Protokół analizy replikacji wirusa zapalenia wątroby typu C

Summary

Wirus zapalenia wątroby typu C (HCV) jest głównym ludzkim patogenem, który powoduje choroby wątroby, w tym marskość wątroby i raka. System hodowli komórek zakaźnych HCV jest niezbędny do zrozumienia molekularnego mechanizmu replikacji HCV i opracowania nowych podejść terapeutycznych. W tym miejscu opisujemy protokół badania różnych etapów cyklu replikacji HCV.

Abstract

Wirus zapalenia wątroby typu C (HCV) dotyka 3% światowej populacji i powoduje poważne dolegliwości wątroby, w tym przewlekłe zapalenie wątroby, marskość wątroby i raka wątrobowokomórkowego. HCV jest wirusem otoczkowym RNA należącym do rodziny Flaviviridae. Obecne leczenie nie jest w pełni skuteczne i powoduje niepożądane skutki uboczne. Nie ma dostępnej szczepionki przeciwko HCV. W związku z tym konieczne są dalsze wysiłki na rzecz opracowania szczepionki i lepszej terapii. System hodowli komórek HCV ma kluczowe znaczenie dla badania różnych etapów wzrostu HCV, w tym wnikania wirusa, replikacji genomu, pakowania i wyjazdu. W przedstawionej obecnie procedurze użyliśmy chimerycznego wirusa intragenotypu 2a typu dzikiego, FNX-HCV, oraz rekombinowanego wirusa FNX-Rluc przenoszącego gen reporterowy Lucyferazy Renilla do zbadania replikacji wirusa. Ludzka linia komórkowa wątrobiaka (oparta na Huh-7) została wykorzystana do transfekcji transkrybowanych in vitro genomowych RNA HCV. Supernatanty z hodowli bezkomórkowych, lizaty białkowe i całkowite RNA zebrano w różnych punktach czasowych po transfekcji w celu oceny wzrostu HCV. Status replikacji genomu HCV oceniano za pomocą ilościowego RT-PCR i wizualizacji obecności dwuniciowego RNA HCV. Ekspresję białka HCV zweryfikowano za pomocą testów Western blot i immunofluorescencji przy użyciu przeciwciał specyficznych dla białek HCV NS3 i NS5A. Komórki transfekowane RNA HCV uwolniły zakaźne cząstki do supernatantu hodowli i zmierzono miano wirusa. Testy lucyferazy wykorzystano do oceny poziomu replikacji i zakaźności reporterowego HCV. Podsumowując, przedstawiamy różne testy wirusologiczne do charakteryzowania różnych etapów cyklu replikacji HCV.

Introduction

Wirus zapalenia wątroby typu C (HCV) powoduje marskość wątroby i raka wątroby. Dotyka 170 milionów ludzi na całym świecie, a 350 000 osób umiera rocznie^1-3. HCV jest wirusem o dodatniej nici RNA o wielkości genomu 9,6 kb. Genom HCV jest tłumaczony jako pojedyncza poliproteina składająca się z ~ 3,000 reszt aminokwasowych, która jest proteolitycznie rozszczepiana przez różne proteazy komórkowe i wirusowe na 10 polipeptydów. HCV jest prototypem wirusa z rodzaju Hepacivirus i należy do rodziny Flaviviridae⁴. Po ekspozycji HCV powoduje przewlekłą infekcję u 80% osób. Zakażenie przebiega w większości bezobjawowo, a szybka diagnoza może pozwol....

Protocol

Ogólny zarys protokołu jest zilustrowany na rysunku 1.

1. Komórki

1. Przygotuj kompletną pożywkę wzrostową, która zawiera 10-15% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 10 mM aminokwasów endogennych, 10 mM Hepes, penicylinę (100 jednostek/ml), streptomycynę (100 mg/ml) i 2 mM L-glutaminę.
2. Utrzymuj komórki Huh-7.5.1¹³ w kompletnej pożywce wzrostowej zawierającej powyższe suplementy do analizy in vitro cyklu replikacji wirusa zapalenia wątroby typu C.
3. Hodowla szczepów wirusa w komórkach Huh-7.5.1 z określoną uzupełnioną pożywką wzrostową w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .

Results

Wirus zapalenia wątroby typu C jest wirusem RNA. Tak więc, w celu manipulacji genetycznej, genomowe cDNA HCV zostało sklonowane do bakteryjnego wektora plazmidowego. Sekwencja promotora polimerazy RNA T7 została wprowadzona bezpośrednio przed końcem 5' genomu HCV. Ogólny zarys przebiegu analizy HCV przedstawiono na rysunku 1. Aby wygenerować genomowy RNA HCV z precyzyjnym końcem 3', genom HCV zawierający plazmid jest cięty enzymem restrykcyjnym XbaI, a wygenerowany jednoniciowy zwis jest tępiony.......

Discussion

Na tej ilustracji opisano metodę analizy cyklu replikacji wirusa zapalenia wątroby typu C. HCV jest ludzkim patogenem i należy ściśle przestrzegać przepisanego protokołu bezpieczeństwa biologicznego. Zakaźne systemy hodowli komórek HCV zostały opisane wcześniej^11-13,16,17. Jest kilka kluczowych punktów, które wdrażamy, postępując zgodnie z ilustrowanym protokołem. Po pierwsze, bardzo ważne jest posiadanie dobrej jakości nienaruszonego genomowego RNA wirusa o pełnej długości do dalszych badań. Plazmid wejściowy.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM)	Fisher Scientific	10-017-CV
Aminokwas endogenny	Fisher Scientific	MT25025CI
HEPES	Life Technologies	15630080
Glutamax	Life Technologies	35050061
Opti-MEM Zredukowane podłoże w surowicy, bez fenolu Red	Life Technologies	11058-021
Huh-7.5.1		Badawczy Scripps	Linia komórkowa została uprzejmie dostarczona przez dr Francisa Chisari dr Arumugaswamiemu w ramach wykonanego MTA między Instytutem Badawczym Scripps a plazmidami Cedars-Sinai Medical Center
(pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc i pFNX-Rluc Pol null)		Medyczne Cedars-Sinai	Plazmidy HCV zostały zsyntetyzowane przez dr Arumugaswami przy użyciu nakładających się oligonukleotydów.
XbaI	Nowa Anglia Biolabs Inc.	R0145S
Nukleaza fasoli mung	Nowa Anglia Biolabs Inc.	M0250S
T7 RiboMAX Express System produkcji RNA na dużą skalę Promega		P1320
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
Nanodrop 2000	Thermo Scientific	Nanodrop 2000
Kuweta do elektroporacji (4 mm)	Bioexpress	E-5010-4
Gene Pulser Xcell Total System	Bio-Rad	165-2660
mysie przeciwciało monoklonalne anty-dsRNA J2	Angielski & Doradztwo Naukowe Kft.
Koza anty-królicza IgG Alexa Fluor 488	Life Technologies	A11008
Kozia anty-królicza IgG Alexa Fluor 594	Life Technologies	A11020
Pakiet membran PVDF	Bio-Rad	162-0263
Blotting Grade Blocker Beztłuszczowe mleko w suchym mleku	Bio-Rad	170-6404XTU
Tween-20	Bio-Rad	170-6531XTU
Przeciwciało przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C NS3 [8 G-2]	Abcam	ab65407
Przeciwciało przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C NS3 [H23]	Abcam	ab13830
Kozia anty-mysia IgG skoniugowana z peroksydazą chrzanową (HRP)	Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.	115-035-003
Odczynniki do wykrywania Western Blotting Amersham ECL Prime	GE Healthcare Nauki Przyrodnicze	RPN2236
INDEKS GÓRNY III RT	Life Technologies	18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX	Life Technologies	11744500
System PCR w czasie rzeczywistym ViiA 7	Life Technologies	NA
Zestaw systemu oznaczania lucyferazy Renilla	Promega	E2810
RNaz DNaza	Promega	M6101
GloMax-Multi Detection System (luminometr)	Preparat Promega