Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Barwienie histochemiczne drugorzędowych elementów ściany komórkowej Arabidopsis thaliana

42.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51381

⸱

13 maja 2014

 , 
1Feedstocks Division, Joint Bioenergy Institute, 2Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory

W tym artykule

Podsumowanie

Skład ściany komórkowej rośliny różni się w zależności od typu tkanki i może zawierać ligninę, celulozę, hemicelulozy i pektyny. Opracowano różne techniki barwienia w celu wizualizacji różnic na poziomie typu komórki. Niniejszy artykuł jest kompilacją powszechnie stosowanych technik barwienia ścian komórkowych.

Streszczenie

Arabidopsis thaliana jest organizmem modelowym powszechnie używanym do zrozumienia i manipulowania różnymi procesami komórkowymi u roślin, i był szeroko stosowany w badaniach nad wtórnym tworzeniem ścian komórkowych. Wtórne odkładanie się ściany komórkowej następuje po ułożeniu pierwotnej ściany komórkowej, proces przeprowadzany wyłącznie przez wyspecjalizowane komórki, takie jak te tworzące naczynia krwionośne i tkanki włókniste. Większość drugorzędowych ścian komórkowych składa się z celulozy (40–50%), hemicelulozy (25–30%) i ligniny (20–30%). Wyizolowano kilka mutacji wpływających na wtórną biosyntezę ściany komórkowej, a odpowiadające im mutanty mogą, ale nie muszą, wykazywać oczywiste zmiany składu biochemicznego lub fenotypy wizualne, ponieważ mutacje te mogą być maskowane przez reakcje kompensacyjne. Procedury barwienia były historycznie stosowane w celu pokazania różnic na podstawie komórkowej. Metody te są wyłącznie wizualnymi środkami analizy; Niemniej jednak ich rola w szybkiej i krytycznej analizie ma ogromne znaczenie. Czerwień kongijska i biel kalkofluorowa są barwnikami używanymi do wykrywania polisacharydów, podczas gdy Mäule i floroglucynol są powszechnie używane do określania różnic w ligninie, a błękit toluidynowy O jest używany do różnicowego barwienia polisacharydów i ligniny. Pozornie proste techniki cięcia, barwienia i obrazowania mogą być wyzwaniem dla początkujących. Począwszy od przygotowania próbki przy użyciu modelu A. thaliana, badanie to szczegółowo opisuje protokoły różnych metodologii barwienia, które można łatwo wdrożyć do obserwacji organizacji komórek i tkanek w wtórnych ścianach komórkowych roślin.

Wprowadzenie

Roślinna ściana komórkowa zawiera mnóstwo informacji w różnych składnikach: ligninie, celulozie, hemicelulozach (ksylana, glukuronoksylanu, ksyllukanu, arabinoksylanu, mieszanym glukan lub glukomannanu) i pektynie. Techniki histologiczne dostarczają ważnych wskazówek wizualnych w badaniu różnic w wtórnych ścianach komórkowych na poziomie organizacyjnym i komórkowym. Opracowano różne techniki histologiczne, które można znaleźć w literaturze, ale techniki te mogą być trudne i czasochłonne dla początkujących, ponieważ bardzo szczegółowe protokoły z prostymi instrukcjami wizualnymi są rzadko, jeśli w ogóle, dostępne. Celem tego badania jest dostarczenie prostych wskazówek dotyczących technik barwienia histologicznego w celu uzyskania wysokiej jakości obrazów.

Cięcie tkanki macierzystej jest pierwszym krokiem w wizualizacji ścian komórkowych i kształtów komórek. Chociaż ręcznie wycinane sekcje są niedrogie i zajmują mniej czasu na przygotowanie, użycie wibratomu zapewnia spójność i daje wysokiej jakości obrazy. Użycie wibratomu pozwala na uzyskanie lepszej jakości danych poprzez generowanie równych odcinków o tej samej grubości, co pomaga uzyskać ostre obrazy i znacznie zmniejsza ryzyko powstania niedokładnych różnic między próbkami, które byłyby po prostu spowodowane złym przygotowaniem próbki. Używanie żywic do utrwalania świeżych próbek może być wyzwaniem dla początkujących i może być czasochłonne nawet dla ekspertów, gdy analiza musi być wykonana szybko. Ponadto niemożliwe staje się zmierzenie jakiejkolwiek aktywności biologicznej próbki, gdy została ona osadzona w żywicy. Jedna prosta technika, która wykorzystuje agarozę i domową pleśń, jest pomocna w osadzaniu tkanek łodygi, a także może być wykorzystywana w innych zastosowaniach wymagających sekcji tkanek miękkich. W porównaniu z zatapianiem próbek w żywicy, metoda ta ma tę zaletę, że utrzymuje tkanki przy życiu i ogranicza manipulację próbką. Cięcie tkanek za pomocą wibratomu jest bardzo precyzyjne i pozwala na uzyskanie jednorodnych skrawków, które w zależności od celu badania można następnie zastosować z kilkoma różnymi technikami barwienia.

Najprostsze metody wizualizacji ligniny i innych aromatów wykorzystują światło ultrafioletowe (UV). Wzbudzanie cząsteczek aromatycznych za pomocą światła UV jest starą techniką, ale nadal jest to jedno z najszybszych podejść do wizualizacji ligniny. Jednak wizualizacja UV w rzeczywistości nie jest idealna do wykrywania ligniny, ponieważ światło UV pobudza inne aromaty. Lignina składa się głównie z trzech elementów budulcowych, monolignoli (alkoholi hydroksycynamonylowych: alkohol oniferylowy, alkohol sinapylowy i alkohol p-kumarylowy)1-3. Barwienie floroglucynolem może dostarczyć wskazówek co do stopnia obecności aldehydów cynamonowych w ksylemie, błonniku i tkankach tchawicy4. Floglucynol jest dobrym wskaźnikiem ogólnych aldehydów cynamonowych i może odróżniać aldehydy cynamonowe od innych aromatów. Monomery alkoholu sinapylowego można wykryć i rozróżnić za pomocą barwnika Mäule. Błękit toluidynowy O jest barwnikiem polichromatycznym i dlatego ma zdolność barwienia różnych elementów ściany komórkowej na różne kolory5,6. Podstawowym zastosowaniem błękitu toluidynowego O jest wykrywanie pektyny i ligniny5,6. Zaletą stosowania błękitu toluidynowego O jest to, że wiele elementów ściany komórkowej można uwidocznić w jednym kroku. Zarówno calcofluor white, jak i congo red są łatwe w obróbce i mogą być używane do wizualizacji celulozy. Biel kalkofluorowa barwi celulozę, modzel i inne niepodstawione lub słabo podstawione β-glukany6-9, podczas gdy czerwień kongo barwi bezpośrednio β-(1→4)-glukany, a zwłaszcza celulozę10,11. Celem tego badania jest dostarczenie prostych wskazówek dotyczących stosowania wyżej wymienionych technik barwienia w celu uzyskania wysokiej jakości obrazów z łodyg A. thaliana.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Osadzanie trzonu

  1. Przygotować 7% roztwór agarozy w wodzie (7 g agarozy do elektroforezy w 100 ml wody destylowanej). Rozpuścić agarozę w autoklawie przez 20 minut lub w kuchence mikrofalowej przez 20 minut przy najniższej intensywności (np. 10% intensywności w kuchence mikrofalowej o mocy 1 250 W).
  2. Przygotuj domową formę do osadzania łodyg za pomocą plastikowych fiolek.
    1. Za pomocą żyletki odetnij stożkowe dno probówki mikrowirówkowej z nakrętką o pojemności 2 ml (część A). Za pomocą igły strzykawkowej przebić otwór w nasadce rurki nieco większy niż średnica trzpienia, który ma być osadzony. Następnie odetnij 0,5 cm od dna probówki do mikrowirówki o pojemności 0,6 ml (część B).
    2. Dodać odciętą 0,5 cm część probówki do mikrowirówki o pojemności 0,6 ml do wstępnie pokrojonej probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml. Uszczelnij obie części za pomocą Parafilm (Rysunek 1). UWAGA: Dno probówki jest nacięte w celu ułatwienia usunięcia osadzonej próbki po zestaleniu się agarozy. Otwór w nasadce pomoże w utrzymaniu łodygi stabilnie, gdy łodyga jest osadzona w agarozie. Forma będzie służyć do przytrzymywania agarozy i utrzymywania łodygi prosto podczas osadzania. Parafilm utrzyma dwie części, A i B, aż agaroza zostanie zastygnięta, a łodyga osadzona.
    3. Za pomocą żyletki odetnij odcinek łodygi od obszaru zainteresowania (np. środka pierwszego międzywęźla łodygi). UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby łodyga została przycięta tuż przed osadzeniem, aby uniknąć zniszczenia przez odwodnienie. Alternatywnie łodyga może być tymczasowo przechowywana na płytce zawierającej bibułę filtracyjną zwilżoną wodą. Płytkę tę można umieścić na lodzie, aż będzie gotowa do osadzenia, aby zapobiec odwodnieniu i deformacji tkanek. Przechowywanie łodygi przez okres dłuższy niż 30 minut bez dużej wilgotności spowoduje wyschnięcie łodygi.
  3. Rozpuść agarozę w kuchence mikrofalowej o niskiej intensywności. UWAGA: Butelka zawierająca agarozę może być gorąca. Użyj rękawicy, aby podnieść butelkę. Pozostawić stopioną agarozę w temperaturze pokojowej (między 20 °C a 25 °C), aż ostygnie do około 50 °C.
  4. Powoli odpipetować 5 ml agarozy do przygotowanej plastikowej formy, aby napełnić fiolkę. UWAGA: Upewnij się, że w foremkach nie ma pęcherzyków powietrza. Pęcherzyki powietrza spowodują szczeliny w formie agarozy i nie pokryją całkowicie próbki łodygi, co ostatecznie doprowadzi do nierównego cięcia odcinków próbki.
    1. Pozwól agarozie ostygnąć przez 30 do 60 sekund, aby stała się półstała. Przetestuj małą wykałaczką, upewniając się, że może wniknąć i stanąć, ale nie unosić się w agarozie. UWAGA: Jeśli łodyga zostanie umieszczona, gdy agaroza jest jeszcze gorąca, uszkodzi próbkę poprzez pomarszczenie łodygi, niszcząc morfologię komórki.
    2. Umieść łodygę w tej fiolce wypełnionej agarozą. Upewnij się, że trzpień pozostaje prosty. Umieść perforowaną nasadkę w taki sposób, aby końcówka trzpienia była przytrzymywana przez nasadkę. Nie przekręcaj zakrętki. Czasami więcej niż jedna łodyga (jednego rodzaju) może być osadzona w jednej fiolce; Ale w tym konkretnym przypadku nie używaj nasadki. UWAGA: Jeśli zakręcana nakrętka zostanie obrócona, trzpień zostanie skręcony.
  5. Pozostawić fiolkę w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C na 10-30 minut, aż stwardnieje.
  6. Wyjmij formę, delikatnie wysuwając ją z tuby. Otwórz Parafilm. Delikatnie popchnij kciukiem spód części B formy, aby uwolnić zestaloną agarozę z części A na szklane szkiełko mikroskopowe.
  7. Pokrój łodygę osadzoną w agarozie na trzy w przybliżeniu równe kawałki o długości 1,2 cm. Wytnij część łodygi, której nie było w agarozie i wyrzuć ją.
    1. Przechowuj te kawałki agarozy z osadzonymi łodygami w hermetycznych probówkach do mikrowirówek o pojemności 2 ml w ciemnym pudełku w temperaturze 4 °C, aż będą gotowe do podziału. Alternatywnie, probówki należy przechowywać w temperaturze 4 °C maksymalnie przez tydzień. UWAGA: Przechowywanie jest możliwe, ale eksperymentator musi być świadomy, że osadzone łodygi są nadal żywe i, w zależności od eksperymentu, artefakty mogą zostać potencjalnie wprowadzone.

2. Cięcie trzpienia

  1. UWAGA: Przeczytaj uważnie instrukcję wibratomu i postępuj zgodnie ze wszystkimi instrukcjami bezpieczeństwa.
  2. Upewnij się, że krążek z próbką jest czysty i całkowicie suchy (wolny od jakichkolwiek ciał stałych lub cieczy). Wyczyść krążek próbki żyletką, aby usunąć resztki kleju z poprzednich eksperymentów i umyj wodą. Następnie osusz ręcznikiem papierowym. UWAGA: Zapewni to, że klej będzie działał dobrze i zwiąże się z próbką agarozy. Jeśli ten krok nie zostanie wykonany prawidłowo, możliwe jest, że próbka może nie przylegać do krążka, a później spowoduje upadek próbki z dysku podczas cięcia.
    1. Użyj miękkich chusteczek papierowych, aby usunąć wilgoć z bloku agarozy zawierającego próbki.
    2. Umieść małą kroplę kleju tkankowego na krążku próbki. Rozprowadź klej, aby pokryć obszar na środku płytki, używając końcówki butelki z klejem. Szybko umieść blok agarozy tak, aby próbki były prostopadłe lub równoległe do płytki, odpowiednio dla przekrojów poprzecznych lub podłużnych. Pozwól klejowi przymocować próbkę do krążka próbki w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C przez 10-30 minut. UWAGA: Jest to krok, w którym zależy od czasu.
  3. Zamocuj krążek z próbką na miejscu na tacy buforowej lub korycie. Blok agarozy wraz z sekcjami powinien być ustawiony równolegle do żyletki. Napełnij tackę buforową wodą destylowaną o temperaturze pokojowej, aż próbki zostaną całkowicie zanurzone.
  4. Przetnij żyletkę na pół, a następnie przytnij końce solidnymi nożyczkami, aby ostrze pozostało całkowicie płaskie. Przymocuj połowę wstępnie przyciętej żyletki do uchwytu noża.
    1. Ustaw kąt na uchwycie noża na 84°, prędkość na 0,90 mm/s (pozycja 8 na wibratomie) i częstotliwość na 50 Hz (pozycja 5 na wibratomie). Cięte odcinki o grubości 100 μm. Użyj trybu ciągłego. UWAGA: Ta grubość została wybrana, aby zapewnić, że tkanka może wytrzymać różne zabiegi kwasowe i zasadowe stosowane w niektórych protokołach barwienia. Ustaw okno do cięcia i odczekaj 15-20 minut w trybie ciągłym, aby wibratom przeciął blok agarozy o długości około 1,2 cm.
  5. Zebrać skrawki za pomocą jednorazowej plastikowej pipety podczas dzielenia na tacę buforową. Alternatywnie, skrawki można przenieść z tacki buforowej do szklanej zlewki, a następnie na przezroczystą płytkę Petriego. Przenieść kilka skrawków do probówek mikrowirówek o pojemności 2,0 ml. Uwaga: Próbki są pobierane z płytki Petriego, ponieważ łatwiej jest zobaczyć skrawki na wyraźnym tle, a także dlatego, że tacę buforową można zagruntować pod następną próbkę.
  6. Skrawki można przechowywać w probówce o pojemności 50 ml lub zbierać i przechowywać w probówkach mikrowirówkowych o pojemności od 1,5 do 2 ml w temperaturze 4 °C przez 30 do 60 minut. UWAGA: Przechowywanie skrawków przez dłuższy czas spowoduje pogorszenie jakości obrazu.

3. Ustawienia mikroskopu i kamery do obrazowania

  1. Dostosuj oświetlenie Koehlera w mikroskopie. Wybierz cel. Najpierw skoncentruj się na próbce. Ustaw natężenie światła na poziomie połowy lub niższym. Zamknij przysłonę polową (FD) i przysłonę (AP) lub ustaw je na najniższe możliwe ustawienie dla tego konkretnego obiektywu.
    1. Im większe powiększenie, tym większy będzie pierścień. Użyj pokrętła ostrości kondensatora, aby jak najostrzej ustawić przysłonę pola.
    2. Powoli przesuń obraz tęczówki polowej (mały pierścień w kształcie sześciokąta) do środka za pomocą pokręteł centrujących kondensator (w kształcie szpilki otaczające kondensator). Powoli zwiększaj przysłonę (FD) tak, aby przysłona pola docierała do krawędzi. Przestań zwiększać FD zaraz po tym, jak tęczówka pola przekroczy krawędź.
    3. Powoli zwiększaj przysłonę (AP), aby dostosować kontrast. Dostosuj natężenie światła zgodnie z wymaganiami. UWAGA: Oświetlenie Koehlera należy dostosować do każdego celu, każdego dnia eksperymentalnego. Zanotuj liczby uzyskane po korekcie dla danego dnia. Liczby te będą ponownie wykorzystywane za każdym razem, gdy cele będą zmieniane tam i z powrotem w danym dniu.
  2. Dostosuj przysłonę, intensywność, czas ekspozycji, wzmocnienie i filtry zgodnie z opisem w Tabeli 1. Informacje te należy traktować wyłącznie jako wskazówkę.
  3. Do rejestrowania obrazów fluorescencyjnych należy używać aparatu cyfrowego o wysokiej rozdzielczości z wielkoformatowym układem CCD bez mechanicznej migawki, a do robienia zdjęć fluorescencyjnych — aparatu o wysokiej rozdzielczości i szybkości
    4. .
  4. Przetwarzaj slajdy za pomocą standardowego oprogramowania. Załaduj oprogramowanie. Kliknij "Pobierz" i "Ustaw kamerę/tablicę", a następnie wybierz kamerę, która ma być używana. Kliknij "OK". Kliknij "Acquire", a następnie "Color tab". W sekcji "Color tab" wybierz "Bayer method", a następnie "Average four". Dodaj sugerowane wzmocnienie (czerwony, zielony, niebieski) z tabeli 1. Wybierz zakładkę "Ustaw zapis" i kliknij w katalog, w którym mają być przechowywane obrazy. Ustaw "Czas ekspozycji" z sugestii w Tabeli 1. Ustaw "Binning" na "1" i "Live binning" na "1". Skoncentruj się na interesującym Cię regionie, a następnie kliknij "Zapisz na żywo".
  5. Obrazy wyjściowe w oprogramowaniu aparatu są w formacie "TIF". Przeanalizuj obrazy pod kątem histochemii typów komórek. Używaj standardowego oprogramowania komputerowego do dalszych zastosowań prezentacji i publikacji.

4. Obrazowanie w ultrafiolecie i jasnym polu

  1. Użyj pipety o pojemności 1 ml z naciętą końcówką pipety, aby można było łatwo odpipetować fragmenty. Delikatnie odpipetuj skrawki do końcówki i na szkiełko mikroskopowe. Przykryj sekcje szkiełkiem nakrywkowym. Obserwuj sekcje w świetle UV lub oświetleniu w jasnym polu.

5. Barwienie floroglucynolu-HCl (Wiesner)12

  1. Rozpuścić 0,3 g floroglucynolu w 10 ml absolutnego alkoholu etylowego, aby przygotować 3% roztwór floroglucynolu. Zmieszać jedną objętość stężonego HCl (37 N) z dwiema objętościami 3% floroglucynolu w etanolu; tym roztworem jest floroglucynol-HCl (Ph-HCl) lub barwnik Wiesnera. UWAGA: Ten roztwór należy przygotować na świeżo w dniu barwienia i nie można go przechowywać, ponieważ roztwór z czasem ulegnie degradacji, a barwienie stanie się nieskuteczne. UWAGA: HCl jest silnie, dlatego należy zachować szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z plamą Ph-HCl.
  2. Przenieść sekcje trzpienia do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2,0 ml. Dodać 1 ml roztworu Ph-HCl do probówki zawierającej skrawki i natychmiast ją zakryć, ponieważ HCl w barwie Ph-HCl jest silnie. Delikatnie przesuń rurkę, aby upewnić się, że wszystkie sekcje są poplamione. Alternatywą dla tego etapu jest pozostawienie nasadki probówki otwartej, tak aby roztwór Ph-HCl mógł być pipetowany w górę i w dół, najlepiej bez naruszania sekcji. UWAGA: Uważaj, aby nie pipetować odcinków do końcówki pipety, ponieważ może to spowodować uszkodzenie tych sekcji.
    1. Używaj pipety o pojemności 1 ml z końcówką pipety przyciętą w taki sposób, aby można było łatwo odpipetować odcinki bez uszkodzeń. Delikatnie odpipetuj skrawki do końcówki i na szkiełko mikroskopowe. Przykryj sekcje szkiełkiem nakrywkowym. Obserwuj sekcje przy jasnym oświetleniu. UWAGA: Roztwór Ph-HCl wysycha w ciągu 5-10 minut, powodując pogorszenie jakości próbek. W związku z tym obrazowanie musi zostać zakończone w tym czasie.

6. Barwienie Mäule13,14

  1. Rozpuścić 0,2 g nadmanganianu potasu w 40 ml wody destylowanej, aby przygotować 0,5% roztwór nadmanganianu potasu. Przechowywać w ciemnej butelce w temperaturze pokojowej maksymalnie 7 dni.
    1. Przygotować 3,7% roztwór HCl, dodając 1 ml stężonego HCl (37 N) do 9 ml wody destylowanej (1:10). Przygotuj świeży 3,7% roztwór HCl w dniu eksperymentu. Upewnić się, że używany roztwór podstawowy 37 N HCl nie jest zbyt stary. Stężony roztwór wodorotlenku amonu (14,8 M) powinien być przechowywany w temperaturze 4 °C, aby zapobiec zmniejszeniu molowości nasyconego roztworu.
  2. Przenieść sekcje trzpienia do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2,0 ml. Dodać 1 ml 0,5% roztworu nadmanganianu potasu do probówki zawierającej fragmenty.
    1. Delikatnie odpipetować 0,5% roztwór nadmanganianu potasu w górę i w dół, najlepiej bez naruszania sekcji. Inkubować przez 2 minuty i powtórzyć pipetowanie. Pozostaw probówkę do mikrowirówki, aż wszystkie sekcje się uspokoją. UWAGA: Należy uważać, aby nie pipetować odcinków do końcówki pipety, ponieważ mogą one ulec uszkodzeniu. Może być trudno zobaczyć sekcje łodygi, ponieważ roztwór jest ciemny, więc trzymaj probówkę z sekcjami na stojaku na probówki i pozwól im osiąść przez 2 minuty.
    2. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml pobrać 700 μl 0,5% roztworu nadmanganianu potasu. Dodać 700 μl wody destylowanej, aby wypłukać roztwór nadmanganianu potasu. Powtórz 3-4 razy lub do momentu, gdy roztwór wodny pozostanie klarowny.
    3. Wylej wodę. Szybko dodaj 1 ml 3% HCl, aż do uzyskania ciemnobrązowego koloru z sekcji. Może to nastąpić w ciągu 3-5 minut lub może wymagać 2 prań po 5 minut każde. Odpipetować cały 3% roztwór HCl i natychmiast przejść do następnego kroku.
    4. Dodać 1 ml stężonego roztworu wodorotlenku amonu. Użyć pipety o pojemności 1 ml z końcówką przyciętą w taki sposób, aby można było łatwo odpipetować sekcje bez uszkodzeń. Delikatnie odpipetuj skrawki do końcówki i na szkiełko mikroskopowe. Przykryj sekcje szkiełkiem nakrywkowym. Obserwuj sekcje przy jasnym oświetleniu. UWAGA: Ponieważ wodorotlenek amonu jest wyjątkowo, wymaga dodatkowej ostrożności i uwagi, aby uniknąć powodowania korozji stopnia mikroskopu lub soczewki. UWAGA: Opary wodorotlenku amonu mogą zaparowywać szkiełko nakrywkowe, utrudniając obserwację próbki. Dlatego należy zachować szczególną ostrożność przed dodaniem szkiełka nakrywkowego. Roztwór wysycha w ciągu 5-10 minut, więc obrazowanie musi zostać zakończone w tym czasie.

7. Kongo Czerwone zabarwienie11,15

  1. Rozpuścić 0,5 g czerwieni kongijskiej w 100 ml wody destylowanej, aby przygotować 0,5% roztwór czerwieni kongijskiej.
  2. Przenieść sekcje trzpienia do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2,0 ml. Dodać 1 ml 0,5% roztworu czerwieni kongijskiej do probówki. Delikatnie odpipetować 0,5% roztwór czerwieni kongijskiej w górę i w dół, nie naruszając sekcji. UWAGA: Uważaj, aby nie pipetować odcinków do końcówki pipety, ponieważ może to spowodować uszkodzenie sekcji.
    1. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut i powtórzyć pipetowanie. Następnie wykonaj kolejne 3 minuty inkubacji w temperaturze pokojowej.
    2. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml pobrać 700 μl 0,5% roztworu czerwieni kongijskiej. Dodaj 700 μl wody destylowanej, aby wypłukać czerwony roztwór kongo. Powtórz pranie 3-4 razy, aż roztwór myjący będzie klarowny.
    3. Należy używać pipety o pojemności 1 ml z końcówką naciętą w taki sposób, aby można było łatwo odpipetować odcinki bez uszkodzeń. Delikatnie odpipetuj skrawki do końcówki i na szkiełko mikroskopowe, a następnie przykryj je szkiełkiem nakrywkowym. Obserwuj próbki na szkiełku mikroskopowym pod wpływem wzbudzenia światłem niebieskim przy użyciu filtra o przepustowym paśmie przepustowym 560/40. UWAGA: Nie przechowuj skrawków w wodzie przez długi czas przed analizą mikroskopową, ponieważ woda zmyje czerwień kongo w ciągu 10-30 minut.

8. Białe barwienie Calcofluor9

  1. Rozpuścić 0,02 g rozjaśniacza fluorescencyjnego 28 (calcofluor white M2R) w 10 ml wody destylowanej, aby przygotować 0,2% roztwór podstawowy. 0,2% roztwór może być przechowywany przez sześć miesięcy w ciemnej butelce w temperaturze 4 °C. Przygotować roztwór roboczy 0,02%, rozcieńczając 0,2% roztwór podstawowy 10x wodą destylowaną.
  2. Przenieść sekcje trzpienia do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2,0 ml. Dodać do probówki 1 ml 0,02% roztworu białka kalkofluorowego. Delikatnie odpipetować 0,02% biały roztwór kalkofluoru w górę iw dół. UWAGA: Uważaj, aby nie pipetować odcinków do końcówki pipety, ponieważ może to spowodować uszkodzenie sekcji.
    1. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut i powtórzyć pipetowanie. Inkubować sekcję przez kolejne 3 minuty w temperaturze pokojowej. UWAGA: Pozwól, aby sekcje osiadły na dnie probówki, aby ułatwić odpipetowanie roztworu bez uszkadzania sekcji.
    2. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml odciągnąć 700 μl 0,02% roztworu bieli kalkofluorowej i dodać 700 μl wody destylowanej; odczekać 5 minut, aby wypłukać roztwór białka kalkofluorowego. Powtórz pranie 3-4 razy. Należy użyć pipety o pojemności 1 ml z końcówką pipety przyciętą w taki sposób, aby można było łatwo odpipetować odcinki bez uszkodzenia.
    3. Delikatnie odpipetować skrawki do końcówki i na szkiełko mikroskopowe, a następnie przykryć je szkiełkiem nakrywkowym. Obserwuj sekcje w świetle UV.

9. Barwienie błękitem toluidynowymO 16,17

  1. Rozpuścić 0,02 g błękitu toluidynowego O w 100 ml wody destylowanej, aby przygotować 0,02% roztwór. UWAGA: Roztwór błękitu toluidynowego O można przechowywać przez dwa tygodnie w ciemnej butelce w temperaturze pokojowej.
  2. Przenieść sekcje trzpienia do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2,0 ml. Dodać 1 ml 0,02% roztworu błękitu toluidynowego O do probówki. Delikatnie odpipetować 0,02% roztwór błękitu toluidynowego O w górę i w dół. Następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut i powtórzyć pipetowanie raz. UWAGA: Uważaj, aby nie pipetować odcinków do końcówki pipety, ponieważ może to spowodować uszkodzenie sekcji. Pozostaw probówkę do mikrowirówki nieruchomo, aż sekcje się uspokoją. Może to być trudne do zauważenia, ponieważ roztwór jest ciemny, więc trzymaj probówkę zawierającą sekcje na stojaku na probówki i pozwól im osiąść przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
    1. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml pobrać 700 μl 0,02% roztworu błękitu toluidynowego O. Dodać 700 μl wody destylowanej, aby wypłukać roztwór błękitu toluidynowego O. Powtórz 3-4 razy lub do momentu, gdy roztwór myjący będzie klarowny. Należy użyć pipety o pojemności 1 ml z końcówką pipety przyciętą w taki sposób, aby można było łatwo odpipetować odcinki bez ich uszkodzenia.
    2. Delikatnie odpipetować skrawki do końcówki i na szkiełko mikroskopowe, a następnie przykryć je szkiełkiem nakrywkowym. Obserwuj sekcje przy jasnym oświetleniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zatopienie i krojenie łodyg:
Zastosowanie wykonanej własnoręcznie plastikowej formy do zatapiania łodyg w 7% agarozie okazało się szybkie i łatwe (Rysunek 1). Dwie części (A i B; Rysunek 1) systemu z fiolkami ułatwiają szybkie uwalnianie łodygi zatopionej w agarozie, ponieważ agaroza nie przykleja się do obojętnych części fiolek, co pozwala zachować system w czystości. Fiolki mogą być wielokrotnie wykorzystywane przez lata. Wygoda przechowywania zatopionej łodygi ułatwia również kole...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Sekcje macierzyste A. thaliana są szeroko stosowane do badania organizacji komórek w wtórnej ścianie komórkowej oraz do jakościowego badania różnic między roślinami typu dzikiego a transgenicznymi. Powszechnie stosowanymi technikami cięcia próbek są bezpośrednie cięcie ręczne; lub gdy próbki są osadzone w agarozie lub utrwalaczu, cięcie można wykonać za pomocą wibratomu lub mikrotomu. W przeciwieństwie do cięcia ręcznego, dwie ostatnie pozwalają zmniejszyć ryzyko uzyskania niedokładnych różnic między próbkami, k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów finansowych.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni Sabinowi Russellowi za pomoc w edycji. Prace te były częścią Wspólnego Instytutu Bioenergii DOE (http://www.jbei.org) wspieranego przez Departament Energii Stanów Zjednoczonych, Biuro Nauki, Biuro Badań Biologicznych i Środowiskowych, na mocy umowy DE-AC02-05CH11231 między Lawrence Berkeley National Laboratory a Departamentem Energii Stanów Zjednoczonych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgarozaEMDMERC2125Numer CAS: 9012-36-6
FloroglucinolSigmaP 35021,3,5-trihydroksybenzen [Numer CAS: 108-73-6]
Kwas solnyEMDHX0603-75Numer CAS: 7647-01-0
Wodorotlenek amonuEMDAX1303-6Numer CAS: 1336-21-6
Toulidine Blue OSigmaT3260Chlorek blutenu, chlorek tolonu [numer CAS 92-31-9] 
Nadmanganian potasuSigma223468Numer CAS 7722-64-7 
Etanol 190 proofKOPTECV1401Numer CAS: 64-17-5
Kongo RedSigma C62773,3'-[[1,1'-bifenylo]-4,4'-diylbis(azo)]bis(4-aminonaftaleno-1-sulfonian) [numer CAS 573-58-0]
Rozjaśniacz fluorescencyjny 28/ Calcofluor White StainSigmaF3543 Kwas 4,4'-bis[[4-[bis(2-hydroksyetylo)amino]-6-anilino-1,3,5-triazyno-2-ylo]amino]stilben-2,2'-disulfonowy [numer CAS 4404-43-7] 
VibratomeLeicaLeica Wibrujące ostrze mikrotom VT1000Shttp://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/
RazorAmerykańska firma zajmująca się maszynkami do goleniaPozycja # 60-0139-0000 Ostrze o podwójnej krawędzi ze stali nierdzewnej (Personna Super)
Probówki do mikrowirówek z nakrętką (2 ml)VWR16466-044
Probówki do mikrowirówek (0,6 ml)Axygen ScientificMCT-060-C
RękawicaBel-Art380000000SCIENCEWARE  Rękawica do ochrony gorącej dłoni
Klej tkankowyTed Pella Inc10033Przechowuj pod adresem 4 & deg; C lub 20 ° C na 3 miesiące lub dłużej przechowywania
Kuchenka mikrofalowaPanasonicNN-SD762SPELCO Pro CA 44 Błyskawiczny klej tkankowy 
Kamera z chipem CCD bez migawki mechanicznej HamamatsuC4742-95
Szybka kamera kolorowa     QImagingMicroPublisher 5.0
   Molecular DevicesMetaMorph wersja 7.7.0.0
Obrazowanie analizy Adobe Photoshop CS4
Micro Cover Glasses, kwadratowe, nr 1VWR48366-06722 x 22 mm (7/8 x 7/8")-Okulary nakrywkowe są odporne na korozję oraz jednolicie grube i płaskie. Grubość nr 1 wynosi od 0,13 do 0,17 mm.
Mikroszkiełka matowe, 1 mmVWR48312-00375 x 25 mm - 1 mm
Parafilm MOpakowanie AlcanBRNDPM998
TX2 Kostka filtracyjnaLeica11513851/11513885Filtr używany do analizy czerwieni Kongo o paśmie przepustowym 560/40.
Oprogramowanie kamery RTV

Bibliografia

  1. Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. Lignin biosynthesis. Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).
  2. Vanholme, R., Demedts, B., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W. Lignin biosynthesis and structure. Plant physiology. 153, 895-905 (2010).
  3. Humphreys, J. M., Chapple, C. Rewriting the lignin roadmap. Current opinion in plant biology. 5, 224-229 (2002).
  4. Adler, E. Lignin chemistry—past, present and future. Wood Sci. Technol. 11, 169-218 (1977).
  5. Brien, T. P., Feder, N., McCully, M. E. Polychromatic Staining of Plant Cell Walls by Toluidine Blue. 59, 368-373 (1964).
  6. Mori, B., Bellani, L. M. Differential staining for cellulosic and modified plant cell walls. Biotechnic & histochemistry: official publication of the Biological Stain Commission. 71, 71-72 (1996).
  7. Maeda, H., Ishida, N. Specificity of binding of hexopyranosyl polysaccharides with fluorescent brightener. Journal of biochemistry. 62, 276-278 (1967).
  8. Wood, P. J. Specificity in the interaction of direct dyes with polysaccharides. Carbohydrate Research. 85, 271-287 (1980).
  9. Hughes, J., McCully, M. E. The use of an optical brightener in the study of plant structure. Stain technology. 50, 319-329 (1975).
  10. Verbelen, J. P., Kerstens, S. Polarization confocal microscopy and congo red fluorescence: a simple and rapid method to determine the mean cellulose fibril orientation in plants. Journal of microscopy. 198, 101-107 (2000).
  11. Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. Real-time imaging of cellulose reorientation during cell wall expansion in Arabidopsis roots. Plant physiology. 152, 787-796 (2010).
  12. Liljegren, S. Phloroglucinol Stain for Lignin. Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).
  13. Nakano, J., Meshitsuka, G., lin, S., Dence, C. The Detection of Lignin Methods in Lignin Chemistry. , Springer-Verlag. Berlin. (1992).
  14. Sibout, R., et al. CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE-C and -D are the primary genes involved in lignin biosynthesis in the floral stem of Arabidopsis. The Plant cell. 17, 2059-2076 (2005).
  15. Teather, R. M., Wood, P. J. Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Applied and environmental microbiology. 43, 777-780 (1982).
  16. Yeung, E. A beginner's guide to the study of plant structure. Proceedings of the 19th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE. 19, 365-36 (1998).
  17. Turner, S. R., Somerville, C. R. Collapsed xylem phenotype of Arabidopsis identifies mutants deficient in cellulose deposition in the secondary cell wall). The Plant Cell Online. 9, 689-701 (1997).
  18. Iiyama, K., Pant, R. The mechanism of the Mäule colour reaction. Introduction of methylated syringyl nuclei into softwood lignin. Wood Sci. Technol. 22, 167-175 (1988).
  19. Yang, F., et al. Engineering secondary cell wall deposition in plants. Plant biotechnology journal. 11, 325-335 (2013).
  20. Zhong, R., Ripperger, A., Ye, Z. H. Ectopic deposition of lignin in the pith of stems of two Arabidopsis mutants. Plant physiology. 123, 59-70 (2000).
  21. Chapple, C. C., Vogt, T., Ellis, B. E., Somerville, C. R. An Arabidopsis mutant defective in the general phenylpropanoid pathway. The Plant cell. 4, 1413-1424 (1992).
  22. Fagard, M., et al. PROCUSTE1 Encodes a Cellulose Synthase Required for Normal Cell Elongation Specifically in Roots and Dark-Grown Hypocotyls of Arabidopsis. The Plant Cell Online. 12, 2409-2423 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przygotowanie przekroj w odygi ro linbarwienie czerwieni Kongobarwienie bia ym Calcofluorbarwienie b kitem toluidynowym Obarwienie fluorolembarwienie MALSbarwienie floroglucinolem
Barwienie histochemiczne drugorzędowych elementów ściany komórkowej Arabidopsis thaliana
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.