Wykorzystanie dotchawczego podawania PAMP w jamie ustnej i gardłowej oraz płukania oskrzeli i pęcherzyków płucnych w celu oceny odpowiedzi immunologicznej gospodarza u myszy

Podsumowanie

Odpowiedź immunologiczna gospodarza na infekcję patogenem jest ściśle regulowanym procesem. Wykorzystując model ekspozycji płuc na lipopolisacharydy u myszy, możliwe jest przeprowadzenie oceny w wysokiej rozdzielczości złożonych mechanizmów związanych z patogenezą choroby.

Streszczenie

Odpowiedź immunologiczna gospodarza na patogeny jest złożonym procesem biologicznym. Większość badań in vivo klasycznie stosowanych do charakteryzowania interakcji gospodarz-patogen wykorzystuje dootrzewnowe wstrzyknięcia wybranych bakterii lub wzorców molekularnych związanych z patogenem (PAMP) u myszy. Chociaż techniki te dostarczyły ogromnych ilości danych związanych z patobiologią chorób zakaźnych, modele iniekcji dootrzewnowej nie zawsze są odpowiednie do badań interakcji gospodarz-patogen w płucach. Wykorzystując model ostrego zapalenia płuc u myszy, możliwe jest przeprowadzenie analizy w wysokiej rozdzielczości wrodzonej odpowiedzi immunologicznej gospodarza przy użyciu lipopolisacharydu (LPS). W tym miejscu opisujemy metody podawania LPS za pomocą niechirurgicznego podawania dotchawiczego jamy ustnej i gardła, monitorujemy parametry kliniczne związane z patogenezą choroby oraz wykorzystujemy płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego do oceny odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Opisane techniki mają szerokie zastosowanie w badaniu wrodzonej odpowiedzi immunologicznej gospodarza na różnorodny zakres PAMP i patogenów. Podobnie, z niewielkimi modyfikacjami, techniki te mogą być również stosowane w badaniach oceniających alergiczne zapalenie dróg oddechowych oraz w zastosowaniach farmakologicznych.

Wprowadzenie

Infekcje płuc związane z gatunkami bakterii chorobotwórczych są częstą przyczyną globalnej zachorowalności i śmiertelności. Określenie mechanizmów, które kierują odpowiedzią immunologiczną gospodarza na te patogeny, przyczyni się do opracowania nowych strategii zapobiegawczych i środków terapeutycznych, które złagodzą wpływ tych infekcji. Ogólnym celem opisanego tutaj protokołu jest zapewnienie użytkownikowi elastycznej metody oceny wrodzonej odpowiedzi immunologicznej gospodarza na zakażenie patogenem przy użyciu wzorca molekularnego związanego z patogenem (PAMP) jako substytutu żywych bakterii. Większość wcześniejszych badań oceniających wrodzoną odpowiedź immunologiczną gospodarza na bakterie koncentrowała się na modelach otrzewnowej ze względu na względną łatwość wykonania. Chociaż modele te są bardzo przydatne i zaowocowały znacznymi postępami w dziedzinie interakcji gospodarz-patogen i ogólnoustrojowego stanu zapalnego, dane wygenerowane z tych modeli nie zawsze są odpowiednie dla badań obejmujących układ oddechowy. W tym przypadku zaproponowano płucny model ostrego zapalenia płuc jako praktyczne i klinicznie istotne rozszerzenie klasycznych modeli iniekcji dootrzewnowej (i.p.). Proponowana technika pozwala na lokalną ocenę wrodzonej odpowiedzi immunologicznej w układzie modelowym specyficznym dla danego narządu.

Opisane tutaj metody mają na celu zapewnienie prostej i solidnej techniki, która pozwoli użytkownikom ocenić odpowiedź immunologiczną gospodarza na LPS, który jest powszechnym PAMP. Metody opierają się na dotchawniczym (i.t.) wkraplaniu LPS, który indukuje silną wrodzoną odpowiedź immunologiczną w płucach myszy i naśladuje wiele cech patofizjologicznych obserwowanych u pacjentów cierpiących na infekcje dróg oddechowych i ostre uszkodzenie płuc¹. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona użytkownikowi ocenić odpowiedź immunologiczną gospodarza bez czynników zakłócających i obaw o bezpieczeństwo związanych z prowadzeniem badań in vivo z użyciem żywych bakterii. Podobnie, opisana w tym protokole droga narażenia na i.t. w jamie ustnej i gardle ma znaczące zalety w porównaniu z innymi powszechnie stosowanymi technikami, w tym podawaniem donosowym (i.n.) i chirurgicznym podawaniem i.t. Na przykład podawanie dożylnie w jamie ustnej i gardle pozwala na stosunkowo dokładne dawkowanie i odkładanie się w płucach w porównaniu z podawaniem dożylnie, które zwykle cierpi na zwiększoną zmienność odkładania się w płucach z powodu utraty środków w jamie nosowej i zatokach^2-4. Droga podania i.t. omija te jamy i umożliwia bezpośredni dostęp do tchawicy i dróg oddechowych. Podobnie, chirurgiczne podejście informatyczne jest znacznie bardziej chorobliwą metodą podawania i wymaga intensywnego szkolenia. Opisane tutaj protokoły zawierają również opis powszechnych technik i markerów zastępczych stosowanych do oceny postępu stanu zapalnego i kończą się protokołem opisującym prawidłowe techniki przygotowania płuc do oceny histopatologicznej. Protokoły te koncentrują się na zminimalizowaniu liczby myszy wymaganych do każdego badania poprzez maksymalizację danych generowanych od każdego zwierzęcia.

Opisane protokoły są bardzo elastyczne i mogą być łatwo modyfikowane w celu oceny różnorodnych zakresów PAMP i związanych z uszkodzeniami wzorców molekularnych (DAMPs). Ponadto, z kilkoma dodatkowymi modyfikacjami, protokoły te mogą być również stosowane w badaniach oceniających postęp alergicznej choroby dróg oddechowych lub interakcje gospodarz-patogen z żywymi bakteriami, wirusami lub grzybami^5-10.

Protokół

Wszystkie badania zostały przeprowadzone za zgodą Komitetu ds. Opieki i Użytkowania (IACUC) dla Virginia Tech oraz zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.

1. Dotchawicze (i.t.) Inokulacja LPS przy użyciu podawania ustno-gardłowego

1. Upewnij się, że każde zwierzę jest jednoznacznie zidentyfikowane za pomocą dziurkacza w uchu, kolczyka lub innej metody zatwierdzonej przez instytucję.
2. Należy zapisać wyjściową masę ciała i temperaturę ciała dla każdego zwierzęcia.
3. Przygotuj zapas roboczy LPS. Każda mysz otrzyma dawkę 50 μl 1 mg/kg LPS w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Zwierzęta poddane próbie leczenia otrzymają dawkę 50 μl 1x PBS.
4. Przygotować odpowiednią komorę do podania izofluranu przy użyciu następującej metody kroplowej. Wytyczne instytucjonalne różnią się w odniesieniu do stosowania izofluranu i innych środków znieczulających, a przed rozpoczęciem jakichkolwiek badań należy skontaktować się z Departamentem Opieki/Dobrostanu Zwierząt swojej instytucji, aby upewnić się, że wszystkie wytyczne są odpowiednio przestrzegane. Jeśli izofluran stosowany w kroplach nie jest opcją, dopuszczalne są inne środki znieczulające.
   1. W odpowiedniej komorze bezpieczeństwa nanieść około 3 ml izofluranu na złożony chłonny ręcznik papierowy i umieścić na dnie zlewki o pojemności 500 ml.
   2. Umieść mały kawałek folii aluminiowej na ręczniku papierowym i przykryj zlewkę przezroczystą pokrywką.
5. Przygotuj narzędzia i odczynniki, które będą używane podczas inokulacji it. Umieść gumową opaskę, która zabezpieczy głowę zwierzęcia na stanowisku do intubacji. Ta procedura będzie wymagała pary prostych kleszczy, pary kleszczy kątowych lub zakrzywionych oraz pipety p200 z końcówkami.
6. Załadować 50 μl LPS do końcówki pipety i umieścić w łatwo dostępnym miejscu obok stanowiska do intubacji.
7. Znieczulij mysz, umieszczając zwierzę w komorze izofluranu i przykrywając komorę przezroczystą pokrywą. Obserwuj wzorce oddychania zwierzęcia, które będą szybkie i płytkie, gdy po raz pierwszy umieścisz je w komorze. Zwierzę będzie odpowiednio znieczulone, gdy częstość oddechów zbliży się do 1 oddechu/2 sekundy, co zwykle osiąga się w ciągu 30 sekund od umieszczenia w komorze. Mysz powinna zostać znieczulona zgodnie z zatwierdzonym protokołem dla zwierząt przy użyciu metody kroplowej izofluranu.
8. Wyjmij znieczuloną mysz z komory i zawieś zwierzę na stanowisku do intubacji za przednie siekacze. Upewnij się, że zwierzę jest bezpiecznie unieruchomione, a usta i język są dostępne.
9. Delikatnie zabezpiecz język prostymi kleszkami. Chwyć język skośnymi kleszczami i delikatnie wyciągnij go z ust, aż poczujesz lekki opór. To działanie jest wystarczające, aby zablokować nagłośnię i uzyskać dostęp do tchawicy.
10. Trzymając język w pozycji wyprostowanej, należy podać dawkę 50 μl LPS w tylną część gardła i natychmiast zakryć nozdrza zwierzęcia palcem w rękawiczce. LPS będzie widoczny w tylnej części gardła, dopóki mysz nie weźmie wdechu.
11. Kontynuuj zakrywanie nozdrzy i trzymaj język wyprostowany przez dodatkowe 5-10 oddechów.
12. Wyjmij mysz ze stanowiska do intubacji i umieść zwierzę z powrotem w nowej klatce, aż dojdzie do siebie po znieczuleniu.
13. Monitoruj markery zastępcze związane z postępem choroby. Masa ciała i temperatura ciała powinny być monitorowane co 4-8 godzin przez cały czas trwania badania. Podobnie oceń cechy behawioralne i objawy kliniczne związane ze zwiększoną zachorowalnością.
14. Aby ocenić postęp choroby, należy zbierać myszy w określonych punktach czasowych po ekspozycji na LPS. Typowe punkty czasowe zbiorów po ekspozycji na LPS to 0, 6, 12, 18, 24 i 48 godzin. Aby ocenić powrót do zdrowia i przeżycie, oceniaj myszy przez 7 dni po inokulacji.

2. Kolekcja surowicy i płynu do płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF)

1. Poświęć mysz za pomocą metody zatwierdzonej przez instytucję.
2. Połóż zwierzę na plecach i przymocuj je do deski do sekcji zwłok, najlepiej o wysokości 0,5 cala (1,27 cm).
3. Zwilż całą mysz 70% etanolem.
4. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą o sile 27 G należy przeprowadzić nakłucie serca przed wykonaniem jakichkolwiek nacięć. Powinno być możliwe pobranie 500-800 μl pełnej krwi od jednej myszy.
5. Wyjąć igłę ze strzykawki i przenieść pełną krew do wstępnie oznaczonej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. W celu pobrania surowicy pozwól krwi pełnej na koagulację przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. Oprócz pobierania surowicy, procedura ta może być również zmodyfikowana poprzez włączenie antykoagulantu do probówki i strzykawki, przed pobraniem pełnej krwi, w celu zbadania krążących komórek odpornościowych.
6. Wykonaj poziome nacięcie na całej długości jamy otrzewnej i pionowe nacięcie od jamy otrzewnej do dolnej szczęki myszy.
7. Za pomocą kleszczy chwyć obie strony nacięcia i delikatnie odciągnij skórę od leżących poniżej jam otrzewnej i klatki piersiowej.
8. Wykonaj duże nacięcie wzdłuż jamy otrzewnej od narządów płciowych do mostka, uważając, aby nie przeciąć przepony. Delikatnie przesuń jelita w jamie otrzewnej, aby umożliwić dostęp do jednej z nerek.
9. Przeciąć żyłę nerkową prowadzącą do nerki, aby służyła jako punkt drenażu do perfuzji.
10. Naciąć przeponę nożyczkami, uważając, aby ominąć płuca i serce, aby odsłonić lewą stronę serca.
11. Ręcznie wykonać perfuzję serca za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml z igłą 27 G i 1x roztworem PBS. Unikaj stosowania nadmiernej siły podczas perfuzji, aby upewnić się, że sól fizjologiczna nie zostanie wtłoczona do płuc. Pozostała krew powinna spłynąć z nacięcia żyły wrotnej.
12. Ostrożnie przeciąć klatkę piersiową wzdłuż mostka za pomocą/nożyczek, uważając, aby nie przeciąć serca i płuc. Przypadkowe przecięcie płuc podczas tego zabiegu znacznie zmniejszy ilość pobranego BALF i spowoduje niemożność prawidłowego napompowania płuc utrwalaczem.
13. Delikatnie odizoluj serce i płuca od klatki piersiowej za pomocą kleszczy. Ostrożnie przeciąć każdą sekcję klatki piersiowej/nożyczkami jak najbliżej kręgosłupa i całkowicie usunąć obie sekcje.
14. Oddziel gruczoły ślinowe za pomocą kleszczy lub usuń je nożyczkami, aby odsłonić tchawicę.
15. Ostrożnie przeciąć mięśnie pokrywające tchawicę za pomocą nożyczek. Istotne jest, aby podczas tego procesu nie przecinać tchawicy.
16. Za pomocą nożyczek oddziel obojczyk od tchawicy.
17. Delikatnie chwyć grasicę za pomocą kleszczy i odsuń tkankę od serca. Usuń grasicę za pomocą nożyczek, uważając, aby nie przeciąć serca lub płuc.
18. Wykonaj małe poziome nacięcie w tchawicy 1-2 pierścienie poniżej krtani za pomocą nożyczek kątowych (kąt 45-90º, ostry/ostry). Nacięcie powinno być na tyle duże, aby mocno zabezpieczyć kaniulę.
19. Włóż kaniulę tak, aby zwężający się koniec wystawał 2-3 pierścienie tchawicy poniżej nacięcia i zabezpiecz kaniulę na miejscu za pomocą jedwabnego szwu. Upewnij się, że szew przechodzi między tchawicą a przełykiem i jest mocno naciągnięty na kaniulę.
20. Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml 1 ml buforowanego roztworu soli fizjologicznej Hanksa (HBSS) i delikatnie włóż jego luer do kaniuli.
21. Wykonując powolny, ale stały ruch, wstrzyknij ~900 μl do tchawicy, napełniając płuca, i natychmiast wycofaj HBSS. Umieść odzyskany BALF w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
22. Powtórzyć płukanie jeszcze 2 razy, aby zebrać około 3 ml BALF do przyszłej analizy. Przechowywać BALF na lodzie lub w temperaturze 4 ºC, aż będzie gotowy do użycia.

3. Przygotowanie do badania histopatologicznego

1. Włożyć strzykawkę o pojemności 10 ml do podstawki do pompowania płuc. Zamontuj rurkę do luera, luer do kranu i kran do strzykawki. Upewnij się, że zawór odcinający jest w pozycji zamkniętej. Strzykawka o pojemności 10 ml będzie służyć jako zbiornik przepływu grawitacyjnego. Zbiornik powinien być przymocowany do stojaka do napełniania na wysokość 4,75 cala nad zwierzęciem, a górna część zbiornika powinna wystawać 10,5 cala nad zwierzęciem.
2. Napełnić strzykawkę neutralnym, buforowanym roztworem formaliny. Upewnić się, że strzykawka jest całkowicie wypełniona utrwalaczem.
3. Umieść chłonny ręcznik pod otwartym końcem rurki i otwórz kurek, aby utrwalacz mógł wypełnić rurkę. Gdy utrwalacz zacznie wypływać z rurki, natychmiast zamknij kran i ponownie napełnij strzykawkę do góry utrwalaczem. Ważne jest, aby strzykawka była całkowicie napełniona, aby zapewnić odpowiedni nacisk do napompowania płuc.
4. Delikatnie przełóż drugi kawałek nici szwu pod tchawicą, około 1-2 pierścienie tchawicy poniżej końca kaniuli.
5. Zawiąż pojedynczy luźny węzeł w szwie, jednak nie naciągaj go mocno.
6. Włóż rurkę ze stojaka do pompowania myszy do kaniuli.
7. Otwórz kran i pozwól, aby płuca wypełniły się przez pompowanie grawitacyjne.
8. Gdy płuca osiągną maksymalny poziom napompowania, mocno zaciągnij szew i zawiąż drugi węzeł.
9. Zamknij zawór odcinający i wyjmij rurkę z kaniuli.
10. Delikatnie wyjmij kaniulę z tchawicy, chwytając szew kleszczami i przytrzymując kaniulę palcami. Mocno pociągnij szew w dół w kierunku klatki piersiowej, a kaniulę z powrotem w kierunku nosa myszy.
11. Delikatnie chwyć tchawicę lub szwy kleszczami i odnieś tchawicę od jamy szyi.
12. Odetnij tchawicę ogonową do zawiązanego szwu za pomocą nożyczek.
13. Gdy tchawica zostanie uwolniona od leżących pod nią tkanek, zacznij odciągać tchawicę od myszy. Delikatnie wyjmij płuca z jamy klatki piersiowej.
14. Ostrożnie przeciąć tkankę łączną trzymającą płuca w jamie klatki piersiowej. Kontynuuj odciąganie tchawicy od ciała myszy i stosuj stałą siłę w górę, przecinając leżące poniżej połączenia. Uważaj, aby nie przeciąć płuc. Należy pamiętać, że w ten sposób serce powinno pozostać przyczepione do płuc
.
15. Po usunięciu płuc umieść je w 10 ml buforowanej formaliny.
16. Usuń fragment ogona myszy w celu genotypowania.
17. Zwłoki myszy należy usunąć zgodnie z odpowiednimi wytycznymi instytucjonalnymi.

4. Ocena cytokin

1. Odwirować krew pełną, pobraną zgodnie z krokiem 2.5, w temperaturze 12 000 x g przez 5 minut w celu wyizolowania surowicy. Przenieść surowicę do wstępnie oznaczonej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.
2. Oceń poziom cytokin w surowicy za pomocą testu ELISA lub innego podobnego testu. Rozcieńczyć surowicę w stosunku 1:5 - 1:20 w odpowiednim buforze do rozcieńczania, w zależności od testu, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Rozcieńczenia te należy oznaczyć empirycznie przed badaniem większości próbek.
3. Ze względu na małą objętość pobranej surowicy należy zmniejszyć objętość próbki załadowanej na płytkę ELISA o połowę. Na przykład większość komercyjnych testów ELISA wykorzystuje 100 μl objętości wzorców i próbek. Aby zakonserwować próbki, załaduj 50 μl wzorców i rozcieńczoną surowicę do dołka.
4. Odwirować BALF w chłodzonej wirówce stołowej o sile 200 x g przez 5 minut. Przenieść bezkomórkowy supernatant do dwóch wstępnie oznakowanych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.
5. Oceń cytokiny BALF za pomocą testu ELISA lub innego podobnego testu bez rozcieńczania.
6. Niewykorzystane serum i BALF należy przechowywać w temperaturze -80 °C.

5. Barwienie różnicowe i ocena komórkowości BAL

1. Po odwirowaniu BALF i całkowitym usunięciu HBSS należy poddać lizie granulowane krwinki czerwone za pomocą hipotonicznego roztworu soli fizjologicznej. Ponownie zawiesić komórki w 900 μl wody destylowanej. Natychmiast dodaj 100 μl 10x PBS.
2. Każdą próbkę należy poddać indywidualnej lizie. Jeśli próbki zawierają nadmierną ilość czerwonych krwinek, komórki można granulować w wirówce stołowej o stężeniu 400 x g przez 5 minut, a protokół lizy czerwonych krwinek można powtórzyć.
3. Oznaczyć całkowitą komórkowość BALF w 1 ml zawiesiny za pomocą hemacytometru w powiększeniu 10X lub 20X z barwieniem błękitem trypanowym. Oceń i przedstaw te dane jako komórki/ml.
4. Przygotuj materiały do cytospinu i barwienia różnicowego. Etykietuj standardowe szkiełka mikroskopowe za pomocą ołówka lub pisaka odpornego na rozpuszczalniki. Zabezpiecz szkiełka w wsporniku cytospinowym i lejku. Zamocuj zespół suwaka w wirniku cytospinowym.
5. Cytospin 150 μl BALF w stężeniu 100 x g przez 5 min. Jeśli gęstość komórek jest zbyt duża, aby skutecznie ocenić morfologię komórki, zmniejsz objętość odwirowaną na szkiełkach. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu przez noc.
6. Różnicowe barwienie suwaków zgodnie z protokołami producenta. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu przez noc. Nałóż szkiełka nakrywkowe za pomocą Permount i oceń szkiełka za pomocą mikroskopu wyposażonego w obiektyw 20X i 40X.
7. Zbierz pozostałe komórki do późniejszej analizy, takiej jak FACS, mikroskopia elektronowa, mikroskopia konfokalna, ekstrakcja RNA w celu oceny ekspresji genów i/lub ekstrakcja białka w przypadku western blot.

6. Ocena histopatologiczna

1. Przygotuj płuca do oceny histopatologicznej. Po 24-48 godzinach utrwalenia formaliny, zorientować brzusznie całe napompowane płuca i zatopione w parafinie. Przetnij powstałe bloki, aby odsłonić główne przewodzące drogi oddechowe.
2. Aby poprawić dokładność oceniania, ustaw płuca w tej samej pozycji i przytnij każdy blok, aby uzyskać maksymalną podłużną wizualizację głównej osiowej drogi oddechowej wewnątrzpłucnej. Od tego miejsca wytnij odcinki szeregowe o grubości 5 mikronów i zabarwij hematoksyliną i eozyną (H&E). Dodatkowe sekcje można wyciąć i przygotować do hybrydyzacji in situ przy użyciu standardowych protokołów.
3. Oceń histopatologię za pomocą półilościowego systemu punktacji opartego na następujących parametrach zapalnych, które są oceniane w zakresie od 0 (brak) do 3 (ciężkie): naciek komórek jednojądrzastych i wielojądrzastych; przerost i uszkodzenie komórek nabłonka dróg oddechowych; wynaczynienie; mankiety okołonaczyniowe i okołooskrzelowe oraz procent płuc zaangażowanych w stan zapalny. Histopatologia płuc powinna być oceniana przez doświadczonego patologa.
4. Uśrednij wszystkie wyniki parametrów, aby wygenerować całkowity wynik histopatologii lub użyj indywidualnych wyników do ilościowego określenia określonych aspektów postępu choroby. Przeprowadzaj całą punktację w sposób podwójnie ślepy, z recenzentami ślepymi zarówno na genotyp, jak i leczenie. Ten system punktacji został wcześniej opisany^6,7,10.

Wyniki

Ściany komórkowe bakterii gram-ujemnych składają się z LPS, który występuje w środowisku w dużych ilościach. Inhalacja LPS u wrażliwych grup ludzi nasila reaktywność dróg oddechowych i jest zdolna wywołać silną odpowiedź immunologiczną11. LPS jest również powszechnie stosowanym PAMP w modelach mysich w celu wywołania silnej wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. W opisanym tutaj protokole myszy otrzymały dawkę i.t. LPS wyizolowanego z E. coli (serotyp 0111:B4) za pomocą orofaringalnej administracji i.t. W modelac...

Dyskusja

Najbardziej krytyczne kroki do pomyślnej oceny odpowiedzi immunologicznej gospodarza w płucach myszy są następujące: 1) wybierz odpowiedni szczep myszy i płeć dla ocenianego modelu; 2) zoptymalizować dostarczanie PAMP do płuc; 3) prawidłowo zbierać i przetwarzać BALF; oraz 4) prawidłowe unieruchomienie i przygotowanie płuc do oceny histopatologicznej.

Wybór szczepu myszy jest ważnym czynnikiem w ocenie odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Myszy C57Bl/6 są zwykle uważane za optymalne tło dla ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
C57Bl/6J	Kompaktowa	000664
	Laboratory Ohaus Scale Corporation	71142845
Termometr doodbytniczy dla małych zwierząt	Sonda	Scientific TH 5
dla gryzoni	Braintree Scientific	RET 3
Dziurkacz do uszu	Braintree Scientific	EP-S 901
Lipopolisacharyd z E. coli 0111:B4	InvivoGen	LPS-EB
1x Sól fizjologiczna buforowana fosforanem	Life Technologies	10010-023
Isoflurane	Baxter	40032609
podawanie dotchachelu i stanowisko do napełniania płuc	ICAP Manufacturing	n/a
Stanowisko do intubacji gryzoni	Braintree Scientific	Nożyczki RIS 100
(/ostre)	Kleszcze Fisher Scientific	13-806-2
(proste)	Kleszcze Fisher Scientific	22-327-379
(45º, zakrzywione)	Nożyczki Fisher Scientific	10-275
(/)	Fisher Scientific	08-940
Pipeta (200 &mikro; l Pojemność)	Gilson	F123601
Etanol	Sigma	459844
1 ml Strzykawka	BD Medical	301025
10 ml Strzykawka	BD Medical	301604
27 G x 0,5 cala Igła	BD Medical	305109
Mikrowirówka z chłodzeniem	Fisher Scientific	13-100-676
Kaniule tchawicy 1,2 mm z adapterem Luer	Aparat Harvard	732836
Hank's Balanced Salt	Solution Life Technologies	14025-076
4-0 Pleciony jedwabny szew chirurgiczny	Ethicon	A183
Zestawy łączników Luer do rurki	Aparat Harvard	721406
Zestaw kranów Luer	Aparat Harvard	721664
Tygon formula E-3603 Rurki laboratoryjne	Sigma	R-3603
Roztwór formaliny, neutralnie buforowany, 10%	Sigma	HT501128-4L
Mysz IL-1β OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	559603
Mysz IL-6 OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	550950
Mysz TNF-α Zestaw OptEIA ELISA BD	Biosciences	560478
Hemocytometr	Hausser Scientific	3520
Okulary nakrywkowe do hemocytometru	Thermo Scientific	22-021-801
Trypan Blue	Thermo Scientific SV3008401
Klipsy do lejków cytologicznych	Fisher Scientific	10-357
Lejki cytologiczne	Fisher Scientific	10-354
Karty filtracyjne	Fisher Scientific	22-030-410
Szkiełka mikroskopowe	Fisher Scientific	12-544-1
Okulary nakrywkowe	Fisher Scientific	12-540A
Cytospin Cytocentrifuge	Thermo Scientific A78300003
Diff Zestaw do szybkiego barwienia	Fisher Scientific
47733150 Średni montaż Permount	Fisher Scientific	SP15-500

waga do Jackson doodbytnicza Braintree