Interferometria biowarstwowa do pomiaru kinetyki oddziaływań białko-białko i efektów ligandów allosterycznych

Podsumowanie

Protokoły tutaj opisują kinetyczne testy interakcji białko-białko za pomocą interferometrii warstwy biologicznej. Syntaza ATP typu F, która bierze udział w metabolizmie energii komórkowej, może być hamowana przez swoją ε podjednostka u bakterii. Dostosowaliśmy interferometrię biowarstw do badania oddziaływań kompleksu katalitycznego z hamującą domeną C-końcową ε.

Streszczenie

Opisujemy użycie interferometrii warstwy biologicznej do badania hamujących oddziaływań podjednostki ε z kompleksem katalitycznym syntazy ATP Escherichia coli. Bakteryjna syntaza ATP typu F jest celem nowego, zatwierdzonego przez FDA antybiotyku do zwalczania gruźlicy lekoopornej. Zrozumienie specyficznego dla bakterii automatycznego hamowania syntazy ATP przez domenę C-końcową podjednostki ε może dostarczyć nowych sposobów celowania w enzym w celu odkrycia leków przeciwbakteryjnych. Domena C-końcowa ε ulega dramatycznej zmianie konformacyjnej, gdy enzym przechodzi między stanem aktywnym i nieaktywnym, a ligandy w miejscu katalitycznym mogą wpływać na to, która z konformacji ε jest dominująca. Test mierzy kinetykę wiązania/dysocjacji ε z kompleksem katalitycznym i pośrednio mierzy przesunięcie związanego z enzymem ε do i od pozornie niedysocjującej konformacji hamującej. Sygnał interferometrii warstwy biologicznej nie jest nadmiernie wrażliwy na skład roztworu, dzięki czemu może być również wykorzystywany do monitorowania allosterycznego wpływu ligandów w miejscu katalitycznym na zmiany konformacyjne ε.

Wprowadzenie

Interakcje białko-białko są ważne dla wielu procesów biologicznych, a metody optyczne bez znaczników, takie jak powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR), były używane in vitro do badania kinetyki wiązania i dysocjacji¹. Większość metod bezznacznikowych unieruchamia jedną biomolekułę na powierzchni czujnika i wykorzystuje sygnał optyczny do wykrycia partnera wiążącego z roztworu, gdy wiąże się on z unieruchomioną biomolekułą¹. Chociaż SPR jest metodą bardzo czułą, jest podatna na zakłócenia spowodowane zmianami współczynnika załamania światła roztworu przepływającego przez czujnik². Chociaż interferometria biowarstwowa (BLI) nie jest tak czuła jak SPR, zmiany w składzie próbki mają mniejszy wpływ na zmiany w składzie próbki^1,3. BLI wykorzystuje biosensory światłowodowe, które mają opatentowaną biokompatybilną powłokę na końcówce. Zastosowany tutaj system (Octet-RED96) zawiera osiem spektrofotometrów. Białe światło jest doprowadzane do rzędu sond, które poruszają się na ramieniu robota. Czujniki światłowodowe są pobierane przez sondy i przenoszone na 96-dołkową płytkę zawierającą próbki. Jedna z docelowych cząsteczek jest unieruchomiona na powierzchni biosensora. Następnie czujniki są przenoszone do studzienek zawierających środek wiążący w roztworze. BLI monitoruje asocjację partnera wiążącego z unieruchomioną cząsteczką, a następnie monitoruje dysocjację po przeniesieniu czujników do roztworu bez partnera wiążącego. Wiązanie cząsteczek z powierzchnią biosensora prowadzi do zmian w interferencji optycznej między falami świetlnymi, które odbijają się z powrotem do spektrofotometrów z powierzchni wewnętrznej oraz z zewnętrznego interfejsu między czujnikiem a roztworem. Te zmiany w interferencji można określić ilościowo i wykorzystać do określenia kinetycznych szybkości wiązania i dysocjacji, jak podsumowano w animacji na rysunku 1.

Zastosowaliśmy BLI do pomiaru interakcji między kompleksem katalitycznym bakteryjnej syntazy ATP a jej podjednostką ε, która może automatycznie hamować enzym. Syntaza ATP jest osadzonym w błonie obrotowym nanosilnikiem, który katalizuje syntezę i hydrolizę ATP⁴. Kompleks katalityczny (F₁) można wyizolować w postaci rozpuszczalnej, która działa jako ATPaza. Podjednostka ε ma dwie domeny: domena N-końcowa (NTD) jest niezbędna do prawidłowego składania i funkcjonalnego sprzężenia enzymu, ale nie oddziałuje bezpośrednio z podjednostkami katalitycznymi; domena C-końcowa (CTD) może hamować enzym poprzez interakcję z wieloma podjednostkami katalitycznymi^5,6. Ta regulacja za pośrednictwem ε jest specyficzna dla bakteryjnych syntaz ATP i nie jest obserwowana w homologu mitochondrialnym. Syntaza ATP stała się celem dla leków przeciwbakteryjnych, o czym świadczy niedawne zatwierdzenie przez FDA bedakiliny w leczeniu gruźlicy^{lekoopornej 7}. W związku z tym skupienie się na hamującej roli ε w odkrywaniu leków może przynieść leki przeciwbakteryjne, które nie hamują mitochondrialnej syntazy ATP. Z izolowanym kompleksem katalitycznym (F₁) staje się ε podjednostką dysocjującą. Jednak gdy ε związany z F₁, εCTD może ulec dramatycznej zmianie konformacyjnej, częściowo wstawiając się do centralnej jamy enzymu i tworząc stan hamujący, który prawdopodobnie nie zdysocjuje bezpośrednio^6,8. Używamy BLI do pomiaru kinetyki wiązania i dysocjacji F₁/ε oraz pośrednio do badania allosterycznego wpływu ligandów w miejscu katalitycznym na konformację ε.

W naszym systemie wybrano ε do unieruchomienia na powierzchni czujnika, ponieważ sygnał BLI (taki jak SPR) jest wrażliwy na masę cząsteczek wiążących się na powierzchni. Podjednostka ε jest niewielka (~15 kDa) w stosunku do głównego kompleksu F₁ (~347 kDa). W związku z tym większy sygnał BLI będzie wynikał z wiązania F₁ z unieruchomionymi ε. W celu monitorowania dysocjacji F₁, która może być bardzo powolna, ε musi być silnie unieruchomiony. Dlatego zdecydowaliśmy się na biotynylację i unieruchomienie go na biosensorach pokrytych streptawidyną. Białka mogą być biotynylowane przez (i) losową modyfikację lizyn^{powierzchniowych 9}, (ii) reakcję unikalnej natywnej lub zmodyfikowanej cysteiny z odczynnikiem biotynowo-maleimidowym¹⁰ lub (iii) genetyczne dodanie specyficznego peptydu akceptora biotyny, który jest enzymatycznie biotynylowany podczas ekspresji in vivo znakowanego białka¹¹. W naszym systemie ε jest biotynylowany metodą (iii)⁸. Po unieruchomieniu ε znakowanego biotyną na czujnikach streptawidyny, BLI może zmierzyć wiązanie i dysocjację F₁, która została pozbawiona podjednostki ε (F₁ (-ε)). W przypadku opisanych tutaj eksperymentów przeprowadzono wstępne testy w celu określenia rozsądnych ilości biotynylowanego białka, które można unieruchomić na czujnikach. Może się to różnić w zależności od masy cząsteczkowej białka i jego partnera wiążącego, ale celem jest określenie minimalnej ilości unieruchomionego białka, które zapewnia (i) akceptowalny sygnał do szumu dla kinetyki wiązania przy niskim stężeniu partnera wiążącego (poniżej_KD) i (ii) minimalne zniekształcenie kinetyki wiązania przy stężeniu bliskimi nasyceniu partnera wiążącego. Również stechiometria biotynylacji może się różnić (ale należy unikać >1 mol biotyny / mol białka), więc może być konieczne przeprowadzenie wstępnego testu dla każdej nowej partii biotynylowanego białka, aby potwierdzić, że podczas immobilizacji na czujnikach pokrytych streptawidyną można uzyskać spójny sygnał BLI.

Protokół

1. Programowanie przyrządu do testu BLI

Włącz instrument co najmniej godzinę wcześniej, aby lampa mogła się rozgrzać; jest to konieczne, aby zminimalizować szumy i dryf sygnału optycznego podczas eksperymentu. Ustaw żądaną temperaturę za pomocą zakładki przyrządu, aby wstępnie ogrzać uchwyt płytki próbki. Następnie skonfiguruj projekt eksperymentalny w oprogramowaniu do akwizycji danych. Wybierz "Nowy eksperyment kinetyczny" w zakładce Kreator eksperymentów. Spowoduje to wyświetlenie menu z zakładkami ze wszystkimi krokami, które należy zdefiniować.

1.1. Definicja płyty

Zdefiniuj kolumny, które mają być użyte na 96-dołkowej płytce z próbką. Przypisz kolumny tak, aby zawierały bufor, unieruchomione białko lub partnera wiążącego. Dla każdej studzienki asocjacyjnej należy wprowadzić stężenie składnika wiążącego, który ma być użyty. Uwaga: definicja płytki pokazana na rysunku 2 zawiera opcje dla różnych testów.

1.2. Definicja testu

Zdefiniuj wszystkie kroki potrzebne do przeprowadzenia testu. Należą do nich: (i) Linia bazowa (kilka), (ii) Obciążenie, (iii) Asocjacja i (iv) Dysocjacja wiążącego partnera. Następnie, zgodnie z poniższym opisem, połącz poszczególne etapy testu z kolumnami studzienek na płytce próbki, wybierając krok testu, a następnie klikając dwukrotnie odpowiednią kolumnę. To programuje czujniki, które mają być przenoszone z jednej kolumny studzienek do drugiej podczas testu.

1. Linia bazowa
   Rozpocznij od krótkiego kroku podstawowego (≥60 sekund) z czujnikami w buforze testowym (rysunek 2, kolumna 1), aby ustalić początkowe sygnały BLI na 96-dołkowej płytce.
2. Ładowanie (unieruchamianie biotynylowanego białka na czujnikach)
   Przypisz czujniki do studzienek, które będą zawierały biotynylowane białko (Rysunek 2, kolumna 2). Użyj funkcji progowej, aby osiągnąć z góry określony poziom powiązania (patrz Wprowadzenie). Ustaw opcję progu tak, aby wszystkie czujniki zostały przeniesione do następnej kolumny studni, gdy którykolwiek z czujników osiągnie próg.
3. Linia bazowa
   Uwzględnij kolejny etap wyjściowy w buforze (Rysunek 2, kolumna 3; zwykle >5 min) w celu wypłukania nieunieruchomionych białek biotynylowych z czujników i ustanowienia nowych, stabilnych sygnałów wyjściowych. Tylko w przypadku podstawowych testów wiązania/dysocjacji (jak na rysunku 3) należy uwzględnić dodatkowy krok linii bazowej (60 sekund) z czujnikami w nowych studzienkach bufora (rysunek 2, kolumna 4) przed etapem asocjacji.
4. Asocjacja (partnera wiążącego z unieruchomionym białkiem)
   W przypadku podstawowego testu wiązania/dysocjacji (jak na rysunku 3) należy wybrać zakres stężeń czynnika wiążącego, który ma być stosowany dla różnych czujników/studzienek (rysunek 2, kolumna 5). Dostosuj czas kroku tak, aby co najmniej stężenie nasycenia węzła wiążącego zbliżało się do równowagowego sygnału wiązania. Do testu mającego na celu zbadanie allosterycznego wpływu małych ligandów na dysocjację kompleksu białko-białko (jak na rysunku 5), należy wybrać pojedyncze wysokie stężenie czynnika wiążącego (~ 10-krotnie powyżej szacowanego_{K D}) do użycia we wszystkich dołkach asocjacyjnych.
5. Dysocjacja (partnera wiążącego)
   Tylko w przypadku podstawowego testu wiązania/dysocjacji (jak na rysunku 3) należy wyznaczyć czujniki tak, aby powróciły do kolumny 4 (rysunek 2), tych samych studzienek buforowych, które są używane do dodatkowej linii podstawowej przed asocjacją. W przypadku testu mającego na celu zbadanie allosterycznego wpływu małych ligandów należy zamiast tego wyznaczyć czujniki, które przejdą do kolumny 6 (rysunek 2), gdzie każda studzienka może zawierać bufor oraz różne ligandy allosteryczne.

1.3. Przypisanie czujnika

Wskaż miejsca w zasobniku czujników, które będą zawierały wstępnie zwilżone czujniki do testu. Zidentyfikuj wszystkie puste pozycje, ponieważ eksperyment zakończy się niepowodzeniem, jeśli nie zostaną podniesione żadne czujniki.

1.4. Przegląd eksperymentu

Wizualizuj wszystkie zaplanowane kroki, aby sprawdzić, czy nie ma błędów i wróć, aby je poprawić.

1.5. Uruchom eksperyment

Wprowadź niezbędne szczegóły, w tym lokalizację plików danych. Wprowadź żądaną temperaturę eksperymentu. Jeśli czujniki nadal wymagają wstępnego zwilżenia, wybierz opcję opóźnienia rozpoczęcia eksperymentu. Na koniec, po zakończeniu przygotowania próbki (krok 2) i załadowaniu do urządzenia zarówno płytki na próbkę, jak i tacki czujnika, kliknij przycisk Go, aby uruchomić test.

2. Przygotowanie próbki

1. Przygotować odpowiedni bufor do oznaczania. Bufor stosowany w doświadczeniach pokazanych na rysunkach 3 i 5: 20 mM MOPS (kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy), Tris (tris(hydroksymetylo)aminometan) (dodany w celu dostosowania pH do 8,0), 50 mM KCl. Włączyć BSA (albumina surowicy bydlęcej, wolna od kwasów tłuszczowych, 0,5 mg/ml ostateczna) do buforu dla wszystkich etapów oznaczania i dla wszystkich rozcieńczeń biotynylowanego białka lub partnera wiążącego, aby zminimalizować niespecyficzne wiązanie białek z czujnikami.
2. Rozcieńczyć biotynylowane białko (ε) w buforze do oznaczania do odpowiedniego stężenia (patrz Wprowadzenie).
3. Przygotować rozcieńczenia substancji wiążącej (F₁(-ε)) w buforze do oznaczania (patrz Dyskusja w celu uzyskania informacji na temat zakresu stężeń do zastosowania).
4. Wstępnie zwilż czujniki pokryte streptawidyną przez co najmniej 10 minut, aby usunąć ich ochronną powłokę sacharozy. Wyjmij stojak z czujnikiem z tacki na czujnik i włóż 96-dołkową płytkę w dno tacy, wsuwając jeden róg płytki w wycięcie orientujące na tacy. W przypadku kolumny czujników, które mają być użyte, dodać 200 μl buforu testowego na basenik do tej kolumny płytki 96-dołkowej. Umieść stojak czujników na tacy we właściwej orientacji (z wypustkami w szczelinach).
5. Zgodnie z zaleceniami podczas programowania w kroku 1, napełnić studzienki płytki próbki buforem do oznaczania lub odpowiednimi rozcieńczeniami białka, jak na rysunku 2. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza, ponieważ mogą one powodować zakłócenia w sygnale optycznym. Dołączyć co najmniej jedną studzienkę referencyjną, w której pominięto (i) białko biotynylowane lub (ii) partnera wiążącego.
6. Otwórz drzwi instrumentu i włóż tackę czujnika na stolik (po lewej), tak aby zaczepy tacki były włożone w szczeliny stolika. Włóż płytkę próbki do uchwytu płytki (po prawej); Upewnij się, że talerz jest osadzony płasko i we właściwej orientacji, jak wskazano na uchwycie talerza. Zamknij drzwiczki i rozpocznij test z programu Akwizycja danych (krok 1.5).

3. Przetwarzanie danych

1. Po uruchomieniu testu otwórz oprogramowanie do analizy danych i załaduj folder zawierający dane. Kliknij kartę "Przetwarzanie", aby wyświetlić menu przetwarzania krokowego (po lewej stronie) i surowe dane kinetyczne, przy czym każdy czujnik (AH) ma przypisany inny kolor (patrz rysunek 3).
2. W sekcji "Wybór danych" kliknij przycisk "Wybór czujnika". Na "Mapie płytki próbkowania" oznaczyć studzienki dla 1 lub 2 czujników kontrolnych (G, H w teście na rysunku 3) jako studzienki referencyjne. W menu Processing (Przetwarzanie) zaznacz pole "Subtraction" (Odejmowanie) i wybierz opcję "Reference Wells" (Studnie referencyjne), aby odjąć sygnał referencyjny (pojedynczy lub uśredniony) od każdego innego sygnału czujnika.
3. Wyrównaj wszystkie ślady do Y=0, korzystając z kroku "Wyrównaj oś Y". Wybierz "Linia bazowa" jako krok wyrównania (jest to ostatnia linia bazowa przed krokiem skojarzenia). W polu "Zakres czasu" wprowadź ostatnie 10 sekund tej linii bazowej (tj. 50–60 sekund w przypadku 60-sekundowej linii bazowej, jak pokazano na rysunku 3).
4. Zaznacz pole "Korekcja międzyetapowa", aby zminimalizować przesunięcia sygnału między krokami asocjacji i dysocjacji. Wybierz opcję Wyrównaj do linii bazowej lub Dysocjacja.
5. W większości przypadków wybierz funkcję filtrowania Savitzky-Golay i kliknij "Przetwarzaj dane!", aby kontynuować. Sprawdź wzrokowo końcowe przetworzone dane (prawy dolny panel). W przypadku testów przeznaczonych do globalnej analizy danych (jak na rysunku 4), jeśli ślady sygnału wykazują znaczne przesunięcie między etapami asocjacji i dysocjacji, zmień wybór dysocjacji lub linii bazowej dla "Korekcji międzyetapowej" i ponownie przetwórz dane przed przejściem do analizy danych.

4. Analiza danych

Kliknij zakładkę "Analiza" w Analizie danych, aby rozpocząć. Uwaga: poniższe przykładowe kroki służą do globalnej analizy wielu krzywych wiązania/dysocjacji (jak na rysunku 3).

1. W polu "Krok do analizy" wybierz opcję Skojarzenie i dysocjacja. W polu "Model" (Model) wybierz opcję 1:1. Uwaga: dostępne są inne ograniczone opcje.
2. W polu "Dopasowanie" wybierz opcję Globalny (pełny). W polu "Grupuj według" wybierz Kolor (jak na wykresie). Wybierz "R_max Unlinked By Sensor", aby umożliwić niezależne dopasowanie R_max (maksymalna odpowiedź sygnału po nasyceniu wiązania partnera z unieruchomionym białkiem). Uwaga: robimy to w przypadku większości testów, ponieważ czujniki różnią się nieznacznie pod względem ilości unieruchomionego białka (patrz rysunek 3, Ładowanie).
3. W podanej tabeli upewnij się, że wszystkie ścieżki czujników, które mają być analizowane, mają ten sam kolor, dzięki czemu będą analizowane jako zestaw globalny. W razie potrzeby wybierz jeden lub więcej ścieżek czujnika, które chcesz pominąć przy globalnym dopasowaniu: w kolumnie "Uwzględnij" kliknij prawym przyciskiem myszy żądaną pozycję czujnika i wybierz "Wyklucz studnie".
4. Kliknij "Dopasuj krzywe!", aby rozpocząć analizę regresji nieliniowej. Zbadaj wyniki dopasowania, które obejmują (i) nałożenie krzywych regresji na ślady danych z czujnika (jak na rysunku 4), (ii) wykresy reszt dopasowania oraz (iii) tabelę z wyznaczonymi wartościami parametrów (stałe szybkości, R_max, K_D) i statystyki (błędy standardowe dla parametrów, chi-kwadrat, R²).
5. W sekcji "Eksport danych" zapisz wyniki dopasowania, klikając "Eksportuj tabelę do pliku .csv". Aby wyświetlić wykres lub dalszą analizę danych/dopasowanych krzywych za pomocą innego oprogramowania, kliknij "Eksportuj wyniki dopasowania", aby zapisać dane każdego czujnika i dopasowaną krzywą w pliku tekstowym.

Wyniki

Kinetyka BLI wiązania i dysocjacji w czasie rzeczywistym jest pokazana na rysunku 3. Eksperyment ten przeprowadzono z buforem testowym w asocjacji i dysocjacji. Eksperyment ten rozpoczął się od 10-minutowego kroku wyjściowego, ponieważ czujniki były wstępnie zmoczone tylko przez krótki czas. Następnie na czujniki załadowano biotynylowane ε. Nie wystąpiła wykrywalna dysocjacja ε we wszystkich pozostałych etapach, co widać na podstawie krzywej odniesienia (G), do której nie dodano partnera wiążącego. Drugi...

Dyskusja

Obecnie dostępne instrumenty do BLI pozwalają na znaczną przepustowość i elastyczność w testach interakcji biomolekularnych. Różne próbki roztworów są dozowane do studzienek na czarnej płytce do mikromiareczkowania, a zestaw równoległych czujników BLI jest zaprogramowany tak, aby poruszał się tam iz powrotem między kolumnami studzienek na płytce. Próbki są mieszane przez wytrząsanie orbitalne przez cały czas trwania testu. Zastosowany tutaj system składa się z 8 czujników i wykorzystuje 96-dołkową płytkę do pobierania pr...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Octet-RED96	Palka/Fort i ostry; Bio	30-5048
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma	A6003-10G	Biosensor bez kwasów tłuszczowych
/ Streptawidyna	Pal / Fort i ostry; Bio	18-5019	Taca z 96 czujnikami
Płytka do mikromiareczkowania	Greiner Bio-one	655209	, Polipropylen
Oprogramowanie do akwizycji danych	Pall/Forté Bio	Wersja 6.4	Dostępne nowsze wersje
Oprogramowanie do analizy danych	Pall/Forté Bio	Wersja 6.4	Dostępne nowsze wersje