnych, w tym w znieczuleniu, sedacji, obudzonej z głową, a nawet u swobodnie poruszającego się zwierzęcia. W ten sposób metoda ta pozwala na powiązanie specyficznego dla typu komórki potencjału czynnościowego wzrastającego podczas zachowania zwierząt z rekonstrukcją pojedynczych neuronów, a ostatecznie całego mikroobwodu korowego. W tym manuskrypcie wideo pokazujemy, w jaki sposób poszczególne neurony w konfiguracji juktasomalnej mogą być znakowane biocytyną u szczura znieczulonego uretanem w celu identyfikacji post hoc i rekonstrukcji morfologicznej.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sieci neuronalne składają się z wielu typów komórek, charakteryzujących się bardzo specyficznymi właściwościami morfologicznymi i fizjologicznymi1-7. W związku z tym poszczególne typy komórek wykonują wyspecjalizowane zadania w sieci (zob. np. Gentet i wsp.8 oraz Burgalossi i wsp.9). Dopiero zaczynamy rozumieć funkcje specyficzne dla typu komórki w sieciach neuronowych i wiele wciąż pozostaje do odkrycia. W tym celu wiele laboratoriów wdraża podejścia eksperymentalne, które pozwalają na analizę właściwości morfologicznych tej samej populacji neuronów, z której uzyskano parametry fizjologiczne1,10-15. Tutaj demonstrujemy technikę znakowania juxtasomal16,17, która polega na zapisach elektrofizjologicznych przy użyciu konwencjonalnych pipet z plastrami w konfiguracji zewnątrzkomórkowej (a więc nieinwazyjnej) w połączeniu z elektroporacją zarejestrowanego neuronu za pomocą biocytyny. Główną zaletą tego podejścia jest to, że nieinwazyjny charakter zapewnia, że impuls potencjału czynnościowego poszczególnych neuronów jest rejestrowany bez zmiany (np. dializy) wewnątrzkomórkowej zawartości komórki. Po elektroporacji, podejście juktasomalne zapewnia możliwość identyfikacji i rekonstrukcji komórek post hoc w celu powiązania funkcji (fizjologii) ze strukturą (morfologia). Zazwyczaj rekonstrukcja morfologiczna obejmuje rekonstrukcję morfologii dendrytycznej i aksonalnej, która może być rozszerzona o ilościowe określenie gęstości kręgosłupa i/lub boutonu, a nawet rekonstrukcję morfologii neuronów w rozdzielczości nanometrowej przy użyciu mikroskopii elektronowej. Technika zapisu juxtasomal może być stosowana do zapisów in vivo różnych typów komórek w warstwach korowych lub w obszarach podkorowych u wielu gatunków, chociaż większość badań stosowała tę technikę u małych gryzoni, takich jak myszy lub szczury. Nasze badania koncentrują się na rejestrowaniu i znakowaniu neuronów z pierwotnej kory somatosensorycznej szczura (S1) i obejmują wizualną identyfikację zarejestrowanych neuronów18, rekonstrukcje dendrytyczne w połączeniu z precyzyjną rejestracją w ustandaryzowanym układzie odniesienia w celu inżynierii wstecznej sieci korowych4,19 oraz szczegółową rekonstrukcję architektury aksonalnej w celu scharakteryzowania specyficznych dla typu komórki lokalnych i dalekosiężnych celów projekcyjnych20.

W porównaniu do alternatywnych technik zapisu in vivo (wewnątrzkomórkowych lub całokomórkowych), zapisy juxtasomalne są względnie stabilne i dlatego mogą być stosowane w różnych stanach behawioralnych, w tym znieczulonych21,22, uspokojonych14, obudzonych23, a nawet swobodnie poruszających się zwierząt9. Tutaj pokazujemy znakowanie przyklustomalne w S1 szczura znieczulonego uretanem, chociaż podkreślamy ogólne zastosowanie tej techniki do wielu preparatów z wyboru.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie zwierzęcia

Wszystkie procedury eksperymentalne są przeprowadzane zgodnie z prawem holenderskim i po ocenie przez lokalną komisję etyczną na Uniwersytecie VU w Amsterdamie, Holandia.

  1. Znieczulić szczura Wistar (P25-P45, ♂ /♀) izofluranem (2-3% tlenu), a następnie uretanem (20% w 0,9% NaCl, 1,6-1,7 g/kg) przez wstrzyknięcie dootrzewnowe. Oceń głębokość znieczulenia, monitorując wycofanie szczypania, odruchy powiek i ruchy wibrysów.
  2. Podać dodatkową dawkę uretanu (10% dawki początkowej) w przypadku, gdy zwierzę nie osiągnie wystarczającej głębokości znieczulenia lub gdy w trakcie eksperymentu zaobserwuje się drgawki wibrysów.
  3. Umieść znieczulone zwierzę na ramie stereotaktycznej wyposażonej w poduszkę grzewczą, włóż sondę temperatury doodbytniczej i utrzymuj temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 37,5±0,5 °C za pomocą poduszki grzewczej.
  4. Umieść głowę zwierzęcia w ramie stereotaktycznej; przytnij włosy na czubku głowy za pomocą nożyczek, aby skóra była widoczna.
  5. Wstrzyknąć podskórnie 100 μl 1% lidokainy (w 0,9% NaCl) do znieczulenia miejscowego w miejscu operacji i odczekać 3-5 minut. Usunąć skórę pokrywającą powierzchnię czaszki, przecinając w kierunku ogonowo-rostralnym i oczyścić pozostałą tkankę.
  6. Dokładnie oczyść czaszkę za pomocą 0,9% NaCl i chłonnych wacików.
  7. Określ współrzędne obszaru docelowego na lewej półkuli (dla pierwszorzędowej kory somatosensorycznej (S1): 2,5 mm z tyłu i 5,5 mm z boku do bregmy). Zaznacz miejsce na czaszce markerem chirurgicznym do skóry.
  8. Delikatnie zeskrob kość wiertłem dentystycznym z obszaru zainteresowania, aż kość stanie się przezroczysta, a naczynia krwionośne będą wyraźnie widoczne.
  9. Wykonaj kraniotomię o wymiarach 0,5 mm x 0,5 mm, wycinając skalpelem okienko w przerzedzonej czaszce (#11), unikając uszkodzenia opony twardej i naczyń krwionośnych. Opcjonalnie: zaznacz krawędzie kraniotomii za pomocą markera chirurgicznego do skóry, aby poprawić widoczność.
  10. Nałóż cienką warstwę superglue na suchą czaszkę, a następnie cement dentystyczny, aby zbudować wannę (tj. komorę rejestracyjną) otaczającą kraniotomię.
  11. Przyciąć wąsy po stronie przeciwległej dokładnie do 5 mm od mieszków włosowych. Opcjonalnie: podkreśl przycięte wąsy czarnym tuszem do rzęs.

2. Zapisy Juxtasomal i znakowanie biocytyny

  1. Wykonać pipety krosowe ze szkła borokrzemianowego o średnicy wewnętrznej końcówki ~1 μm w celu uzyskania elektrod o rezystancji 3-5 MΩ. Uwaga: Idealna morfologia pipety do zapisu juktasomalnego to stopniowe, smukłe zwężenie, niski kąt stożka i końcówka o średnicy ~1 μm (ilustracja 1).
  2. W zależności od głębokości zapisu (w stosunku do powierzchni nagrywającej) należy dostosować wymiary stożka elektrody nagrywającej. Niezwykle ważne jest, aby średnica stożka była mniejsza niż 75 μm w miejscu wejścia do mózgu, aby uniknąć uszkodzeń mechanicznych lub naprężeń w obszarze nagrywania. Oznacza to, że w przypadku powierzchownych zapisów korowych wymagane jest zwężenie 300-500 μm przy średnicy zewnętrznej maksymalnie 75 μm (ryc. 1A), podczas gdy nagrania ze stosunkowo głębokich warstw korowych wymagają dłuższego stożka 1500-1800 μm, ponownie o maksymalnej średnicy zewnętrznej 75 μm (przy 1800 μm od końcówki elektrody).
  3. Załadować pipetę z plastrem zwykłym dzwonkiem dla szczurów (NRR) uzupełnionym 2% biocytyną (patrz Tabela 1 dla roztworów i odczynników) i zamontować pipetę z plastrem na stopniu głowicy przymocowanym do mikromanipulatora.
  4. Ustaw kąt uchwytu elektrody na 34° w stosunku do płaszczyzny strzałkowej, aby konkretnie celować w kolumnę D2 szczura S1.
  5. Podłącz stopień główny do amplifier w trybie mostka (tj. cęgi prądowe).
  6. Umieścić pipetę z plastrem w bliskiej odległości od kraniotomii. Napełnij wannę 0,9% NaCl i określ rezystancję elektrody, która powinna wynosić od 3 do 5 MΩ, ocenianą przez zastosowanie impulsu kwadratowego z wtryskiem prądu dodatniego (1 nA, 200 ms wł./wył.).
  7. Ustalić nadciśnienie na poziomie 100-150 mbar i przesuwać pipetę krosową w krokach co 1 μm, stosując prąd dodatni w postaci impulsów kwadratowych (1 nA, 200 ms wł./wył.). Monitoruj solidną zmianę oporu po nawiązaniu kontaktu z oponą twardą. W tym momencie ustaw współrzędne mikromanipulatora na "zero", aby umożliwić dokładne pomiary głębokości.
  8. Przesuwaj w trybie krokowym 1 μm, aż pipeta z plastrem przeniknie do opony twardej, co wskazuje na nagły spadek rezystancji elektrody. Zdjąć ciśnienie docisku pipety.
  9. Szukaj pojedynczych jednostek, posuwając się naprzód w krokach co 1 μm. Monitoruj rezystancję elektrody w sposób ciągły, stosując impulsy włączania/wyłączania 200 ms. Wzrost rezystancji elektrody zazwyczaj wskazuje na bliskość pojedynczego neuronu. Przesuwaj elektrodę, aż zostaną zarejestrowane przebiegi dodatniego potencjału czynnościowego (AP) wynoszące ~2 mV (rysunki 2A i 2B).
  10. Opcjonalnie: Nagraj spontaniczny wzorzec wystrzeliwania neuronu i określ impuls wywołany wąsem, na przykład doogonowo odchylając poszczególne wąsy przez 200 ms pod kątem 3,3° za pomocą urządzenia piezoelektrycznego18.
  11. Przesuwaj elektrodę do momentu, aż rezystancja wyniesie 25-35 MΩ, a skoki będą miały amplitudy 3-8 mV, aby uzyskać optymalne warunki wypełnienia juksomowego. Napełnianie mikroskopowe należy rozpocząć od przyłożenia impulsów kwadratowych prądu dodatniego (1 nA, 200 ms wł./wył.). Powoli i stopniowo zwiększaj prąd w krokach co 0,1 nA, jednocześnie monitorując przebieg i częstotliwość AP (rysunki 2A i 2B).
  12. Monitoruj otwarcie membrany jako wyraźny wzrost częstotliwości AP podczas włączania fazy impulsu blokowego (rysunek 2C). Przebieg skoku podczas napełniania wykazuje zwiększoną szerokość i zmniejszoną hiperpolaryzację wtórną (rysunki 2C i 2D). Dodatkowe parametry to zwiększony szum lub małe (1-5 mV) ujemne przesunięcie DC.
  13. Zwiększ lub zmniejsz prąd (1 nA) podczas napełniania, aby utrzymać stabilną infuzję biocytyny. Zmniejsz lub zatrzymaj impulsy prądu po nagłym wzroście częstotliwości AP, aby uniknąć toksyczności spowodowanej nadmiernym napływem jonów zewnątrzkomórkowych, takich jak jony sodu. Uwaga: każdy neuron będzie inaczej reagował na bieżące wstrzyknięcie, a parametry znakowania juktasomów muszą być dostosowane w zależności od indywidualnych warunków nagrywania.
  14. Uważnie monitoruj sygnał po zatrzymaniu wtrysku prądu. Przebieg skoku po sesji napełniania jest zwykle poszerzony i wykazuje znacznie zmniejszony po hiperpolaryzacji. Poczekaj na regenerację neuronu, która jest widoczna, gdy przebieg kolca powróci do swoich pierwotnych właściwości (tj. obecności normalnej hiperpolaryzacji pooperacyjnej, ryc. 2).
  15. Powtórz sesje napełniania biocytyną po całkowitym wyzdrowieniu neuronu, aby zwiększyć obciążenie biocytyną i poprawić jakość barwienia.
  16. Cofać pipetę z plastrem w krokach co 1 μm, aż amplituda kolca zmniejszy się, aby zmniejszyć wszelkie naprężenia mechaniczne ogniwa. Odczekaj co najmniej 1 godzinę, aż biocytyna rozdyfunduje się wewnątrzkomórkowo, ściśle monitorując temperaturę ciała i oddech zwierzęcia.

3. Perfuzja zwierzęcia i usunięcie mózgu

  1. Przygotuj zestaw do perfuzji, przepłucz i wstępnie naładuj rurkę 0,9% NaCl.
  2. Umieść zwierzę na tacy chirurgicznej i zabezpiecz standardową taśmą do etykietowania. Zapewnić odpowiednią głębokość znieczulenia; Szczypanie stóp i odruchy powiek powinny być nieobecne.
  3. Wykonaj nacięcie przyśrodkowe lub boczne (5-6 cm) przez ścianę brzucha tuż pod klatką piersiową i postępuj w kierunku tylno-przednim, aby odsłonić mostek. Pociągnij mostek do przodu i ostrożnie oddziel wątrobę od przepony.
  4. Wykonaj małe nacięcie w przeponie, przetnij dolne żebra i kontynuuj nacięcie na całej długości jamy brzusznej, aby odsłonić serce.
  5. Usuń osierdzie.
  6. Włóż igłę do lewej komory i wykonaj nacięcie w prawym przedsionku. Perfaktorować 0,9% NaCl (~8 ml/min) aż do całkowitego odbarwienia wątroby.
  7. Zmień napar na 4% paraformaldehyd (PFA), aż do momentu, gdy pojawi się sztywność przedniej łapy i dolnej szczęki.
  8. Odetnij głowę szczura za pomocą nożyczek
  9. Usuń pozostałe mięśnie szyi i całkowicie odsłoń czaszkę.
  10. Umieść nożyczki w pniu mózgu po stronie grzbietowej i ostrożnie przetnij kość wzdłuż szwu strzałkowego, utrzymując pozycję grzbietową.
  11. Usuń kości z obu stron szwu strzałkowego, aby odsłonić mózg za pomocą kleszczy. Ostrożnie wyjmij oponę twardą, aby uniknąć uszkodzenia.
  12. Ostrożnie włóż szpatułkę do brzusznej strony mózgu i delikatnie wyjmij mózg.
  13. Po utrwaleniu całego mózgu przez noc w PFA w temperaturze 4 °C. Przełącz mózg na 0,05 M bufor fosforanowy (PB) i przechowuj w temperaturze 4 °C.

4. Krojenie mózgu na styczne odcinki

  1. Wyjmij mózg z 0,05 M PB i umieść go na bibule filtracyjnej skierowanej do przodu. Użyj ostrej żyletki, aby odciąć móżdżek wzdłuż płaszczyzny koronalnej i oddzielić półkule, przecinając wzdłuż środkowej płaszczyzny strzałkowej.
  2. Nałóż superglue na platformę montażową i zamontuj lewą półkulę na jej płaszczyźnie strzałkowej z przodem skierowanym w prawo. Przymocuj platformę montażową pod kątem 45° na wibratomie i zanurz mózg w 0,05 M PB.
  3. Przymocuj żyletkę do wibratomu i upewnij się, że pierwszy kontakt z powierzchnią mózgu znajduje się w środku przednio-tylnej płaszczyzny półkuli. Wyciąć 24 odcinki o wielkości 100 μm i zebrać je na 24-dołkowej płytce zawierającej 0,05 M PB.

5. Procedury histologiczne

  1. Wykonać protokoły histologiczne barwienia oksydazą cytochromową24 i metodą peroksydazy awidyny-biotyny zgodnie z wcześniej opisanymi metodami25. Opcjonalnie: wizualizacja biocytyny za pomocą fluorescencyjnych koniugatów awidyna/streptawidyna-Alexa. Umożliwia to dodatkowo podwójne barwienie za pomocą technik śledzenia wstecznego lub następczego.
  2. Przemyć skrawki 5 x 5 min 0,05 M PB i przygotować roztwór zawierający tetrachlorowodorek 3,-3'-diaminobenzydyny (DAB) do barwienia oksydazą cytochromową w celu uwidocznienia beczek w warstwie 4 (L4) S1 (patrz tabela 2 dla roztworów i odczynników). Inkubować sekcje 6-12 z pia w podgrzanym roztworze przez 30-45 minut w temperaturze 37 °C.
  3. Przepłukać skrawki 0,05 M PB przez 6 x 5 min i wygasić aktywność endogennej peroksydazy poprzez inkubację wszystkich sekcji w 3% H2O2 w 0,05 M PB przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT).
  4. Przepłukać skrawki 0,05 M PB przez 5 x 10 min. Inkubować sekcje w roztworze ABC (patrz Tabela 3 dla roztworów i odczynników) przez noc w temperaturze 4 °C.
  5. Przepłukać skrawki 0,05 M PB przez 5 x 10 minut i przygotować roztwór DAB do wizualizacji neuronu wypełnionego biocytyną (patrz Tabela 4 dla roztworów i odczynników). Inkubować skrawki w przefiltrowanym roztworze przez 45-60 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Przepłukać skrawki za pomocą 0,05 M PB przez 5 x 10 min. Zamontuj skrawki na szkiełkach mikroskopowych i szkiełku nakrywkowym za pomocą Mowiolu (patrz Tabela 5 dla roztworów i odczynników).
  7. Określ jakość etykietowania za pomocą mikroskopii świetlnej.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczegółowa wiedza na temat struktury 3D poszczególnych neuronów jest kluczowa dla wyjaśnienia zasad organizacji sieci neuronowych. Nasza metoda obejmuje proces uzyskiwania wysokiej jakości znakowania biocytyny z preparatu in vivo, umożliwiając w ten sposób klasyfikację neuronów post hoc i szczegółową rekonstrukcję dendrytycznej i aksonalnej architektury pojedynczych neuronów w wysokiej rozdzielczości. W zależności od jakości znakowania juktasomalnego, neurony są odzyskiwane z różną intensywnością DAB, ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda juktasomalna umożliwia rejestrację in vivo wzrostu potencjału czynnościowego z pojedynczych jednostek w różnych stanach behawioralnych (znieczulony, przytomny, unieruchomiony lub swobodnie poruszający się) z opcją znakowania biocytyną zarejestrowanego neuronu w celu klasyfikacji typu komórek post hoc i/lub rekonstrukcji 3D. Główną zaletą jest uzyskanie parametrów fizjologicznych w konfiguracji zewnątrzkomórkowej (a więc nieinwazyjnej), przy jednoczesnej możliwości wewnątrzkomórkowego znakowania n...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Authros nie mają nic do wyjawienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować profesorom. Huibertowi Mansvelderowi i Bertowi Sakmannowi za szerokie wsparcie, dr Marcelowi Oberlaenderowi za owocne dyskusje i śledzenie neuronów oraz Brendanowi Lodderowi za pomoc techniczną. Dane zostały pozyskane za pomocą ntrode VI dla LabView, hojnie dostarczonego przez R. Bruno (Columbia Univ., NY, USA). Badania te były wspierane przez Towarzystwo Maxa Plancka i Bernstein Center for Computational Neuroscience w Tybindze (finansowane przez niemieckie Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań Naukowych (BMBF; FKZ: 01GQ1002))( R.T.N.), Centrum Neurogenomiki i Badań Kognitywnych (CNCR), Neuroscience Campus Amsterdam (NCA), finansowanie C.P.J.d.K. (NWO-ALW #822.02.013 i ENC-Network #p3-c3) oraz Uniwersytetu VU w Amsterdamie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
System sterowania SM-6Luigs Neumann
LN- Mini 23 XYZ
LN- Mini 55 Manipulatorblock X2
Wzmacniacz Lynx-8Neuralynx
Wzmacniacz Axoclamp-2BAxon Instruments
Osada model EXL-M40Osada, Inc.
Urządzenie piezoelektrycznePhysik InstrumentePL140.10
LabViewNational Instruments, Austin, TX, USAOprogramowanie do akwizycji LabView
Ntrode Virtual Instrument R. Bruno, Columbia Univ., NY
Waciki chłonne SugiKettenbach30601
Cytochrom C z serca koniaSigmaC2506
Katalaza z wątroby bydlęcejSigmaC9322
DABSigmaD5637
H2O2Boom7047
Vectastain standard ABC-kitVectorPK6100
Triton X100SigmaT9284
UretanSigmaU2500
IsofluranePharmachemie45.112.110
LidokainaSigmaL5647
Simplex szybki cement dentystycznyKemdentACR308/ACR924
BiocytynaMolekula36219518
PFAMerck Millipore8187151000
Baza TrizmaSigmaT4661
Mowiol 4-88Aldrich81381
Glicerol klasy analitycznejFluka49767
HEPESSigmaH3375
NaClSigma Aldrich31434
KClSigma Aldrich60130
CaClSigma Aldrich22,350-6
MgCl2Fluka63072

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brown, S. P., Hestrin, S. Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits. Curr. Opin. Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).
  2. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat. Rev. Neurosci. 14 (3), 202-216 (2013).
  3. Dean, P., Porrill, J., Ekerot, C. F., Jorntell, H. The cerebellar microcircuit as an adaptive filter: experimental and computational evidence. Nat. Rev. Neurosci. 11 (1), 30-43 (2010).
  4. Oberlaender, M., et al. Cell type-specific three-dimensional structure of thalamocortical circuits in a column of rat vibrissal cortex. Cereb. Cortex. 22 (10), 2375-2391 (2012).
  5. Dyer, M. A., Cepko, C. L. Regulating proliferation during retinal development. Nat. Rev. Neurosci. 2 (5), 333-342 (2001).
  6. Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
  7. Urban, N., Tripathy, S. Neuroscience: Circuits drive cell diversity. Nature. 488 (7411), 289-290 (2012).
  8. Gentet, L. J., et al. Unique functional properties of somatostatin-expressing GABAergic neurons in mouse barrel cortex. Nat. Neurosci. 15 (4), 607-612 (2012).
  9. Burgalossi, A., et al. Microcircuits of functionally identified neurons in the rat medial entorhinal cortex. Neuron. 70 (4), 773-786 (2011).
  10. Bock, D. D., et al. Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons. Nature. 471 (7337), 177-182 (2011).
  11. Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).
  12. Herfst, L., et al. Friction-based stabilization of juxtacellular recordings in freely moving rats. J. Neurophysiol. 108 (2), 697-707 (2012).
  13. Marx, M., Gunter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat. Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
  14. Bruno, R. M., Sakmann, B. Cortex is driven by weak but synchronously active thalamocortical synapses. Science. 312 (5780), 1622-1627 (2006).
  15. Oberlaender, M., Ramirez, A., Bruno, R. M. Sensory experience restructures thalamocortical axons during adulthood. Neuron. 74 (4), 648-655 (2012).
  16. Joshi, S., Hawken, M. J. Loose-patch-juxtacellular recording in vivo-a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1. J. Neurosci. Methods. 156 (1-2), 37-49 (2006).
  17. Pinault, D. A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin. J. Neurosci. Methods. 65 (2), 113-136 (1996).
  18. de Kock, C. P., Bruno, R. M., Spors, H., Sakmann, B. Layer and cell type specific suprathreshold stimulus representation in primary somatosensory cortex. J. Physiol. 581 (1), 139-154 (2007).
  19. Egger, R., Narayanan, R. T., Helmstaedter, M., de Kock, C. P., Oberlaender, M. 3D reconstruction and standardization of the rat vibrissal cortex for precise registration of single neuron morphology. PLoS Comput. Biol. 8 (12), (2012).
  20. Oberlaender, M., et al. Three-dimensional axon morphologies of individual layer 5 neurons indicate cell type-specific intracortical pathways for whisker motion and. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (10), 4188-4193 (2011).
  21. Sakata, S., Harris, K. D. Laminar structure of spontaneous and sensory-evoked population activity in auditory cortex. Neuron. 64 (3), 404-418 (2009).
  22. de Kock, C. P., Sakmann, B. High frequency action potential bursts (>or= 100 Hz) in L2/3 and L5B thick tufted neurons in anaesthetized and awake rat primary somatosensory cortex. J. Physiol. 586 (14), 3353-3364 (2008).
  23. de Kock, C. P., Sakmann, B. Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (38), 16446-16450 (2009).
  24. Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
  25. Horikawa, K., Armstrong, W. E. A versatile means of intracellular labeling: injection of biocytin and its detection with avidin conjugates. J. Neurosci. Methods. 25 (1), 1-11 (1988).
  26. O'Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67 (6), 1048-1061 (2010).
  27. Veinante, P., Deschenes, M. Single-cell study of motor cortex projections to the barrel field in rats. J. Comp. Neurol. 464 (1), 98-103 (2003).
  28. Boudewijns, Z. S., et al. Layer-specific high-frequency action potential spiking in the prefrontal cortex of awake rats. Front. Cell. Neurosci. 7, 99 (2013).
  29. Oberlaender, M., Bruno, R. M., Sakmann, B., Broser, P. J. Transmitted light brightfield mosaic microscopy for three-dimensional tracing of single neuron morphology. J. Biomed. Opt. 12 (6), 064029 (2007).
  30. Boudewijns, Z. S., et al. Semi-automated three-dimensional reconstructions of individual neurons reveal cell type-specific circuits in cortex. Commun. Integr. Biol. 4 (4), 486-488 (2011).
  31. Bruno, R. M., Hahn, T. T., Wallace, D. J., de Kock, C. P., Sakmann, B. Sensory experience alters specific branches of individual corticocortical axons during development. J. Neurosci. 29 (10), 3172-3181 (2009).
  32. Schubert, D. Observing without disturbing: how different cortical neuron classes represent tactile stimuli. J. Physiol. 581 (1), 5 (2007).
  33. Neumann, E., Kakorin, S., Toensing, K. Fundamentals of electroporative delivery of drugs and genes). Bioelectrochem. Bioenerg. 48 (1), 3-16 (1999).
  34. Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Juxtasomal RecordingBiocytin LabelingCortical NeuronsAction Potential SpikingMorphological ReconstructionSensory CortexPatch PipettesCurrent InjectionsBiotin StainingDigital Reconstruction

Related Articles