Separacje metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) i testy biologiczne ekstraktów roślinnych w celu identyfikacji związków przeciwdrobnoustrojowych

Podsumowanie

Opisano metody cienkowarstwowej chromatografii (TLC) separacji ekstraktów roślinnych i kontaktowej bioautografii w celu identyfikacji metabolitów przeciwbakteryjnych. Metody te stosuje się do badań przesiewowych związków fenolowych koniczyny czerwonej hamujących bakterie wytwarzające hiperamoniak (HAB) pochodzące ze żwacza bydła.

Streszczenie

Powszechne badanie przesiewowe dla roślinnych związków przeciwdrobnoustrojowych polega na rozdzielaniu ekstraktów roślinnych za pomocą chromatografii papierowej lub cienkowarstwowej (PC lub TLC), wystawianiu chromatogramów na działanie zawiesin mikrobiologicznych (np. grzybów lub bakterii w bulionie lub agarze), dając czas na rozwój mikrobów w wilgotnym środowisku i wizualizując strefy, w których nie ma wzrostu mikroorganizmów. Skuteczność tej metody przesiewowej, znany jako bioautografia, zależy zarówno od jakości separacji chromatograficznej, jak i od dbałości o warunki hodowli drobnoustrojów. W artykule opisano standardowe protokoły TLC i bioautografii kontaktowej z nowatorskim zastosowaniem do bakterii fermentujących aminokwasy. Ekstrakt rozdziela się na elastycznych (aluminiowych) płytkach TLC z krzemionki, a pasma są wizualizowane w świetle ultrafioletowym (UV). Strefy są wycinane i inkubowane twarzą w dół na agarze zaszczepionym badanym mikroorganizmem. Pasma hamujące są wizualizowane przez barwienie płytek agarowych czerwienią tetrazolową. Metodę stosuje się do rozdzielania związków fenolowych koniczyny czerwonej (Trifolium pratense cv. Kenland) i ich badania przesiewowego pod kątem aktywności przeciwko Clostridium sticklandii, bakteria wytwarzająca hiperamoniak (HAB), która jest rodzima dla żwacza bydlęcego. Metody TLC mają zastosowanie do wielu rodzajów ekstraktów roślinnych i innych gatunków bakterii (tlenowych lub beztlenowych), a także grzybów, mogą być stosowane jako organizmy testowe, jeśli warunki hodowli zostaną zmodyfikowane w celu dopasowania do wymagań wzrostu gatunku.

Wprowadzenie

Oznaczanie związków przeciwdrobnoustrojowych w roślinach wymaga rozdzielenia składników ekstraktu roślinnego, poddania tych składników działania mikroorganizmu testowego i ustalenia, czy wzrost mikroorganizmu został zahamowany przez któryś z tych związków. Rozdzielanie za pomocą chromatografii papierowej lub cienkowarstwowej (PC lub TLC) jest wygodne, ponieważ wiele związków można rozdzielić na powierzchni płaskiej. Rozdzielanie opiera się na polarności, przy czym niektóre związki silnie wiążą się z adsorbentem (celulozą w przypadku PC i różnymi adsorbentami w przypadku TLC) i migrują w mniejszym stopniu niż inne¹. Rysunek 1 przedstawia przykład względnych pozycji polarnych i niepolarnych związków fenolowych po rozdzieleniu na płytce TLC z krzemionką.

Rycina 1. Schemat ilustrujący rozkład związków o różnej polarności po rozdziale na płytce do cienkowarstwowej chromatografii (TLC) na żelu krzemionkowym. Jako przykład wykorzystano związki fenolowe koniczyny czerwonej (Trifolium pratense L.). Związki polarne, takie jak klowamid, wykazują silne powinowactwo do polarnego adsorbentu, jakim jest krzemionka, i pozostają w pobliżu linii startu (OR), natomiast związki mniej polarne, takie jak trzy izoflawony w pobliżu czoła rozpuszczalnika (SF), łatwiej rozdzielają się do rozpuszczalników (które są mniej polarne niż krzemionka, chyba że dodano wodę, kwasy lub zasady) i migrują wyżej na płytce.

Po rozdzieleniu ekstraktu na płytce TLC można poddać mikroorganizmy testowe działaniu wszystkich związków na płytce, co przyspiesza identyfikację aktywnych składników ekstraktu². Jeśli kulturę grzybów lub bakterii nałożymy na chromatogram, wzrost mikroorganizmów będzie następował wszędzie, z wyjątkiem obszarów zawierających związki hamujące wzrost. Strefy inhibicji można następnie zwizualizować, obserwując kontrast między wzrostem grzybni a obszarami wolnymi od wzrostu w przypadku zastosowania grzybów³ lub poprzez spryskanie związkami, które zmieniają kolor po zredukowaniu lub hydrolizie przez żywe komórki⁴. Choć wykorzystanie chromatogramów papierowych lub cienkowarstwowych do testów przeciwdrobnoustrojowych po raz pierwszy zastosowano w przypadku antybiotyków⁵ i fungicydów^3,6, obecnie metodą tą często przesiewa się ekstrakty roślinne w poszukiwaniu związków przeciwdrobnoustrojowych; metoda ta jest często nazywana bioautografią. Opisane tutaj protokoły odnoszą się do bioautografii chromatogramów cienkowarstwowych. TLC jest powszechnie stosowane, ponieważ jest stosunkowo szybkie i może być wykonywane na różnych adsorbentach (np. krzemionce, skrobi, tlenku glinu), a także zapewnia dobrą rozdzielczość i czułość¹.

Ekstrakty roślinne do TLC można przygotować na wiele sposobów. Powszechne metody obejmują ekstrakcję materiału roślinnego w mieszaninach alkoholowo-wodnych, takich jak 80% etanol^7,8, ewentualnie z dodatkiem kwasu lub zasady⁹. Po ekstrakcji w takich rozpuszczalnikach, które zawierają wodę i mogą mieć odczyn kwasowy lub zasadowy, ekstrakty muszą zostać zagęszczone, aby można było je nanieść na płyty TLC w minimalnej objętości. Zagęszczanie ekstraktów alkoholowo-wodnych można przeprowadzić poprzez rozdział z organicznymi rozpuszczalnikami niemieszalnymi z wodą⁸ lub mieszaniną takich rozpuszczalników, np. octanu etylu i eteru etylowego (1:1, v/v)^10,11. Różne metabolity roślinne są ekstrahowane do różnych rozpuszczalników organicznych, w zależności od ich polarności. Aby zapewnić ekstrakcję organicznych kwasów lub zasad roślinnych do rozpuszczalników organicznych na tym etapie, pH ekstraktu alkoholowo-wodnego można podnieść lub obniżyć za pomocą rozpuszczalnego w wodzie kwasu lub zasady, aby przekształcić dysocjowane anality w ich formy niedysocjowane, które są następnie rozpuszczalne w neutralnych rozpuszczalnikach organicznych⁹. Fazę organiczną można następnie odparować pod zmniejszonym ciśnieniem lub w strumieniu azotu i doprowadzić do pożądanej objętości do TLC. Mało prawdopodobne jest, aby pH ekstraktu było letalne dla mikroorganizmów w bioanalizie ze względu na rozdział analitów do neutralnych rozpuszczalników, małą końcową objętość oraz odparowanie ekstraktu z płyty TLC przed rozdzieleniem.

Zarówno grzyby, jak i bakterie są wykorzystywane jako mikroorganizmy testowe w bioautografii ekstraktów roślinnych². Zarodniki niektórych grzybów, takich jak Cladosporium cucumerinum, kiełkują na płytkach TLC (z wyjątkiem obszarów zawierających związki hamujące), jeśli zostaną rozpylone na płytki w roztworze odżywczym i inkubowane w wilgotnym środowisku przez kilka dni³. Ciemna grzybnia C. cucumerinum w strefach niehamujących tworzy ostry kontrast z obszarami wolnymi od wzrostu grzybni. Choć bakterie nanoszono na płytki do chromatografii cienkowarstwowej (TLC) w ten sam sposób^4,12, bakterie wylewa się również na powierzchnie płytek TLC w postaci warstw agarowych^13,14. Drożdże, takie jak Candida albicans, mogą być również nanoszone w warstwach agarowych¹⁴. Alternatywnie, płytki TLC można położyć powierzchnią aktywną do dołu na agar zaszczepiony bakteriami^10,15 lub drożdżami⁸, co jest metodą znaną jako bioautografia kontaktowa².

Opisujemy metodę bioautografii kontaktowej do przesiewowego wyznaczania przeciwdrobnoustrojowych związków fenolowych z koniczyny czerwonej (Trifolium pratense cv. Kenland). Mikroorganizmem testowym jest Clostridium sticklandii, ruminalna bakteria o wysokiej produkcji amoniaku (HAB) i beztlenowiec obligatoryjny. Choć zastosowane rozdzielenia nie pozwalają na wyizolowanie wszystkich składników ekstraktu, ułatwiają one identyfikację stref aktywności przeciwdrobnoustrojowej, zwężając tym samym pulę potencjalnych związków przeciwdrobnoustrojowych. Protokół wykorzystuje standardowe procedury TLC¹. Protokół opisuje również niektóre techniki wymagane do hodowli beztlenowców obligatoryjnych na potrzeby takiego testu, zastosowanie bioautografii kontaktowej¹⁵ oraz metodę wizualizacji z użyciem soli tetrazoliowej, która barwi żywe komórki^2,4.

Protokół

1. Przygotowanie ekstraktu roślinnego

1. Zobacz Kagan i Flythe¹⁰ dla ekstrakcji związków fenolowych z Trifolium pratense cv. Kenland.
2. Aby wyekstrahować inne związki w innych roślinach, zapoznaj się z literaturą dotyczącą analizy fitochemicznej pod kątem metod ekstrakcji specyficznych dla roślin lub metabolitów (wiele z nich jest opisanych) lub poszukaj protokołów, takich jak te Khurrama i wsp.^7,8, które izolują wiele związków o szerokim zakresie polarności.

2. Przygotowanie płyt cienkowarstwowych

1. Oczyścić płytki TLC, rozwijając je w jednym lub kilku polarnych, obojętnych rozpuszczalnikach, w celu usunięcia zaadsorbowanych zanieczyszczeń z dala od strefy rozwoju.
   1. W dygestorii przygotuj wystarczającą ilość rozpuszczalnika czyszczącego (np. 15-100 ml octanu etylu i metanolu w stosunku 2:1, v/v), aby pokryć dno komory wywoływania TLC, a także dolną krawędź płytki TLC, gdy jest umieszczona w komorze.
   2. Używaj dostępnych w handlu szklanych komór do wywoływania TLC (dostępne różne rozmiary, z pokrywkami) lub pokrytych folią zlewek Pyrex lub słoików do wekowania.
   3. Za pomocą nożyczek wycinaj (elastyczne) płytki z żelu krzemionkowego na podłożu aluminiowym lub plastikowym, które są dostępne w różnych rozmiarach (20 cm x 20 cm i mniejsze), aby pasowały do dostępnej komory wywoływania. (Uwaga: krzemionka może spowodować uszkodzenie płuc w przypadku wdychania. Pracuj pod wyciągiem i obchodź się z płytkami TLC w rękawiczkach, aby uniknąć dostania się olejków skórnych na krzemionkę.)
   4. Włóż płytki do komory, tak aby wierzchołki opierały się o ścianki komory. Talerze nie powinny się stykać. Przykryj komorę i pozwól rozpuszczalnikowi przesunąć się w górę płytki poprzez działanie kapilarne.
   5. Gdy rozpuszczalnik dotrze do górnej części płytek, wyjmij płytki z komory i ułóż je w pozycji stojącej w dygestorium, aż rozpuszczalnik odparuje.
   6. Sprawdź, czy zanieczyszczenia migrowały w pobliżu górnej części płytki TLC, szukając żółtego pasma w świetle widzialnym lub pasma fluorescencyjnego w świetle ultrafioletowym (UV) (patrz "front zanieczyszczeń" lub IF na rysunku 2B). Jeśli większość płytki nadal ma żółtawy odcień, powtórz proces czyszczenia.
   7. Po wyjęciu płytek TLC z komory należy wyrzucić rozpuszczalnik. Poczekaj, aż resztki rozpuszczalnika całkowicie odparują przed użyciem komory dla protokołu 2.
   8. Aby usunąć wilgoć resztkową, która może wpływać na migrację związków na krzemionce¹⁶, podeprzyj płytki pionowo w piecu do suszenia w temperaturze 100 °C (10-15 minut w przypadku płyt o wymiarach 20 cm x 20 cm i 5 minut w przypadku płyt o wymiarach 7 cm x 10 cm).
   9. Jeśli suszarka o temperaturze 100 °C nie jest dostępna, podgrzewaj płyty przez dłuższy czas w niższych temperaturach (np. 40 minut w temperaturze 60 °C).
   10. Po wyschnięciu płyt pozwól im ostygnąć do temperatury otoczenia przed załadowaniem.

3. Przygotowanie komór do separacji ekstraktów

1. Użyj nożyczek, aby przeciąć kawałek bibuły filtracyjnej nieco poniżej wysokości komory i około połowy obwodu komory. Papier ten działa jak do wciągania rozpuszczalnika w górę ścianki komory i nasycania komory oparami rozpuszczalnika, poprawiając w ten sposób odtwarzalność separacji¹.
2. W dygestorium wymieszaj rozpuszczalniki (octan etylu-metanol 4:1, v/v, do tego badania). Wlej mieszaninę rozpuszczalnika do komory i przykryj. Poczekaj, aż cały zostanie zwilżony rozpuszczalnikiem, wskazując nasycenie komory, aby włożyć płytki do komory.

4. Ładowanie i rozwój płytek TLC

1. Delikatnie zaznacz początek układu współrzędnych ołówkiem. Jeśli adsorbent płytkowy TLC jest miękki i łatwo ulega uszkodzeniu, zrób ślady na krawędziach. Związki powinny znajdować się nad powierzchnią rozwijającego się rozpuszczalnika, gdy płytki są wkładane do komory TLC.
2. Rozpuść ekstrakty w wystarczającej ilości rozpuszczalnika organicznego (w tym przypadku metanolu), aby uzyskać stężony roztwór zamiast mętnej zawiesiny.
3. Próbki i wzorce należy ładować w postaci wąskich pasm za pomocą mikrolitrowej strzykawki lub mikropipet kapilarnych, pozostawiając 1 cm obwódkę po bokach płytki. Pozostaw opaski do wyschnięcia (pomocne jest wachlowanie płyty lub załadowanie jej do dygestorium).
4. Jeżeli potrzebne jest większe stężenie próbki na płytce, należy przeprowadzić "overspot" poprzez ponowne obciążenie próbek na wysuszone pasma.
5. Za pomocą kleszczy lub szczypiec umieść płytkę (płytki) wewnątrz nasyconej komory TLC. Płytki nie powinny dotykać, ponieważ może on dostarczać rozpuszczalnik do płytek w punktach styku, zmieniając w ten sposób ścieżkę migracji związku. Przykryj komorę i pozwól płytkom się rozwinąć.

5. Przygotowanie płytek do testu biologicznego

1. Wyjąć płytkę (płytki) ze zbiornika TLC, zanim czoło rozpuszczalnika dotrze do górnej części płytki, i zaznaczyć ołówkiem wysokość czoła rozpuszczalnika. Pozostaw płytkę do wyschnięcia w dygestorium.
   1. Wszelkie pozostałe płytki TLC należy umieścić w tej samej komorze TLC, która zazwyczaj nadaje się do użytku przez cały dzień, jeśli jest zamknięta. Ponownie przygotować mieszaninę rozpuszczalników do komory TLC, jeśli ilość rozpuszczalnika w komorze znacznie się zmniejszy.
2. Po wyschnięciu płytek zwizualizuj pasma w świetle widzialnym lub UV i nakreśl pasma ołówkiem. Komora obserwacyjna z przenośną lampą UV jest wygodna, zwłaszcza jeśli lampa może wykrywać związki zarówno przy 254 nm (krótkofalowe UV), jak i 365 nm (długofalowe UV).
   Uwaga: W tym momencie lub po następnym kroku talerze można zawinąć w folię, przykryć folią i przechowywać w temperaturze -20 °C. Maksymalny czas przechowywania zależy od stabilności mieszanki. Ponieważ krzemionka nie jest obojętna, niektóre związki mogą ulegać degradacji na płytce TLC.
3. Sfotografuj lub narysuj płyty.
   1. Korzystaj z systemu do fotodokumentacji żelowej, jeśli jest wyposażony w górne światło UV i/lub światło widzialne.
   2. Jeśli nie jest dostępny komercyjny system dokumentacji fotograficznej, klisze fotograficzne w pudełku wyłożonym ciemnym papierem lub tkaniną, z aparatem fotograficznym ustawionym na statywie i przenośną lampą UV przymocowaną do stojaka pierścieniowego¹⁷. Podczas fotografowania klisz, które nie mają wskaźnika fluorescencyjnego, użyj filtra światła niebieskiego na obiektywie aparatu, aby poprawić wygląd pasma¹⁷.
4. Aby pomóc w scharakteryzowaniu pasm, należy obliczyć wartości współczynnika retencji (R_f), mierząc odległości przebyte przez front związku i rozpuszczalnika oraz dzieląc ten pierwszy przez drugi (rysunek 2A).

6. Hodowla i test bakteryjny

1. Przygotować i zaszczepić pożywkę w warunkach beztlenowych. Kulturą użytą w tym przypadku był szczep Clostridium sticklandii SR, który uzyskano z kolekcji kultur Jamesa B. Russella, Cornell University, Ithaca, NY.
   1. Zobacz Flythe i Kagan¹³ oraz listę materiałów, aby zapoznać się z opisem mediów HAB.
2. Rozwijaj kulturę do fazy wykładniczej lub stacjonarnej. Stosuj sterylne techniki beztlenowe podczas pracy z mikroorganizmami beztlenowymi.
3. Zaszczepić kulturę (1% v/v) w stopionym agarze po tym, jak temperatura agaru (0,75% w/v) spadnie poniżej 60 °C. Delikatnie wymieszać i natychmiast wprowadzić do komory beztlenowej (95% CO_2-5% atmosfery H₂ dla pożywek HAB) w celu nalania.
4. Wlać do plastikowych szalek Petriego o wymiarach 15 mm x 100 mm i pozostawić do zestalenia.
5. Za pomocą nożyczek pokrój płytkę TLC na strefy zawierające paski będące przedmiotem zainteresowania. Połóż banderole stroną zadrukowaną do dołu na płytkach agarowych, zaznaczając pasma na podłożu płytki, aby zachować oryginalną orientację na płytce TLC. Połóż niewykorzystany pasek TLC na płytce agarowej jako kontrolę.
6. Inkubować płytki agarowe stroną agarową do dołu w komorze beztlenowej (24 godziny, 39 °C).

7. Wizualizacja biologicznie badanych płytek agarowych

1. Za pomocą kleszczy usuń pasma z płytek agarowych, gdy znajdują się one w komorze beztlenowej.
2. Dodać kroplami 1% (w/v) czerwieni tetrazolowej, przygotowanej w wodzie, na powierzchnie płytek agarowych. Pozostawić kolor do rozwinięcia się przez co najmniej 20 minut lub do momentu, gdy płytka kontrolna zmieni kolor na całkowicie czerwony, przed wyjęciem z komory beztlenowej. Bakterie beztlenowe zaczną tracić żywotność natychmiast po wyjęciu z komory beztlenowej, ale kolor jest stabilny przez ponad 24 godziny.
3. Fotografuj w świetle widzialnym.

Wyniki

Reprezentatywne rozdziały metodą TLC na krzemionce ekstraktów z koniczyny czerwonej (Trifolium pratense cv. Kenland), zawierających związki fenolowe, przedstawiono na Ryc. 2. Rozdział ekstraktu z koniczyny czerwonej w mieszaninie octanu etylu i heksanu (9:1, v/v) na odcinku 8,5 cm doprowadził do powstania pięciu pręg, z czego jedna nie została w pełni oddzielona od linii startowej (Ryc. 2A). Jednak Ryc. 2B pokazuje, że ujawniono około dwukrotnie więcej pręg, gdy...

Dyskusja

Protokół ten opisuje prostą metodę rozdzielania ekstraktu na podzbiory związków i oznaczania tych podzbiorów za pomocą bioautografii kontaktowej. Metoda jest dość podobna do tej stosowanej przez Chomnawanga i wsp.¹⁵ do badań przesiewowych w kierunku metabolitów roślinnych hamujących bakterie wywołujące rzeżączkę. Rodzaj bioautografii zastosowanej do badań przesiewowych pod kątem przeciwdrobnoustrojowych związków roślinnych zależy od wielu czynników, w tym mikroorganizmu testowego, konfiguracji laborat...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Krzemionka F254 Płytki TLC, na podłożu aluminiowym, grubość 0,2 mm, 20 cm x 20 cm	EMD Chemicals	5554/7	Płytki te są pokryte krzemionką, która zawiera wskaźnik fluorescencyjny o długości fali 254 nm. Związki absorbujące na tej długości fali wydają się ciemne na fluorescencyjnym zielonym tle.  Alternatywne źródła to Analtech, Selecto Scientific, Fluka.  Mogą być potrzebne adsorbenty inne niż krzemionka. Płyty z plastikowym podkładem mogą być odpowiednie, w zależności od użytych rozpuszczalników.
Ostre, wytrzymałe nożyczki	dowolna firma zajmująca się materiałami do szycia	podobna do Fiskars 175800-1002	Do cięcia płyt TLC.  Można również użyć gilotyny do papieru z ostrym ostrzem.  Nie wdychać pyłu krzemionkowego.
Suszarka w temperaturze 100 & stopni; C (konwekcja mechaniczna)	Thermo Scientific	PR305225M	Quincy Lab, Inc, Chicago, IL (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com)
Komora TLC	Kimble Chase	416180-0000	Alternatywne źródła:  Aldrich. Zlewki z Pyrexu lub słoiki do wekowania mogą być używane do małych talerzy (np. 5 cm x 10 cm).  Przykryj folią aluminiową (pokrywki słoików mogą zawierać materiał ekstrahowany przez opary rozpuszczalnika).
50 &mikro; l Strzykawka z płaską końcówką igły	Hamilton	80965	Do ładowania ilości wzorca lub próbki przekraczającej 5-10 &mikro;l.  Alternatywne źródła są równoważne.
Mikropipety	Drummond	2-000-001	Do ładowania małych ilości wzorców lub próbek.  Alternatywne źródła:  VWR.  Ponadto pipety Pasteura można rozciągnąć do cieńszej średnicy za pomocą palnika butanowego.
Bibuła filtracyjna (klasa #1)	Whatman	1001 917	Służy jako komorowy.  Inne gatunki bibuły filtracyjnej są OK.  Ten rozmiar można przyciąć do komór mieszczących talerze o wymiarach 20 cm x 20 cm.
Szczypce do zlewek	Fisher Scientific	15-186	Do wkładania i wyjmowania płytek z dużej komory TLC.  Alternatywne źródła: VWR
Kleszczyki z płaską krawędzią	Fisher Scientific	10-275	Do wkładania i wyjmowania płytek z małej komory. Alternatywne źródła: VWR
Mała przenośna lampa UV z żarówkami o mocy 4 W lub 6 W do oświetlenia światłem UV na krótko- i długofalowe (odpowiednio 254 i 365 nm)	Produkty ultrafioletowe	95-0271-01	Alternatywne źródła: Spectronics Corporation (www.spectroline.net)
Szafka obserwacyjna do użytku z ręczną lampą UV	Produkty ultrafioletowe	Chromato-Vue C-10E	Pasma aktywne UV są łatwiej zakreślane, jeśli można w tym miejscu ustawić płytki.  Alternatywne źródła: Spectronics Corporation.
System dokumentacji fotograficznej z górną lampą UV i lampą widzialną	Kodak	Gel Logic 200	Alternatywne źródła: Produkty ultrafioletowe (www.uvp.com).  Zobacz protokół dla domowej alternatywy.
Komora beztlenowa, typ A, winylowa	Coy	7150000	Ta komora jest odpowiednia dla bakterii beztlenowych, takich jak Clostridium sticklandii, zgodnie z opisem. Jednak warunki wzrostu muszą być dostosowane do organizmu użytego w teście. W przypadku stosowania organizmów chorobotwórczych należy założyć komorę bezpieczeństwa biologicznego i zastosować inne środki ostrożności. Alternatywne źródła: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, inne
Tetrazolium red	Sigma-Aldrich	T8877	Alternatywne źródła: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar
Składniki dla podłoża HAB
Piridoxamine · 2HCl	Sigma-Aldrich	P9380	Dla tego i dla wszystkich innych odczynników w tej tabeli, alternatywne źródła są równoważne.
Ryboflawina	Sigma-Aldrich	R4500
Tiamina HCl	Sigma-Aldrich	T3902
Nikotynamid	Sigma-Aldrich	N3376
D-Pantotenian wapnia	Sigma-Aldrich	C8731
Kwas liponowy	Sigma-Aldrich	T5625
Kwas p-aminobenzoesowy	Sigma-Aldrich	A9878
Kwas foliowy	Sigma-Aldrich	F8798
Biotyna	Sigma-Aldrich	B4639
Kobalamina	Sigma-Aldrich	C3607
Pyridoxal HCl	Sigma-Aldrich	P9130
Pirydoksyna	Sigma-Aldrich	P5669
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758
Siarczan żelaza · 7H2O	Sigma-Aldrich	F8263
Siarczan · 7H2O	Sigma-Aldrich	Z0251
Chlorek manganu · 4H2O	Sigma-Aldrich	M8054
Kwas borowy	Sigma-Aldrich	B6768
Chlorek kobaltu · 6H2O	Sigma-Aldrich	C8661
Chlorek miedzi · 2H2O	Sigma-Aldrich
Chlorek niklu · 6H2O	Sigma-Aldrich	203866
Molibdenian sodu · 2H2O	Sigma-Aldrich	331058
Tryptikaza (trawienie kazeiny przez trzustkę)	Thermo Fisher	B11921
Fosforan potasu jednozasadowy bezwodny	Thermo Fisher	P284
Węglan sodu i middot; H2O	Thermo Fisher	S636
Agar	Thermo Fisher	50841063
Siarczan magnezu · 6H2O	Thermo Fisher	7791-18-6
Chlorek wapnia · 2H2O	Thermo Fisher	BP510
Cysteina HCl	Thermo Fisher	19464780
Potas fosforan dwuzasadowy bezwodny	Thermo Fisher	P290
Chlorek sodu	Thermo Fisher	BP358