Profilowanie transkryptu i metabolitów w celu oceny drzewa tytoniowego i topoli jako surowca dla przemysłu biotechnologicznego

Podsumowanie

Biomasa roślinna stanowi źródło odnawialne dla wielu produktów, w tym paliwa, paszy, żywności i różnych materiałów. W artykule badamy właściwości drzewa tytoniowego (Nicotiana glauca) i topoli jako odpowiednich źródeł dla rurociągu biorafineryjnego.

Streszczenie

Globalny popyt na żywność, paszę, energię i wodę stanowi niezwykłe wyzwanie dla przyszłych pokoleń. Oczywiste jest, że aby sprostać tym wyzwaniom, niezbędne są solidne platformy do poszukiwania zasobów odnawialnych. W ramach wielonarodowego projektu MultiBioPro rozwijamy rurociągi biorafineryjne, aby zmaksymalizować wykorzystanie biomasy roślinnej. Mówiąc dokładniej, używamy topoli i drzewa tytoniowego (Nicotiana glauca) jako docelowych gatunków roślin uprawnych w celu poprawy scukrzania, izoprenoidu, zawartości węglowodorów o długich łańcuchach, jakości włókien oraz zawartości suberyny i ligniny. Metody stosowane do uzyskania tych wyników obejmują platformy sekwencjonowania GC-MS, LC-MS i RNA. Potoki metabolitów są dobrze znanymi narzędziami do generowania tego typu danych, ale mają również ograniczenia polegające na tym, że można używać tylko dobrze scharakteryzowanych metabolitów. Głębokie sekwencjonowanie pozwoli nam uwzględnić wszystkie transkrypty obecne podczas etapów rozwojowych liścia drzewa tytoniowego, ale muszą być odwzorowane z powrotem do sekwencji Nicotiana tabacum. Dzięki tym konfiguracjom dążymy do podstawowego zrozumienia podstawowych procesów i ustanowienia ram przemysłowych do wykorzystania wyników. W bardziej długoterminowej perspektywie wierzymy, że uzyskane tu dane dostarczą środków do zrównoważonego procesu biorafinacji wykorzystującego topolę i drzewo tytoniowe jako surowiec. Do tej pory analizowano podstawowy poziom metabolitów w próbkach, a zastosowane protokoły przedstawiono w niniejszym artykule.

Wprowadzenie

Wzrost populacji i gospodarki spowodowały wzrost zapotrzebowania na żywność, wodę i paliwa. Wiele z tych zasobów jest produkowanych, przetwarzanych i transportowanych przy użyciu ograniczonych środków opartych na paliwach kopalnych, takich jak ropa naftowa. Oczywiste jest jednak, że praktyka ta nie jest zrównoważona, w związku z czym rozwój alternatywnych zasobów będzie miał ogromne znaczenie¹. Obecnie eksploatowanych jest wiele zasobów odnawialnych w różnym stopniu, w tym energia wiatrowa, ruch wody, energia słoneczna, geotermalna i fale. Innym zrównoważonym i w dużej mierze niewykorzystanym zasobem jest biomasa roślinna. Zasób ten oferuje również bardzo opłacalny sposób przekształcania energii pochodzącej z energii słonecznej w paliwa². Oprócz dostarczania paliwa pochodzenia biologicznego, biomasa roślinna oferuje również wyjątkowe możliwości dla alternatywnych produktów, w tym tworzyw sztucznych, detergentów i cennych chemikaliów.

Roślinna ściana komórkowa, która w dużej mierze składa się z polimerów na bazie cukru, stanowi główną część biomasy rośliny i obecnie inwestuje się wiele wysiłku w jej efektywne przekształcanie w bioetanol. Pozostała biomasa może być następnie przetworzona na biogaz i produkty ropopochodne³. Wiele gatunków roślin wieloletnich, w tym trawy i drzewa, które wytwarzają duże ilości biomasy celulozowej, zazwyczaj najlepiej rośnie w strefach umiarkowanych. Jednak około 20% powierzchni lądowej jest półpustynne, a zatem jest również podatne na susze⁴. Oczywiście interesujące byłoby również uprawianie tych suchych ziem roślinami, które mogłyby skutecznie przyczynić się do zrównoważonej produkcji energii i materiałów. Rośliny te muszą charakteryzować się optymalnym zużyciem wody i odpornością na suszę, a do ich dyspozycji zalicza się drzewo tytoniowe (Nicotiana glauca) oraz gatunki z rodzaju agawy.

Konsorcjum MultiBioPro ma na celu wdrożenie zintegrowanego rurociągu biorafineryjnego, wykorzystującego dwa ważne gatunki roślin, topolę i drzewo tytoniowe. Topola stała się obiecującą rośliną uprawną na biopaliwa, ponieważ szybko rośnie, łatwo rozmnaża się klonalnie i doskonale przystosowuje się do szerokiego zakresu warunków klimatycznych i glebowych. Zapewnia również szeroką gamę drewna, włókna, drewna opałowego i innych produktów leśnych⁵. Drzewo tytoniowe pojawiło się również jako odpowiednia roślina do celów biopaliwowych i biorafinerii. Zazwyczaj wytwarza znaczne ilości biomasy, zawiera duże ilości węglowodanów niestrukturalnych⁶, a także ma rzadką zdolność do gromadzenia dużych ilości łatwo ekstrahowalnych olejów niespożywczych (w tym długołańcuchowych węglowodorów nasyconych C_{29-C 31} i triterpenoidów), które nadają się do produkcji biodiesla. Drzewo tytoniowe jest ponadto podatne na ulepszenia genetyczne, ma wysoką zdolność kiełkowania i szczęśliwie rośnie na glebach półpustynnych, które nie są wykorzystywane do produkcji żywności. Wydaje się zatem, że zarówno topola, jak i drzewo tytoniowe mają nieodłączny potencjał dla upraw wielofunkcyjnych, tj. jako nowe surowce o wysokiej wartości dla integracyjnego przemysłu opartego na surowcach pochodzenia biologicznego. W tym artykule skupiamy się na zróżnicowanym zestawie podejść do rozpoznania, w jaki sposób drzewo tytoniowe osadza węglowodory o długich łańcuchach.

Próbując zidentyfikować podstawową maszynerię molekularną odpowiedzialną za produkcję i wydzielanie nasyconych długołańcuchowych węglowodorów na liściach tytoniu, stosujemy nowoczesne technologie oparte na "omice". Obejmuje to sekwencję RNA rozwojowej serii liści (dziesięć etapów) oraz wieloplatformowe podejścia do profilowania metabolitów z wykorzystaniem LC i GC-MS (dla metabolitów polarnych i niepolarnych oraz lipidomiki). Dane te zostaną wykorzystane do eksploracji ekspresji genów, która koreluje z początkiem biosyntezy cząsteczek wskazanych powyżej lub je poprzedza. Geny i szlaki, które wydają się obiecujące dzięki tym przedsięwzięciom, zostaną wykorzystane do testów funkcjonalnych u modelowego gatunku Arabidopsis i ostatecznie mogą stać się podstawą inżynierii biotechnologicznej w drzewie tytoniowym.

Protokół

1. Materiał roślinny

Uprawiaj rośliny Nicotiana glauca w doniczkach o średnicy 30 cm zawierających profesjonalne podłoże M2. Uprawiaj rośliny w szklarni, w której temperatura w ciągu dnia wynosi 20-25 °C, a temperatura nocnym 15 °C. Użyj 16-godzinnego cyklu światła i 8-godzinnego cyklu ciemności jako dodatkowego reżimu oświetlenia.

2. Przygotowanie próbki

1. Dla metabolitów pierwotnych:
   1. Zebrać materiał roślinny (liście i łodygi N. glauca) i natychmiast zamrozić materiał.
   2. Liofilizuj zamrożone materiały roślinne przez liofilizację przez trzy dni.
   3. Miel liofilizowane próbki za pomocą młyna miksującego z metalowymi kulkami.
   4. Drobno zmielone suche materiały rozmieścić w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml lub szklanej fiolce.
2. Dla metabolitów wtórnych:
   1. Zbierz tkanki roślinne i natychmiast zamroź materiał.
   2. Zmiel zamrożone tkanki roślinne za pomocą młynka miksującego z kulą ze stali nierdzewnej lub za pomocą moździerza i tłuczka.
   3. Drobno zmielone tkanki rozmieścić w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml (około 20 mg mokrej masy).

3. Protokół ekstrakcji do profilowania metabolitów pierwotnych przez GC-MS

1. Podwielokrotność zmielonego suchego materiału roślinnego (10 mg liści i 20 mg łodyg) w 2 ml, nakrętka, probówki z okrągłym dnem.
2. Dodać 1 400 μl 100% metanolu i wirować przez 10 sekund.
3. Dodać 60 μl Ribitolu (0,2 mg/ml bulionu w_H2O) jako wewnętrzny wzorzec ilościowy i wirować przez 10 sekund.
4. Dodać jedną kulkę ze stali nierdzewnej (lub tlenku cyrkonu) i homogenizować materiał za pomocą młynka miksującego przez 2 minuty przy 25 Hz.
5. Odwirowywać mieszaninę przez 10 minut przy 11 000 x g.
6. Przenieść supernatant do szklanej fiolki.
7. Dodać 750 μl chloroformu.
8. Dodać 1 500 μl_H2Oi mieszać mieszanie przez 10 sekund.
9. Przenieść 150 μl z górnej fazy (faza polarna) do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
10. Suszyć próbki za pomocą odkurzacza o dużej prędkości. Konieczne jest, aby próbki były doprowadzane do stanu suchego przez okres od 3 do 24 godzin, aż nie będzie w nich żadnych pozostałości cieczy.
11. Dodać 40 μl chlorowodorku metoksyaminy (20 mg/ml w pirydynie).
12. Potrząsać mieszaniną w poziomym wytrząsarce z blokiem grzewczym przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
13. Dodać 70 μl mieszaniny MSTFA N-metylo-N-(trimetylosililo)-trifluoroacetamidu.
14. Wstrząsać mieszaniną przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
15. Odwiruj krople na pokrywie przez krótkie odwirowanie ~ 1 min przy 11 000 x g.
16. Przenieść płyn do szklanych fiolek odpowiednich do analizy GC-MS.

4. Ekstrakcja do profilowania metabolitów wtórnych przez LC-MS

1. Dodać 500 μl metanolu do zamrożonych próbek mielonych.
2. Wstrząsać termomikserem przez 15 minut w temperaturze 70 °C (1 000 ^sec-1).
3. Odwirować próbki (5 min, 20 000 x g), a fazę ciekłą przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
4. Liofilizuj fazę ciekłą za pomocą parownika odśrodkowego (speedvac).
5. Do suchego granulatu dodać 100 μl cykloheksanu i 100 μl miliQ wody.
6. Potrząsać próbkami przez 5 minut w temperaturze pokojowej (użyć wiru).
7. Odwirować próbki (5 min, 20 000 x g).
8. Przenieść 80 μl fazy wodnej (dolna faza) do fiolek iniekcyjnych LC-MS ze stożkowym dnem w celu analizy LC-MS.

5. Analiza danych

1. Skonfiguruj Xcalibur, MarkerLynx, Metalign⁷ lub XCMS⁸ i wybierz analizę danych do przetworzenia.
2. Przygotuj tabelę wykrytych pików, które Cię interesują, zgodnie z klasą związków w Tabeli 1.
3. Identyfikacja pików przez koelucję związków wzorcowych.
4. Następnie opisz wykryte piki za pomocą analizy MSn, algorytmów charakterystyki strukturalnej^9,10, przeglądu literatury i przeszukiwania bazy danych metabolitów^11,12.

6. Wydobycie węglowodorów¹³

1. Zanurzyć świeżo zebrane liście N. glauca (~200 mg) w rozpuszczalniku (metanol, etanol, chloroform, heksan lub eter naftowy (temperatura wrzenia 40-60 °C lub 60-80 °C) (5 ml; Klasa HPLC) przez 2 do 20 min.
2. Usuń liście i całkowicie wysusz rozpuszczalniki przez odparowanie obrotowe.
3. Zawiesić próbki w heksanie (1 ml; Klasa HPLC).
4. Wykonaj analizę GC-MS przy użyciu chromatografii gazowej i z łącznikiem do 5973MSD. Warunki pracy powinny być następujące; gaz nośny, hel o natężeniu przepływu 0,9 ml ^min-1/11 psi. Wstrzykiwać próbki (1 μl) za pomocą wtryskiwacza bez rozdzielania w temperaturze 280 °C. Utrzymywać piec do chromatografii gazowej w temperaturze 70 °C przez 5 minut, a następnie zwiększać temperaturę w temperaturze 4 °C/min do 320 °C. Utrzymywać temperaturę końcową przez kolejne 10 minut, uzyskując łączny czas 67,5 minut. Ustaw interfejs z MS na 280 °C i wykonaj MS w trybie pełnego skanowania przy użyciu 70 eV EI+ i skanowaniu od 10 do 800 D.
5. Wstępnie przetwarzaj składniki chromatogramu za pomocą zautomatyzowanego systemu dekonwolucji i identyfikacji MS oraz te, które są identyfikowane za pomocą biblioteki NIST 98 MS.
6. Potwierdzić identyfikację nasyconych długołańcuchowych węglowodorów alkanowych (heksakosenolu, nonakozanu, triakontanu, oktakosenolu, nonakozonalu, hentriakontanu, dotriakontanu i tritriakontanu) poprzez porównanie czasów retencji i klasycznych wzorców fragmentacji ze znanymi autentycznymi wzorcami.
7. Oznaczyć ilościowo węglowodory, porównując zintegrowane obszary pików z krzywymi dawka-odpowiedź (0,07 do 2,5 mg), skonstruowanymi na podstawie autentycznych wzorców.
8. Obliczanie średnich i błędu standardowego średnich (SEM) za pomocą programu Excel.

7. Analiza izoprenoidów¹⁴

1. Przeprowadzić homogenizację zgodnie z opisem w punkcie 2. Odważyć 10 mg homogenizowanego liofilizowanego proszku do probówki wirówkowej.
2. Dodaj kolejno 250 ml metanolu do proszku, wymieszaj go, a następnie dodaj 500 ml chloroformu (odczynnik laboratoryjny) i wymieszaj przez wirowanie.
3. Pozostawić próbki na lodzie w ciemności na 20 minut.
4. Dodać 250 ml buforu Tris-HCl (100 mM, pH 7,5) lub wody (klasa HPLC) do zawiesiny i wymieszać przez wirowanie.
5. Odwirować mieszaninę z prędkością 12 000 obr./min (13 523 x g) przez 5 minut, aby oddzielić fazę niepolarną od wodnej. Niepolarna faza chloroformowa zawierająca ekstrakty izoprenoidowe znajduje się na dole.
6. Przenieś fazę do nowej probówki wirówkowej.
7. Dodać dodatkowe 500 ml chloroformu do fazy wodnej i przeprowadzić drugą ekstrakcję przez wirowanie i odwirowanie, jak opisano powyżej.
8. Połączyć ekstrakty chloroformu i doprowadzić próbki do sucha za pomocą parownika i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu analizy.
9. Dodać 50 ml octanu etylu (klasy HPLC) do wysuszonego ekstraktu izoprenoidowego w celu ponownego rozpuszczenia materiału.
10. Wstrzyknąć 3 ml do kolumny C18 za pomocą modułu separacji UPLC Acquity. Gradient używany do oddzielania pigmentów powinien obejmować; A: metanol/H₂0 (50:50) i B: acetonitryl/octan etylu (75:25), a warunki początkowe powinny wynosić A 30% (v/v) i B 70% (v/v) przechodząc do 100% B w ciągu 6 minut. Stosować natężenie przepływu 0,6 ml/min.
11. Monitorować eluat w sposób ciągły za pomocą detektora PDA (Photo Diode Array) od 250 do 600 nm.
12. Zidentyfikuj składniki za pomocą chromatografii kochromatycznej i porównań spektralnych między autentycznymi wzorcami, beta-karotenem (prowitaminą A), fitoenem, likopenem, luteiną i zeaksantyną.
13. Przeprowadzić kwantyfikację na podstawie krzywych dawka-odpowiedź.
14. Potwierdzić związki za pomocą LC-MS; użyć podobnych warunków chromatograficznych. Detekcja powinna odbywać się za pomocą jonizacji APCI w trybie dodatnim za pomocą przyrządu Q-Tof.
15. Wykonaj modyfikacje w celu oznaczenia tokoferolu za pomocą 25 mg liofilizowanego materiału, który został wyekstrahowany i zmydlania w 6% KOH w temperaturze 50 °C przez 1,5 godziny.

8. Ekstrakcja RNA do sekwencjonowania RNA

Ten protokół łączy ekstrakcję RNA Trizol za pomocą zestawu RNeasy w celu uzyskania wysokiej jakości RNA.

1. Zmielić 100 mg zamrożonego materiału roślinnego w 2 ml probówkach wirówkowych z metalową kulą za pomocą młynka miksującego.
2. Dodać 1 ml Trizolu.
3. Odwirowywać materiał przez 10 minut przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C.
4. Przenieść supernatant do nowej probówki reakcyjnej.
5. Dodać 200 μl chloroformu, kilkakrotnie odwrócić probówkę i inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
6. Odwirowywać mieszaninę przez 15 minut w temperaturze 12 000 x g w temperaturze 4 °C.
7. Przenieść górną fazę wodną (około 700 μl) do nowej probówki reakcyjnej.
8. Dodać około 2,5 objętości etanolu (100%), kilkakrotnie odwrócić probówkę i inkubować przez 30 minut w temperaturze -80 °C.
9. Przenieść próbkę wraz z osadem do kolumny wirowej z zestawu.
10. Odwirować kolumnę przez 15 sekund przy 8 000 x g i odrzucić przepływ
.
11. Dodać 700 μl buforu RW1 do kolumny wirowej i wirować przez 15 sekund przy 8 000 x g. Odrzucić przepływ.
12. Dodać 500 μl buforu RPE do kolumny wirującej i odwirować kolumnę przez 15 sekund przy 8 000 x g. Odrzucić przepływ.
13. Dodać 500 μl buforu RPE do kolumny wirowej i wirować przez 2 minuty przy 8 000 x g.
14. Umieść kolumnę wirową w nowej probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml i dodaj 50 μl wody wolnej od RNaz.
15. Odwirować kolumnę przez 1 minutę przy 8 000 x g w celu elucji RNA.
16. Usuń resztki DNA za pomocą zestawu Ambion DNA-free Kit zgodnie z instrukcjami producenta.
17. Określ jakość RNA. RNA powinien mieć liczbę integralności RNA (RIN) powyżej 8.
18. Wyślij RNA do sekwencjonowania nowej generacji.

Wyniki

Profil HPLC na rysunku 1 pokazuje reprezentatywny wynik analizy izoprenoidowej ekstraktów z liści N. glauca. Różne izoprenoidy C40 i wyższe wykryto za pomocą detektora PDA (Photo Diode Array). Piki zostały oznaczone adnotacją na podstawie chromatografii równoległej i porównania spektralnego między autentycznymi wzorcami, beta-karotenem (prowitaminą A), fitoenem, likopenem, luteiną i zeaksantyną. Dwa chromatogramy MS na rysunku 2 pokazują wynik analizy metabolitów pierwotnych odpowiednio z liści i łodyg N. glauca. Jako przykład podano również widmo MS piku odpowiadającego serynie (oznaczonego strzałką). Rysunek 3 przedstawia bioanalizator używany do określania jakości RNA i reprezentatywnego wyniku z urządzenia. Dwa główne piki na chromatogramie odpowiadające 18 S i 25 S rybosomalnemu RNA, wskazujące na nienaruszony RNA w próbce. Dodatkowe piki rozdrobnionego rybosomalnego RNA pojawiłyby się w przypadku częściowo lub silnie zdegradowanego RNA.

Rysunek 1. Profil HPLC przedstawiający izoprenoidy obecne w ekstraktach z liści N. glauca. Większość izoprenoidów C40 i wyższych nie poddaje się analizie GC-MS. W związku z tym zastosowaliśmy separacje metodą HPLC z detekcją matrycy fotodiodowej. Pokazany jest typowy chromatogram zarejestrowany przy długości fali 450 nm. Pigmenty karotenoidowe są typowe dla tkanek fotosyntetycznych z dominacją luteiny. Obecna jest również zeaksantyna, która rzadko występuje w tkance liści, chyba że jest narażona na silny stres świetlny. Poziom zeaksantyny sprawia, że jest to dobre źródło tego wysokowartościowego związku. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Chromatogram MS i spektrum ekstraktów tkankowych N. glauca. Przedstawiono chromatogram MS jonów całkowitych (TIC) ekstraktów z liści i łodyg mierzony metodą GC-MS (70-600 m/z). Analizę GC-MS przeprowadzono w sposób opisany wcześniej w^{punkcie 15}. Wykryte piki zostały oznaczone adnotacjami przy użyciu biblioteki znaczników widma masowego. Jako przykład pokazano widmo seryny MS (2TMS). Chromatogram MS: oś X i oś Y wskazują czas retencji (min) i intensywność (obfitość) sygnału, widmo MS: oś X i oś Y wskazują odpowiednio stosunek M/Z i intensywność (obfitość) sygnału. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 3. Pomiar bioanalizatorem RNA przygotowanego do sekwencji RNA materiału liściowego N. glauca . Aby uzyskać wysoce czyste RNA potrzebne do sekwencjonowania RNA, wyekstrahowaliśmy RNA za pomocą odczynnika Trizol, a następnie oczyściliśmy RNA za pomocą kolumn z RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Niemcy). Jakość RNA określiliśmy za pomocą Bioanalyzera (Agilent, Waldbronn, Niemcy) wyświetlanego po lewej stronie. Przykład danych wyjściowych Bioanalyzera znajduje się po prawej stronie. Dwa główne piki w próbce reprezentują 18 S i 25 S rybosomalne RNA. Nasza próbka wykazała liczbę integralności RNA (RIN) wynoszącą 9,2, która jest znacznie powyżej wymaganej wartości 8. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Dyskusja

Przedstawione tutaj protokoły zapewniają kompleksowe ramy do analizy liści drzew tytoniowych pod kątem metabolitów i transkryptów. Przewiduje się, że te połączone wysiłki powinny dostarczyć nam nowych informacji na temat procesów leżących u podstaw syntezy i ekstruzji węglowodorów oraz związków o wysokiej wartości obecnych w tej tkance. Podejścia te powinny zatem dać nam lepsze zrozumienie tego, w jaki sposób związki te są syntetyzowane. Oprócz aspektów związanych z drzewami tytoniowymi, prace mają również na celu poprawę biomasy topoli, w szczególności ukierunkowanie na zdrewnienie struktury ściany wtórnej, ale także zbadanie, czy możemy wykorzystać korę do ekstrakcji cennych związków.

Metody przedstawione w niniejszej pracy stanowią nieznaczne modyfikacje wystandaryzowanych metod profilowania metabolitów. Metody te są oczywiście ograniczone do znanych profili metabolicznych i możliwe jest, że można uzyskać kilka nowych pików metabolicznych, dla których nie jest znany żaden związek. Mamy nadzieję, że uda nam się umieścić te związki w kontekście innych metabolitów, łącząc zachowanie metabolitów i transkryptów w rozwojowych szeregach czasowych.

Żadna z przedstawionych tu metod nie różni się znacząco od metod zwykle stosowanych w odniesieniu do materiałów roślinnych. Interesujący aspekt polega na połączeniu metod pozwalających zrozumieć ramy leżące u podstaw głównie produkcji i modyfikacji długołańcuchowych węglowodorów w liściach drzewa tytoniowego. Jednym z kluczowych etapów uzyskiwania tych informacji jest późniejsze połączenie różnych typów danych. Przewidujemy, że dane jako pierwsza ocena zostaną podzielone na różne klastry w oparciu o zachowanie metabolitów/transkryptów w trakcie rozwoju i że dane te zostaną wykorzystane do wnioskowania o zachowaniach transkryptu i metabolitu, a także do potencjalnego przypisania niektórych metabolitów do szlaków. Ponadto przewiduje się bardziej złożone analizy sieciowe w celu wykorzystania związków przyczynowo-skutkowych.

Przedstawione tu protokoły analityczne będą również stanowić podstawę do prób terenowych i przemysłowego wykorzystania biomasy. Aby to osiągnąć, konsorcjum MultiBioPro składa się z kilku partnerów przemysłowych, którzy mają możliwości dalszego badania biomasy w celu dostarczenia biodiesla, bioetanolu i innych wysokowartościowych związków. Te rodzaje eksploatacji biomasy będą oceniane na podstawie: (1) testowanie wytrzymałości i jakości wytwarzanych bioproduktów (przeprowadzane będą typowe testy zgodne ze standardami branżowymi w celu zapewnienia, że wytworzone produkty mają dobrą wartość rynkową), (2) ocena ekonomiczna, społeczna i środowiskowa technologii zostanie przeprowadzona z wykorzystaniem źródeł literaturowych, wywiadów i materiałów generowanych podczas prób terenowych i ocen biorafinerii w zakładach pilotażowych. Działania te będą obejmowały analizę kosztów i korzyści oraz cyklu życia, opracowanie dokumentacji środowiskowej oraz strategie rynkowe i biznesowe. Wierzymy, że rurociąg ten stanie się użytecznym połączeniem środowiska akademickiego, nauk stosowanych i wykorzystania przemysłowego w celu dalszego pozyskiwania biomasy topoli i drzew tytoniowych na potrzeby konsumenckich produktów końcowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynnik Trizol	Invitrogen	15596-026
Chloroform	Merck	102445
Etanol	Merck	101986
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
TURBO Dnase	Invitrogen	AM2238
RNA 6000 Nano Kit	Agilent	G2938-90034
2100 Bioanalizator elektroforezy	Agilent	G2939AA
1,5 ml i 2 ml probówki safe-lock	Eppendorf	0030 120.086, 0030 120.094
Kulki stalowe	Geyer Berlin GmbH	VA2mm
Młynek miksujący MM 300	Retsch	YO-04182-09
Mikrowirówka	Eppendorf	5424