Artykuł metodologiczny

Obrazowanie oczyściło nienaruszone systemy biologiczne na poziomie komórkowym za pomocą 3DISCO

27.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51382

⸱

7 lipca 2014

 ,  , 
1Neuroscience, Genentech, Inc., 2Department of Discovery Oncology, Genentech, Inc., 3Department of Pathology, Genentech, Inc.

W tym artykule

Podsumowanie

Aby uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości fluorescencyjnie znakowanych komórek w dużych tkankach, najlepiej byłoby, gdyby próbki biologiczne były obrazowane bez dzielenia na sekcje. 3DISCO to prosta procedura oczyszczania tkanek oparta na sekwencyjnej inkubacji z rozpuszczalnikami organicznymi. Po oczyszczeniu narządy stają się przezroczyste, co pozwala na kompleksowe skanowanie laserowe próbki.

Streszczenie

Oczyszczanie tkanek i późniejsze obrazowanie przezroczystych organów to potężna metoda analizy fluorescencyjnie znakowanych komórek i molekuł w 3D, w nienaruszonych narządach. W przeciwieństwie do tradycyjnych metod histologicznych, w których tkanka będąca przedmiotem zainteresowania jest dzielona w celu obrazowania fluorescencyjnego, obrazowanie 3D oczyszczonej tkanki umożliwia badanie znakowanych komórek i cząsteczek w całej próbce. W tym celu optycznie nieprzezroczyste tkanki powinny stać się przezroczyste poprzez dopasowanie wskaźników oporności na leczenie w całej tkance. Następnie tkankę można natychmiast zobrazować za pomocą laserowych mikroskopów skaningowych, aby uzyskać pełny obraz 3D próbki o wysokiej rozdzielczości. Rosnąca lista protokołów oczyszczania tkanek, w tym 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2 i SeeDB, zapewnia naukowcom nowe sposoby obrazowania tkanki będącej przedmiotem zainteresowania jako całości. Wśród nich 3DISCO jest wysoce powtarzalną i prostą metodą, która może oczyszczać różne rodzaje tkanek i może być wykorzystywana z różnymi technikami mikroskopowymi. Niniejszy protokół opisuje tę prostą procedurę i przedstawia jej różne zastosowania. Omówiono w nim również ograniczenia i możliwe trudności oraz sposoby ich pokonywania.

Wprowadzenie

Badanie histologiczne tkanek biologicznych jest podstawowym podejściem do zrozumienia natury molekuł/komórek w ich naturalnym kontekście. Idealnie byłoby, gdyby obrazowanie całego narządu w wysokiej rozdzielczości było najbardziej pouczające i pożądane. Ponieważ światło ma ograniczoną głębokość penetracji, ze względu na rozpraszanie1, nieruchome narządy muszą zostać poddane sekcjom w celu wykonania obrazowania mikroskopowego o wysokiej rozdzielczości. W związku z tym większość badań histologicznych wykonuje się na kilku wycinkach tkanek reprezentujących tylko niewielką część narządu. W niektórych badaniach, np. mających na celu prześledzenie połączeń neuronalnych w mózgu lub rdzeniu kręgowym, wszystkie skrawki tkanek z narządów docelowych są zbierane i obrazowane w celu rekonstrukcji 3D. Wycinanie tkanek i późniejsze obrazowanie poszczególnych odcinków ma jednak różne ograniczenia. Obejmują one czasochłonność i prowadzą do niepełnej rekonstrukcji 3D tkanki z powodu zniekształceń mechanicznych i trudności w wyrównaniu powstałych obrazów.

Ostatnio, oczyszczanie i obrazowanie nienaruszonych przezroczystych organów zostało opracowane jako znaczące rozwiązanie tego problemu2,3. Po oczyszczeniu cały narząd staje się przezroczysty, co pozwala światłu obrazującemu przemieszczać się od końca do końca (ryc. 1) w celu uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości niepodzielonego narządu za pomocą laserowego mikroskopu skaningowego, takiego jak mikroskop wielofotonowy lub mikroskop z arkuszami świetlnymi (ryc. 2). Różne grupy badawcze opracowały nowe protokoły oczyszczania tkanek, aby móc obrazować tkankę będącą przedmiotem zainteresowania do różnych celów. Należą do nich rozpuszczalnik organiczny2-5, woda6,7 i8 protokołów oczyszczania opartych na elektroforezie. Wśród nich trójwymiarowe obrazowanie narządów oczyszczonych rozpuszczalnikiem lub 3DISCO jest łatwym do zastosowania protokołem na różnych próbkach biologicznych, w tym narządach ośrodkowego układu nerwowego (OUN), narządach odpornościowych i guzach litych. Ponadto można go łączyć z różnymi technikami mikroskopii, takimi jak mikroskopia fluorescencyjna arkusza świetlnego (LSFM), wielofotonowa i konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa. 3DISCO opiera się na oczyszczaniu za pomocą łatwo dostępnych i niedrogich odczynników, takich jak tetrahydrofuran (THF) i eter dibenzylowy (DBE)4. Cały protokół może zająć nawet 3-4 godziny. Tak więc 3DISCO jest solidną i szybką techniką w porównaniu z tradycyjnymi metodami histologicznymi, których wykonanie może zająć tygodnie lub miesiące9.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z przepisami IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) na myszach w wieku ~3-5 miesięcy. Autor deklaruje brak sprzecznych interesów finansowych.

1. Perfuzja zwierzęca i przygotowanie tkanek

Czas: 30-60 minut na mysz + post-fixation (kilka godzin do nocy).

  1. Zważyć zwierzę i znieczulić za pomocą ketaminy (80-200 mg/kg) i ksylazyny (7-20 mg/kg) lub 2,5% awertyny (0,5 ml/25 g m.c.).
  2. Poczekaj kilka minut, aż znieczulenie zacznie całkowicie działać.
  3. Uszczypnij palec u nogi i ogon zwierzęcia, aby upewnić się, że zwierzę jest w pełni znieczulone.
  4. Zwierzę należy najpierw przeprowadzić perfuzję w temperaturze pokojowej z 0,1 M buforem fosforanowym (PB) lub 0,1 M roztworem soli fizjologicznej w postaci buforu fosforanowego (PBS) przez 5-10 minut, aż krew zostanie całkowicie usunięta z tkanki.
  5. Zmienić perfuzję na roztwór utrwalający: 4% PFA w 0,1 M PB (lub 0,1 M PBS) i kontynuować perfuzję z 4% PFA przez 30-40 minut z prędkością 3 ml/min.
  6. Ostrożnie wypreparuj interesujący nas narząd (narządy) bez uszkodzenia, np. unikaj nakłuwania i ściskania tkanki, która jest preparowana.
  7. Usuń dodatkową tkankę otaczającą narządy (tkankę łączną, opony mózgowe lub oponę twardą) na szalce Petriego wypełnionej PBS.
  8. Po utrwaleniu narządów w 4% PFA przez kilka godzin lub przez noc w temperaturze 4 ºC. Unikaj długiego utrwalania po utrwaleniu, ponieważ PFA może wygasić sygnał lub zwiększyć autofluorekomensę w godzinach10, szczególnie dla kanału GFP (co jest mniejszym problemem w kanałach czerwonym i dalekim czerwonym).
  9. Umyj narządy 2-3 razy PBS w temperaturze RT tuż przed rozpoczęciem procedury oczyszczania.

2. Oczyszczanie tkanek

Czas: 2-3 godziny dla małych organów i 1-4 dni dla dużych organów.

Uwagi: Fluorescencyjne znakowanie tkanek za pomocą ekspresji transgenu, transfekcji wirusa, śledzenia barwnika lub znakowania przeciwciał powinno zostać zakończone przed usunięciem. Wszystkie etapy oczyszczania tkanek są wykonywane w RT. Roztwory czyszczące THF, DBE, BABB (1 część alkoholu benzylowego i 2 części benzoesanu benzylu) i dichlorometan są toksyczne i wdychane (eksperymenty należy przeprowadzać w odpowiednio wentylowanym dygestoriach) i należy unikać bezpośredniego kontaktu ze skórą (używać rękawic nitrylowych).

  1. Przygotuj 50% (obj./obj.), 70% i 80% rozcieńczenia THF w wodzie destylowanej w oddzielnych szklanych butelkach w następujący sposób: Aby uzyskać np. 50% THF, wymieszaj 25 ml THF i 25 ml wody destylowanej w szklanej butelce o objętości większej niż 50 ml.
  2. Mieszaj roztwory, delikatnie potrząsając butelką przez 1-2 minuty.
  3. Wyraźnie oznacz szklaną butelkę.
  4. Bezpiecznie zamknij butelki i przechowuj roztwory robocze w ciemnej szafce. Aby uzyskać najlepsze rezultaty, nie używaj tych samych roztworów roboczych dłużej niż 1-2 tygodnie. Dlatego należy zamawiać roztwory rozliczeniowe jako najmniejszą dostępną objętość, aby móc korzystać ze świeżych odczynników wyjściowych.
  5. Napełnij szklane fiolki (np. 2-3 ml) pierwszym roztworem oczyszczającym, 50% THF, i przenieś narządy z PBS do szklanych fiolek, aby rozpocząć oczyszczanie.
  6. Szczelnie zamknąć szklane fiolki ich pokrywkami i użyć rotatora (np. mieszadła kołowego) do mieszania.
  7. Użyj folii aluminiowej do przykrycia i trzymaj szklane fiolki w ciemności. Uruchomić rotator, aby mieszać próbki w szklanych fiolkach przez wskazany czas (Tabela 1) ze stałą prędkością (~30 obr./min).
  8. Usunąć roztwór czyszczący i dodać następny roztwór do protokołu po upływie czasu określonego w tabeli 1.
  9. Odpady z usuwania należy zbierać do szklanych pojemników na odpady, które są przechowywane w okapie.
    Powtórz poprzedni krok dla każdego roztworu rozliczeniowego w protokole aż do końca. Użyj nowej pipety Pasteura po dodaniu nowego roztworu czyszczącego (np. zmiana z THF na DBE).
  10. Na ostatnim etapie oczyszczania za pomocą BABB lub DBE, czas inkubacji może być wydłużony lub skrócony, aż próbki staną się całkowicie przezroczyste w świetle widzialnym (lub żółtawe/przezroczyste, jeśli jest to bardzo duża tkanka, taka jak mózg).
  11. Oczyszczone narządy należy przechowywać w końcowym roztworze oczyszczającym przez cały czas, w tym na etapach obrazowania.

3. Przygotowanie oczyszczonych organów do obrazowania

Czas trwania: 5-15 min.

Uwaga: Wyobraź sobie oczyszczone narządy, jak tylko zostanie osiągnięte całkowite oczyszczenie. W tym celu należy postępować zgodnie z kolejnymi krokami, aby przygotować próbki do mikroskopii arkuszowej (np. ultramikroskopii) lub obrazowania mikroskopią konfokalną/wielofotonową.

Uwaga: Oczyszczone organy z czasem tracą swoją siłę fluorescencji (szczególnie białka fluorescencyjne, np. GFP; znakowanie przeciwciałami jest bardziej odporne i może nawet dać lepsze wyniki przy dłuższych inkubacjach). Do obrazowania można stosować różne techniki mikroskopii fluorescencyjnej, o ile osiągnięte jest właściwe obchodzenie się z narządami w roztworze oczyszczającym.

  1. Do mikroskopii z użyciem cienkich arkuszy
    1. Umieścić lub zamontować próbkę w odpowiedni sposób.
    2. Zamocuj oczyszczony narząd, ręcznie przekręcając uchwytu próbki4.
    3. Zanurzyć próbkę w komorze obrazowania (najlepiej szklanej) mikroskopu z arkuszem świetlnym, który jest wypełniony BABB lub DBE, w zależności od tego, który z nich został użyty na ostatnim etapie oczyszczania.
  2. Do mikroskopii wielofotonowej/konfokalnej
    1. Zamontuj próbkę na szkiełku obrazowym (lub komorze obrazowania) z końcowym roztworem do obrazowania, aby móc obrazować za pomocą mikroskopii wielofotonowej lub konfokalnej, które zwykle wykorzystują obiektywy zanurzone w oleju lub wodzie.
    2. Użyj cementu dentystycznego, aby zrobić granicę wokół tkanki.
    3. Napełnij basen BABB lub DBE tuż przed tym, jak cement dentystyczny stanie się w pełni sztywny.
      Uwaga: Cement dentystyczny szybko krzepnie; Poćwicz kilka razy, aby zapoznać się z nim przed wypróbowaniem rzeczywistych próbek.
    4. Natychmiast umieść oczyszczoną próbkę na środku basenu i przykryj ją szkłem nakrywkowym.
    5. Dociśnij szkło nakrywkowe, aż zostanie całkowicie uszczelnione cementem dentystycznym i dotknie powierzchni oczyszczonego narządu, co pozwoli osiągnąć maksymalną głębokość obrazowania za pomocą mikroskopii konfokalnej/wielofotonowej.
      Uwagi: Gwarantuje to, że podczas obrazowania nie zostanie rozlany żaden roztwór czyszczący. Unikaj zanurzania soczewki obrazowej bezpośrednio w roztworze przezroczystym, co może uszkodzić soczewkę, chyba że jest ona odporna na BABB/DBE lub ma osłonę ochronną.

4. Obrazowanie oczyszczonych narządów

Czas trwania: 15-45 min.

  1. Pobrać skan z obejmujący całą oczyszczoną tkankę (jeśli pozwala na to używana soczewka) w najlepszej rozdzielczości, jaką może zapewnić mikroskop.
  2. Powiększ obszary zainteresowania, aby zebrać obrazy w wyższej rozdzielczości.

5. Badanie danych za pomocą oprogramowania Amira

  1. Załaduj serię obrazów do oprogramowania Amira z modułem ResolveRT.
  2. Wprowadź poprawne rozmiary wokseli w oknie "Parametr odczytu obrazu" i naciśnij ok.
  3. Wybierz podaplikację "Multi Planer View". Następnie użyj suwaka "Grubość", aby wybrać optymalny próg dla wartości szarości, dostosowując wartości 2D i 3D.
  4. Wizualizuj próbkę, przeglądając plasterki w różnych orientacjach 2D i używając modułu przycinania narożnika w widoku 3D.
    Uwaga: Szczegółowy przewodnik rozwiązywania problemów z protokołem można znaleźć w Ertürk i wsp. 4.

Wyniki

Neurony są komórkami silnie spolaryzowanymi o niezwykle wydłużonej morfologii. Ich funkcja zależy od połączeń, które tworzą między sobą oraz z innymi tkankami. Dlatego mapowanie organizacji strukturalnej neuronów jest niezwykle istotne dla zrozumienia ich funkcjonowania w stanie zdrowia i choroby. Jednakże śledzenie tak ogromnych połączeń neuronalnych w całym układzie nerwowym – co niedawno określono mianem konektomiki11 – wciąż pozostaje jednym z najtrudniejszych wyzwań w neuronauce. W tym celu zarówno UE12, jak i USA13 zainicjowały duże projekty mające na celu zmapowanie ludzkiego mózgu.

Choć metodę 3DISCO można stosować w odniesieniu do różnych organów, okazała się ona szczególnie użyteczna w śledzeniu długich połączeń neuronalnych w rdzeniu kręgowym i mózgu. Na przykład, wykorzystując skany ultramikroskopowe dużych, przejrzystych segmentów rdzenia kręgowego, można śledzić połączenia aksonalne na przestrzeni wielu centymetrów w rdzeniu kręgowym gryzoni (Rycina 2). W podobny sposób można obrazować cały przejrzysty mózg myszy (Rycina 3a) oraz hipokamp (Rycina 3b), aby śledzić połączenia neuronalne w mózgu.

W przypadku zastosowania mikroskopii konfokalnej lub wielofotonowej do przejaśnionych organów można znacząco poprawić rozdzielczość obrazowania, szczególnie w wymiarze z. Na przykład obrazowanie wielofotonowe przejaśnionych rdzeni kręgowych myszy z linii GFP-M (Rycina 4a) pozwala na uzyskanie spójnego obrazu w całej głębokości (~1,5-2 mm) rdzenia kręgowego. Mikroskopia konfokalna przejaśnionego rdzenia kręgowego zapewnia podobną poprawę rozdzielczości (Ryciny 4b i c). Obrazowanie wielofotonowe przejaśnionych mózgów dostarcza obrazy o bardzo wysokiej rozdzielczości, umożliwiając wizualizację drobnych szczegółów struktur neuronalnych, w tym kolców dendrytycznych (Rycina 5). Próbki do metody 3DISCO mogą być znakowane na różne sposoby, w tym poprzez ekspresję transgenu, transfekcję wirusową, śledzenie barwnikowe oraz znakowanie przeciwciałami. Możliwe jest na przykład oznakowanie całego układu naczyniowego mózgu (Ryciny 6a i b) oraz rdzenia kręgowego (Ryciny 6c i d) przy użyciu koniugowanych z lektyną znaczników fluorescencyjnych4, co może być wykorzystane do badania bariery krew-mózg (BBB) w stanie zdrowia i choroby.

Zarówno mikroglej, jak i astrocyty są w dużym stopniu zaangażowane w patologię neurodegeneracji, w tym w chorobę Alzheimera oraz urazy traumatyczne14,15. Dzięki zastosowaniu metody 3DISCO można badać ich gęstość i rozmieszczenie w rdzeniu kręgowym (Rysunek 7) lub mózgu.

Możliwe jest również obrazowanie tkanek pozaneuronalnych. Na przykład komórki Clary w całych płucach gryzoni mogą zostać oznakowane immunochemicznie za pomocą przeciwciał i zobrazowane bez konieczności sekcjonowania na poziomie pojedynczej komórki (Rysunek 8). Podobnie możliwe jest przejrzyściecie i obrazowanie komórek, np. komórek alfa w niesekcjonowanej tkance trzustki (Rysunek 9).

Mikroskopia procesu przejrzyszczania tkanek; efekt przejrzyszczania optycznego; porównawcza wizualizacja 3D.
Rysunek 1. Przejrzyszczanie tkanek metodą 3DISCO czyni nieprzecięte tkanki przezroczystymi, co umożliwia obrazowanie głębokich struktur tkankowych. Tkanki rdzenia kręgowego nieprzejrzyszczone (a) i przejrzyszczone (b) w świetle widzialnym. Po przejrzyszczeniu możliwe staje się głębokie obrazowanie tkankowe za pomocą mikroskopii laserowej. (c) Nieprzejrzyszczone i przejrzyszczone tkanki rdzenia kręgowego obrazowane mikroskopią dwufotonową. Paski skali w a, b = 0,5 mm oraz w c = 100 µm.

Struktura rdzenia kręgowego mózgu; obrazy mikroskopowe; wizualizacja 3D; analiza orientacji włókien nerwowych.
Rycina 2. Obrazowanie 3DISCO rdzenia kręgowego w celu śledzenia wypustek aksonalnych. Wypreparowany rdzeń kręgowy z transgenicznej linii myszy Thy-1 GFP (GFP-M) został podzielony na mniejsze fragmenty (~4 mm). Po zastosowaniu protokołu klarowania dla małych tkanek (Tabela 1) przezroczyste rdzenie kręgowe zobrazowano za pomocą ultramikroskopii. Rekonstrukcje 3D fragmentu rdzenia kręgowego o długości ~4 mm w przekroju poziomym (a), czołowym (b) i strzałkowym (c). (d) Reprezentatywne śledzone aksony (czerwone) przedstawiono w skali szarości w widoku przezroczystym. (e) Widok przy dużym powiększeniu zaznaczonego obszaru na zdjęciu (d). Paski skali na a, b, c, d = 0.5 mm oraz na e = 20 µm.

Obrazowanie mózgu 3D, analiza mikroskopowa; wizualizacja głębokości w skali szarości i szczegółowy przekrój anatomiczny.
Rycina 3. Obrazowanie 3DISCO oczyszczonego mózgu i hipokampa. Przykłady oczyszczonych mózgów i hipokampów myszy GFP-M obrazowano za pomocą ultramikroskopu. Wizualizacje 3D całego mózgu (a) i hipokampa (b) prezentujące sieci neuronalne w obrazowanych transparentnych tkankach. Paski skali w a = 2 mm oraz w b = 20 µm.

Obrazowanie dwufotonowe a konfokalne; wyniki mikroskopii; wizualizacja struktury tkanki; dołączone paski skali.
Rycina 4. Przezrocznienie tkanki poprawia rozdzielczość uzyskiwaną w mikroskopii wielofotonowej i konfokalnej. Przezroczyste segmenty rdzenia kręgowego myszy GFP-M obrazowane za pomocą mikroskopii wielofotonowej (a) lub konfokalnej (b, c). Zauważmy, że przezrocznienie znacząco poprawia rozdzielczość i głębokość obrazowania, ujawniając drobną strukturę aksonów i dendrytów. Paski skali w a = 100 µm oraz w b, c = 20 µm.

Analiza struktury sieci neuronowej, obrazy mikroskopowe; morfologia neuronów, szczegóły o wysokiej rozdzielczości.
Rysunek 5. Obrazowanie kolców dendrytycznych metodą 3DISCO. Przezroczysta tkanka mózgu myszy GFP-M obrazowana za pomocą wielofotonowej mikroskopii. Wizualizacje 3D zeskanowanego obszaru kory przedstawione w perspektywie pionowej (a) i poziomej (b). (c) Projekcja ~50 µm z poziomów wskazanych w (a, b). (d) Powiększenie wskazanego obszaru w (c) prezentujące drobne szczegóły struktur neuronalnych, w tym kolce dendrytyczne (groty strzałek). Paski skali: w a = 50 µm, w b, c = 25 µm, w d = 5 µm.

Rekonstrukcja 3D unaczynienia mózgu i rdzenia kręgowego; obrazy projekcyjne pokazują szczegółowe sieci naczyniowe.
Rycina 6. 3DISCO unaczynienia. W celu oznakowania naczyń krwionośnych w całych organach, podczas perfuzji (przed klarowaniem) zastosowano barwnik lektyna-FITC, zgodnie z opisem16. Warto zaznaczyć, że stwierdzono, iż wstrzyknięcie znacznika do żyły ogonowej zapewnia lepszy sygnał niż perfuzja przez serce. Po zebraniu utrwalonych mózgów i rdzeni kręgowych zostały one sklarowane i obrazowane za pomocą ultramikroskopii. Wizualizacja 3D całego unaczynienia mózgu myszy w mapie ciepła (a) i w skali szarości (a). (b) Wizualizacja 3D unaczynienia segmentu rdzenia kręgowego myszy w mapie ciepła (c) i w skali szarości (d). Mapy ciepła wygenerowano na podstawie intensywności barwienia lektyną; kolor niebieski: niska intensywność (tło), a czerwony: wysoka intensywność (unaczynienie). Paski skali: w a = 2 mm, b = 1 mm, oraz w c, d = 250 µm.

Rekonstrukcja 3D mikrogleju i astrocytów u myszy CX3CR1-GFP; widok transparentny i analiza projekcyjna.
Rycina 7. 3DISCO komórek glejowych w oczyszczonej tkance OUN. Rdzenie kręgowe myszy transgenicznych wykazujących ekspresję GFP w mikrogleju TgH(CX3CR1-EGFP) lub astrocytach TgN(hGFAP-ECFP) zostały oczyszczone i obrazowane za pomocą mikroskopii wielofotonowej. Renderowanie 3D mikrogleju przedstawiono jako wizualizację powierzchniową objętości (a) oraz widok transparentny (b). (c) Przedstawiono projekcję optyczną (~50 µm), aby ukazać szczegóły mikrogleju w rdzeniu kręgowym. Renderowanie 3D astrocytów przedstawiono jako wizualizację powierzchniową objętości (a) oraz widok transparentny (b). (f) Przedstawiono projekcję optyczną (~50 µm), aby ukazać szczegóły astrocytów w rdzeniu kręgowym. Paski skali na a, b, d, e = 100 µm oraz na c, f = 50 µm.

Labelowanie całego płuca przeciwciałami; rekonstrukcja 3D i projekcja; wizualizacja komórek Clara; mikroskopia.
Rysunek 8. 3DISCO całego płata płuca z barwieniem przeciwciałami komórek Clara. W celu przeprowadzenia barwienia całego płata płuca przeciwciałami, samice myszy BALB/C w wieku 10 tygodni poddano perfuzji przez prawą komorę za pomocą PBS, aby usunąć krew z płuc. Następnie płuca napompowano 4% PFA i utrwalano przez noc w temperaturze pokojowej (RT) w utrwalaczu o objętości co najmniej trzykrotnie większej niż objętość tkanki. Następnego dnia płuca krótko przepłukano w PBS, a prawy płat umieszczono w 5 ml 1% Triton X-100 w PBS w celu permeabilizacji na 48 h lub do momentu zatonięcia tkanki. Wszystkie barwienia przeprowadzono w 0,2% Triton X-100 w PBS zawierającym 5% FBS i 2% BSA, a płukania w 0,2% Triton X-100 w PBS. Barwienie przeciwciałem anty-CC10 trwało 72 h w temperaturze 4 °C, po czym nastąpiły intensywne płukania przez około 6 h. Fluorescencyjne znakowanie przeciwciała pierwszorzędowego osiągnięto za pomocą wtórnego przeciwciała anty-goat-Alexa Fluor-594 przez noc w temperaturze 4 °C, a następnie intensywnie płukano przez okres od 6 h do całej nocy. Następnego dnia zabarwione płaty poddano klarowaniu w kolejno 50%, 70% i 80% THF po 30 min każde, po czym wykonano trzy 30-minutowe płukania w 100% THF, następnie 20 min w DCM i 30 min w DBE. Paski skali na a i b = 1 mm oraz na c = 100 µm.

Rekonstrukcja 3D trzustki z fluorescencją, wykazująca ekspresję tdTomato; wyniki mikroskopii.
Rycina 9. 3DISCO trzustki. Po perfuzji myszy zgodnie z opisanym wyżej protokołem, trzustka została wycięta i przejrzystana przy użyciu krótkiego protokołu. Fluorescencja wynika z rekombinacji ROSA26 LSL tdTomato indukowanej podaniem tamoksyfenu myszom posiadającym 200 kb BAC transgen obejmujący endogenny locus glukagonu mysiego z CreERT2 wstawionym w ATG glukagonu. Groty strzałek wskazują niektóre znakowane fluorescencyjnie komórki alfa w wysepce. Paski skali w a, b i c = 1 mm oraz w d = 500 µm.

Tabela protokołu klarowania dla typów tkanek; kroki obejmują roztwory takie jak THF, DCM; czasy trwania.
Tabela 1. Protokoły klarowania dla różnych tkanek. Przykłady protokołów klarowania różnych tkanek. Należy pamiętać, że czas klarowania dla każdego kroku może zostać skrócony lub wydłużony w zależności od potrzeb, aby poprawić efektywność klarowania. Przybliżona masa małych tkanek wynosi ~20-100 mg, a mózgu ~300-500 mg. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej tabeli.

Dyskusja

Metody oczyszczania tkanek mają na celu zmniejszenie rozpraszania światła obrazowego poprzez dopasowanie współczynników załamania światła różnych warstw tkanek w oczyszczonych narządach. W rezultacie światło obrazowania może wnikać głęboko w tkanki i stymulować znakowane komórki/cząsteczki. Ta stara koncepcja oczyszczania tkanek17 zyskała coraz większą uwagę po pierwszym wyrafinowanym zastosowaniu tej techniki na nienaruszonych mózgach myszy przez Dodta i współpracowników2. Od tego czasu istnieje szybko rosnąca lista nowych metod rozliczania, w tym 3DISCO, Sca/e, ClearT2, CLARITY i SeeDB3,4,7,18-20. Zasadniczo wszystkie mają na celu uczynienie narządów przezroczystymi dla obrazowania tkanek głębokich poprzez zachowanie znacznika fluorescencyjnego. Wśród nich 3DISCO wyróżnia się jako jedna z najprostszych i najbardziej powtarzalnych metod. Jest stosunkowo szybki w porównaniu z innymi metodami oczyszczania wymienionymi powyżej (odpowiednio 1-5 dni w porównaniu z 2-3 tygodniami dla dorosłych mózgów)21. Został już z powodzeniem zastosowany w różnych narządach, takich jak mózg, rdzeń kręgowy, węzły chłonne, śledziona, płuca, guzy lite, trzustka i gruczoły sutkowe3,4,9. Ponadto w kilku publikacjach niezależnych grup badawczych wykorzystano już tę metodę w celu uzyskania wyników obrazowania22,23. Niemniej jednak różne procedury oczyszczania tkanek mogą być korzystne w przypadku różnych schorzeń. Na przykład, podczas gdy Sca/e i SeeDB najlepiej sprawdzają się w tkankach embrionalnych6,7, są to metody oczyszczania oparte na wodzie, które mogą być łatwiejsze do opanowania podczas obrazowania. W przeciwieństwie do tego, CLARITY jest skomplikowaną i kosztowną metodą rozliczania. Ale może to być korzystne w kontekście znakowania przeciwciał, zwłaszcza w dużych tkankach, takich jak mózg8.

Najważniejszym krokiem do uzyskania najlepszych wyników obrazowania z 3DISCO jest znakowanie tkanek, które odbywa się przed oczyszczeniem tkanki. Ważne jest, aby zacząć od najsilniejszego możliwego sygnału fluorescencyjnego. Można to osiągnąć na różne sposoby, w tym poprzez transgeniczną ekspresję białek fluorescencyjnych, śledzenie za pomocą barwników syntetycznych, transfekcję wirusa lub znakowanie przeciwciał. Należy pamiętać, że każda procedura oczyszczania zmniejszy sygnał fluorescencyjny tkanek. W związku z tym, jeśli sygnał fluorescencyjny nie jest wystarczająco silny na początku - tj. nie jest łatwo wykrywalny przed oczyszczeniem - obrazowanie oczyszczonych tkanek przyniesie słabe wyniki.

Istnieją pewne ograniczenia metod czyszczenia, które czekają na poprawę. Krytycznym ograniczeniem jest to, że ponieważ odczynniki czyszczące zmieniają strukturę oczyszczonych narządów, nie można ich stosować na żywych tkankach. Dlatego eksperymenty, takie jak z fotoaktywowalnym mEos224 , należy przeprowadzić przed zamocowaniem i oczyszczeniem. Po oczyszczeniu możliwe staje się obrazowanie w superrozdzielczości sygnału fluorescencyjnego z jasnych i fotostabilnych białek. Ponadto, ponieważ protokół oczyszczania zmniejsza intensywność białek fluorescencyjnych, oczyszczone narządy nie mogą być przechowywane przez dłuższy czas. Ważne jest, aby pamiętać, że niektóre narządy są trudniejsze do oczyszczenia. Zwłaszcza, jeśli wypreparowane narządy zatrzymują duże ilości komórek krwi (np. śledziona, wątroba), są one stosunkowo trudne do usunięcia i zobrazowania. Stosunkowo trudniej jest również osiągnąć całkowite oczyszczenie dużych tkanek, takich jak mózg dorosłego gryzonia. Takie tkanki mogą wymagać dłuższego czasu inkubacji, co z drugiej strony może zmniejszyć sygnał fluorescencyjny. Ponadto należy zająć się opracowaniem metod mikroskopowych, które mogą obrazować jednocześnie duże przezroczyste narządy w wysokiej rozdzielczości. Kolejnym ważnym ograniczeniem tej techniki jest znakowanie tkanek. Chociaż silny sygnał fluorescencyjny poprzez ekspresję genetyczną lub wirusową jest idealny, nie każda komórka lub cząsteczka może być znakowana genetycznie lub wirusowo. Z drugiej strony, znakowanie przeciwciałami grubych tkanek nie jest prostą procedurą, a nawet w większości przypadków nie jest możliwe. Może wymagać specjalnych protokołów przepuszczalności i długiego czasu inkubacji (od kilku dni do kilku tygodni)3. Ważne jest również, aby pamiętać, że tkanki kurczą się ~20% w każdym wymiarze (mierzonym dla tkanki rdzenia kręgowego) po oczyszczeniu, głównie z powodu odwodnienia i odlipidowania. Skurcz ten występuje proporcjonalnie i powinien być korygowany w krokach kwantyfikacji. Jak zaobserwowano w przedstawionych wynikach, struktury znakowane fluorescencyjnie pozostają nienaruszone, co wskazuje na integralność białek w oczyszczonych tkankach. Ze względu na hydrofobowy charakter końcowej oczyszczonej tkanki, nie można jej dalej barwić przeciwciałami ani zanurzać w roztworach zawierających wodę, np. Focusclear – który jest stosowany w CLARITY – lub 80% glicerolu. Wreszcie, wyzwaniem jest analiza przytłaczających rozmiarów danych obrazowych. Na przykład, gdy cały mózg myszy jest skanowany w rozdzielczości komórkowej, bardzo trudno byłoby prześledzić i określić ilościowo pożądane struktury (np. sieci neuronalne lub glejowe) i porównać różne próbki w zautomatyzowany sposób. Podsumowując, podczas gdy naukowcy dążą do znalezienia nowych metod oczyszczania, różne powyższe wyzwania (trudności w usuwaniu różnych tkanek, obrazowanie większych obszarów w wysokiej rozdzielczości i skomplikowana analiza danych) powinny być równolegle poprawiane.

Podsumowując, niedawno opracowane techniki oczyszczania tkanek, w tym 3DISCO, elegancko pokazują, że obrazowanie 3D nienaruszonych narządów w wysokiej rozdzielczości jest teraz możliwe. Korzystając z tych metod, naukowcy mogą uzyskać informacje anatomiczne o komórkach i cząsteczkach w nienaruszonym narządzie. Te pionierskie badania obrazowania 3D na przezroczystych narządach inspirują rosnącą liczbę badaczy do rozszyfrowania złożonych anatomicznych i molekularnych organizacji tkanek/narządów w zdrowiu i chorobie.

Oświadczenia

Nie ma nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy C. Hojerowi za krytyczną lekturę manuskryptu, B. Bingolowi (Genentech) za udział w narracji scenariusza, N. Bien-Ly za podzielenie się doświadczeniami w zakresie ulepszonego obrazowania naczyń krwionośnych za pomocą wstrzyknięcia do żyły ogonowej barwnika lektyny oraz M. Solloway (Genentech) za myszy wykorzystywane w obrazowaniu trzustki. Linia GFP-M została stworzona przez J. Sanesa (Washington University w St. Louis), a myszy CX3CR1-GFP przez R. Littmana (NYU). Prace są wspierane przez Genentech, Inc.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Thy-1 GFP (GFP-M)Można zdobyć od Jacksona.
CX3CR1 GFPMożna uzyskać z laboratorium Littman na Uniwersytecie Nowojorskim.
TgN(hGFAP-ECFP)Można uzyskać od Jacksona.
ParaformaldehydSigmaP6148
Na2HPO4Mallinckrodt7917-16
NaH2PO4Mallinckrodt7892-04
2-2-2 TribromoetanolSigmaT48402
2-metylo-2-butanolSigma152463używany w celu przygotowania roztworu Avertin.
SalineBraun
TetrahydrofuranSigma186562-12X100ML
DichlorometanSigma270997-12X100ML
Eter dibenzylowySigmaSigma, 108014-1KG
Alkohol benzylowySigma305197-100ML
Benzoesan benzyluSigmaB6630-250ML
Lectin FITCSigmaL0401-1MG
anty-CC10Santa CruzSC-97720,3888888889
HeparynaAPPfarmaceutyki 504001Stosowany w perfuzji.
Fiolki szklaneVWR548-0554
KleszczeFST11251-10
Mini rotatorVWR100498-878
Folia aluminiowaFisherbrand01-213-104
Butelki do przechowywania mediów o pojemności 100 mlButelki Kimax MediaEW-34523-00
Pompa perfuzyjna Minipuls evolution z głowicą pompy średniego przepływu MF4 *Gilson, IncF110701 i F117606
Szkiełko mikroskopoweVWR48311-703
FastWellGrace Bio-LabsFW20
Szkiełko nakrywkoweCorning2940-245
Szklana szalka PetriegoCorning Pyrex3160-101
Cement dentystycznyLang Dental1223PNK
Test nadtlenkowy Quantofix PaskiSigma37206
Amira z modułem mikroskopii rozdzielczej RTanalizy obrazuVisage Imaging
OprogramowanieImarisBitplane imaging
ImageJNIHfreeware
Mysz Mysz Mysz Oprogramowanie do do analizy obrazu

Bibliografia

  1. Tuchin, V. Tissue optics: light scattering methods and instruments for medical diagnosis. , SPIE Press. (2007).
  2. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
  3. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nat Med. 18, 166-171 (2012).
  4. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
  5. Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PLoS One. 7, (2012).
  6. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
  7. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
  8. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  9. Erturk, A., Bradke, F. High-resolution imaging of entire organs by 3-dimensional imaging of solvent cleared organs (3DISCO). Exp Neurol. 242, 57-64 (2013).
  10. Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation. Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 71, 379-385 (2007).
  11. Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Ome sweet ome: what can the genome tell us about the connectome. Curr Opin Neurobiol. 18, 346-353 (2008).
  12. Roh, M. I., Chung, S. H., Stulting, R. D., Kim, W. C., Kim, E. K. Preserved peripheral corneal clarity after surgical trauma in patients with Avellino corneal dystrophy. Cornea. 25, 497-498 (2006).
  13. Liu, J. K., Chung, C. H., Chang, C. Y., Bond Shieh, D. B. Bond strength and debonding characteristics of a new ceramic bracket. American journal of orthodontics and dentofacial orthopedics : official publication of the American Association of Orthodontists, its constituent societies, and the American Board of Orthodontics. 128, 761-765 (2005).
  14. Perry, V. H., Nicoll, J. A., Holmes, C. Microglia in neurodegenerative disease. Nature reviews. Neurology. 6, 193-201 (2010).
  15. Maragakis, N. J., Rothstein, J. D. Mechanisms of Disease: astrocytes in neurodegenerative disease. Nature clinical practice. Neurology. 2, 679-689 (2006).
  16. Jahrling, N., Becker, K., Dodt, H. U. 3D-reconstruction of blood vessels by ultramicroscopy. Organogenesis. 5, 145-148 (2009).
  17. Spalteholz, W. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten. , S. Hirzel. (1903).
  18. Smith, C., et al. The neuroinflammatory response in humans after traumatic brain injury. Neuropathology and applied neurobiology. 39, 654-666 (2012).
  19. Zotova, E., et al. Microglial alterations in human Alzheimer's disease following Abeta42 immunization. Neuropathology and applied neurobiology. 37, 513-524 (2011).
  20. Frewin, B., Chung, M., Donnelly, N. Bilateral cochlear implantation in Friedreich's ataxia: A case study. Cochlear implants international. 14, 287-290 (2013).
  21. Kim, S. Y., Chung, K., Deisseroth, K. Light microscopy mapping of connections in the intact brain. Trends in cognitive sciences. 17, 596-599 (2013).
  22. Luo, X., et al. Three-dimensional evaluation of retinal ganglion cell axon regeneration and pathfinding in whole mouse tissue after injury. Exp Neurol. 247, 653-662 (2013).
  23. Soderblom, C., et al. Perivascular fibroblasts form the fibrotic scar after contusive spinal cord injury. J Neurosci. 33, 13882-13887 (2013).
  24. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat Methods. 6, 131-133 (2009).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przezroczysto tkanekmetoda 3DISCOlaserowa mikroskopia skaningowaznakowanie fluorescencyjneobrazowanie rdzenia kr gowegoobrazowanie tkanki m zgowejprzezroczysto optycznainkubacja w rozpuszczalnikumikroskopia wielofotonowamikroskopia konfokalna

Powiązane artykuły