Odpowiedź immunologiczna gospodarza na infekcję patogenem jest ściśle regulowanym procesem. Wykorzystując model ekspozycji płuc na lipopolisacharydy u myszy, możliwe jest przeprowadzenie oceny w wysokiej rozdzielczości złożonych mechanizmów związanych z patogenezą choroby.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykorzystanie dotchawczego podawania PAMP w jamie ustnej i gardłowej oraz płukania oskrzeli i pęcherzyków płucnych w celu oceny odpowiedzi immunologicznej gospodarza u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Odpowiedź immunologiczna gospodarza na patogeny jest złożonym procesem biologicznym. Większość badań in vivo klasycznie stosowanych do charakteryzowania interakcji gospodarz-patogen wykorzystuje dootrzewnowe wstrzyknięcia wybranych bakterii lub wzorców molekularnych związanych z patogenem (PAMP) u myszy. Chociaż techniki te dostarczyły ogromnych ilości danych związanych z patobiologią chorób zakaźnych, modele iniekcji dootrzewnowej nie zawsze są odpowiednie do badań interakcji gospodarz-patogen w płucach. Wykorzystując model ostrego zapalenia płuc u myszy, możliwe jest przeprowadzenie analizy w wysokiej rozdzielczości wrodzonej odpowiedzi immunologicznej gospodarza przy użyciu lipopolisacharydu (LPS). W tym miejscu opisujemy metody podawania LPS za pomocą niechirurgicznego podawania dotchawiczego jamy ustnej i gardła, monitorujemy parametry kliniczne związane z patogenezą choroby oraz wykorzystujemy płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego do oceny odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Opisane techniki mają szerokie zastosowanie w badaniu wrodzonej odpowiedzi immunologicznej gospodarza na różnorodny zakres PAMP i patogenów. Podobnie, z niewielkimi modyfikacjami, techniki te mogą być również stosowane w badaniach oceniających alergiczne zapalenie dróg oddechowych oraz w zastosowaniach farmakologicznych.
Wprowadzenie
Infekcje płuc związane z gatunkami bakterii chorobotwórczych są częstą przyczyną globalnej zachorowalności i śmiertelności. Określenie mechanizmów, które kierują odpowiedzią immunologiczną gospodarza na te patogeny, przyczyni się do opracowania nowych strategii zapobiegawczych i środków terapeutycznych, które złagodzą wpływ tych infekcji. Ogólnym celem opisanego tutaj protokołu jest zapewnienie użytkownikowi elastycznej metody oceny wrodzonej odpowiedzi immunologicznej gospodarza na zakażenie patogenem przy użyciu wzorca molekularnego związanego z patogenem (PAMP) jako substytutu żywych bakterii. Większość wcześniejszych badań oceniających wrodzoną odpowiedź immunolog....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie badania zostały przeprowadzone za zgodą Komitetu ds. Opieki i Użytkowania (IACUC) dla Virginia Tech oraz zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.
1. Dotchawicze (i.t.) Inokulacja LPS przy użyciu podawania ustno-gardłowego
- Upewnij się, że każde zwierzę jest jednoznacznie zidentyfikowane za pomocą dziurkacza w uchu, kolczyka lub innej metody zatwierdzonej przez instytucję.
- Należy zapisać wyjściową masę ciała i temperaturę ciała dla każdego zwierzęcia.
- Przygotuj zapas roboczy LPS. Każda mysz otrzyma dawkę 50 μl 1 mg/kg LPS w 1....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Ściany komórkowe bakterii gram-ujemnych składają się z LPS, który występuje w środowisku w dużych ilościach. Inhalacja LPS u wrażliwych grup ludzi nasila reaktywność dróg oddechowych i jest zdolna wywołać silną odpowiedź immunologiczną11. LPS jest również powszechnie stosowanym PAMP w modelach mysich w celu wywołania silnej wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. W opisanym tutaj protokole myszy otrzymały dawkę i.t. LPS wyizolowanego z E. coli (serotyp 0111:B4) za pomocą orofaringalnej administracji i.t. W modelac.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Najbardziej krytyczne kroki do pomyślnej oceny odpowiedzi immunologicznej gospodarza w płucach myszy są następujące: 1) wybierz odpowiedni szczep myszy i płeć dla ocenianego modelu; 2) zoptymalizować dostarczanie PAMP do płuc; 3) prawidłowo zbierać i przetwarzać BALF; oraz 4) prawidłowe unieruchomienie i przygotowanie płuc do oceny histopatologicznej.
Wybór szczepu myszy jest ważnym czynnikiem w ocenie odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Myszy C57Bl/6 są zwykle uważane za optymalne tło dla .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.
Podziękowania
Autorzy dziękują VA-MD Regional College of Veterinary Medicine za zapewnienie podstawowego i technicznego wsparcia dla tego projektu. Praca ta jest wspierana przez nagrodę NIH Career Development Award (K01DK092355).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| C57Bl/6J | Kompaktowa | 000664 | |
| Laboratory Ohaus Scale Corporation | 71142845 | ||
| Termometr doodbytniczy dla małych zwierząt | Sonda | Scientific TH 5 | |
| dla gryzoni | Braintree Scientific | RET 3 | |
| Dziurkacz do uszu | Braintree Scientific | EP-S 901 | |
| Lipopolisacharyd z E. coli 0111:B4 | InvivoGen | LPS-EB | |
| 1x Sól fizjologiczna buforowana fosforanem | Life Technologies | 10010-023 | |
| Isoflurane | Baxter | 40032609 | |
| podawanie dotchachelu i stanowisko do napełniania płuc | ICAP Manufacturing | n/a | |
| Stanowisko do intubacji gryzoni | Braintree Scientific | Nożyczki RIS 100 | |
| (/ostre) | Kleszcze Fisher Scientific | 13-806-2 | |
| (proste) | Kleszcze Fisher Scientific | 22-327-379 | |
| (45º, zakrzywione) | Nożyczki Fisher Scientific | 10-275 | |
| (/) | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Pipeta (200 &mikro; l Pojemność) | Gilson | F123601 | |
| Etanol | Sigma | 459844 | |
| 1 ml Strzykawka | BD Medical | 301025 | |
| 10 ml Strzykawka | BD Medical | 301604 | |
| 27 G x 0,5 cala Igła | BD Medical | 305109 | |
| Mikrowirówka z chłodzeniem | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| Kaniule tchawicy 1,2 mm z adapterem Luer | Aparat Harvard | 732836 | |
| Hank's Balanced Salt | Solution Life Technologies | 14025-076 | |
| 4-0 Pleciony jedwabny szew chirurgiczny | Ethicon | A183 | |
| Zestawy łączników Luer do rurki | Aparat Harvard | 721406 | |
| Zestaw kranów Luer | Aparat Harvard | 721664 | |
| Tygon formula E-3603 Rurki laboratoryjne | Sigma | R-3603 | |
| Roztwór formaliny, neutralnie buforowany, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Mysz IL-1β OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 559603 | |
| Mysz IL-6 OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 550950 | |
| Mysz TNF-α Zestaw OptEIA ELISA BD | Biosciences | 560478 | |
| Hemocytometr | Hausser Scientific | 3520 | |
| Okulary nakrywkowe do hemocytometru | Thermo Scientific | 22-021-801 | |
| Trypan Blue | Thermo Scientific SV3008401 | ||
| Klipsy do lejków cytologicznych | Fisher Scientific | 10-357 | |
| Lejki cytologiczne | Fisher Scientific | 10-354 | |
| Karty filtracyjne | Fisher Scientific | 22-030-410 | |
| Szkiełka mikroskopowe | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| Okulary nakrywkowe | Fisher Scientific | 12-540A | |
| Cytospin Cytocentrifuge | Thermo Scientific A78300003 | ||
| Diff Zestaw do szybkiego barwienia | Fisher Scientific | ||
| 47733150 Średni montaż Permount | Fisher Scientific | SP15-500 |
Bibliografia
- Matute-Bello, G., et al. An official American Thoracic Society workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals. Am. J. respir. Cell Mol. Biol. 44, 725-738 (2011).
- Egger, C., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
