Method Article

Proteomika ilościowa wykorzystująca dimetylację redukcyjną do znakowania stabilnych izotopów

DOI:

10.3791/51416

⸱

July 1st, 2014

 , 
1CEA, DSV, IG, Genoscope, 2CNRS-UMR8030, Évry, France, 3Université d'Évry Val d'Essonne, 4Massachusetts General Hospital Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Znakowanie stabilnych izotopów peptydów metodą redukcyjnej dimetylacji (znakowanie ReDi) to szybka, tania strategia dla dokładnej proteomiki ilościowej opartej na spektrometrii mas. W tym miejscu demonstrujemy solidną metodę przygotowania i analizy mieszanin białkowych przy użyciu podejścia ReDi, którą można zastosować do prawie każdego rodzaju próbki.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Znakowanie stabilnych izotopów peptydów metodą redukcyjnej dimetylacji (znakowanie ReDi) to metoda dokładnego ilościowego określania różnic ekspresji białek między próbkami za pomocą spektrometrii mas. Znakowanie ReDi wykonuje się przy użyciu zwykłych (lekkich) lub deuterowanych (ciężkich) form formaldehydu i cyjanoborowodorku sodu w celu dodania dwóch grup metylowych do każdej wolnej aminy. W tym miejscu demonstrujemy solidny protokół znakowania ReDi i ilościowego porównania złożonych mieszanin białkowych. Próbki białek do porównania są trawione do peptydów, znakowane w celu przenoszenia lekkich lub ciężkich znaczników metylowych, mieszane i współanalizowane przez LC-MS / MS. Względną obfitość białek określa się ilościowo poprzez porównanie obszarów pików chromatogramu jonowego ciężkich i lekkich znakowanych wersji peptydu składowego wyekstrahowanego z pełnego widma MS. Opisana tutaj metoda obejmuje przygotowanie próbki przez ekstrakcję do fazy stałej w odwróconej fazie, znakowanie peptydów ReDi na kolumnie, frakcjonowanie peptydów za pomocą podstawowej chromatografii pH z odwróconymi fazami (BPRP) oraz oczyszczanie peptydów StageTip. Omawiamy zalety i ograniczenia znakowania ReDi w odniesieniu do innych metod indukcji stabilnych izotopów. Zwracamy uwagę na nowatorskie zastosowania wykorzystujące znakowanie ReDi jako szybką, niedrogą i dokładną metodę porównywania obfitości białek w prawie każdym typie próbki.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomiar różnic w stężeniach wielu białek między złożonymi próbkami jest głównym wyzwaniem w proteomice. Coraz częściej odbywa się to poprzez znakowanie białek w każdej próbce różnymi znacznikami izotopowymi, łączenie próbek i stosowanie spektrometrii mas do ilościowego określania różnic stężeń. Istnieje kilka metod stabilnego znakowania izotopowego białek i peptydów. 15Znakowanie N1 i SILAC2 wprowadzają znaczniki izotopowe metabolicznie in vivo, podczas gdy iCAT3, iTRAQ4 i dimetylacja redukcyjna5 dodają stabilne znaczniki izotopowe po ekstrakcji i trawieniu białka. Wśród tych metod dimetylacja r....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Ta metoda została wcześniej opisana12.

1. Izolacja białka

Przygotuj 1 mg białka komórkowego przez lizę komórek, najlepiej metodami fizycznymi, takimi jak prasa francuska, ubijanie koralików lub sonikacja. Unikaj lizy komórek za pośrednictwem lizozymu, ponieważ enzym zakłóci pomiary spektrometrii mas.

2. Wytrącanie białek TCA

Dodaj 1 objętość kwasu trichlorooctowego (TCA) do 4 objętości białka i schładzaj na lodzie przez 10 minut, aby wytrącić białka. Wirować przy 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. Zawiesić osad w....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oceniliśmy dokładność, precyzję i powtarzalność znakowania ReDi za pomocą lizatów całych komórek Saccharomyces cerevisiae i Clostridium phytofermentans. Najpierw określiliśmy ilościowo skuteczność znakowania ReDi mieszanki lizatów białkowych C. phytofermentans z kultur celulozy (znakowanej ciężko, H) i glukozy (znakowana światłem, L). Po przefiltrowaniu do 1% współczynnika fałszywego wykrywania peptydów, próbka ta zawierała 11 194 unikalne sekwencje peptydowe z 98% skutecznością znakowania ReDi.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kilka punktów sprawia, że znakowanie stabilnymi izotopami peptydów za pomocą redukcyjnej dimetylacji (znakowanie ReDi) jest atrakcyjną metodą dla proteomiki ilościowej: niedrogie odczynniki do znakowania (odczynniki kosztują mniej niż 1 USD za próbkę), szybka szybkość reakcji (~ 10 min), brak produktów ubocznych, wysoka odtwarzalność (ryc. 3, 4), stabilne produkty reakcji, możliwość użycia dowolnej proteazy i wysoka skuteczność jonizacji znakowanych peptydów. Znakowanie chemiczne za pomocą ReDi jest równ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych lub innych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy SP Gygi i GM Church za pomoc i wskazówki. Prace te były wspierane przez przewodniczącego doskonałości CNRS przy ACT.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kwas trichlorooctowyWytrącanie białkaSigma-AldrichT9159
AcetonWytrącanie białkaSigma-Aldrich650501
Dodecylosiarczan soduSigma-Aldrich71736denaturacja, redukcja białka
Wodorotlenek soduSigma-AldrichS8045denaturacja, redukcja białka
DL-DitiothreitolSigma-Aldrich43816denaturacja, redukcja, białko alkilatowe
Inhibitor proteazy Complete Mini CocktailRoche4693124001denaturacji, redukcji białka
JodoacetamidSigma-AldrichI6125białko alkilatowe
HEPESSigma-AldrichH7523resuspens, ekstrakt, etykieta białko
Chlorek wapniaSigma-AldrichC5670Ponowne zaparowanie białka
Lysyl EndoproteazaWako Chemicals129-02541trawienie białek
Sekwencjonowanie klasy trypsynyTrawienie białekPromegaV5111
Kwas octowySigma-Aldrich320099trawienie białek
Kwas trifluorooctowySigma-Aldrich299537Ekstrakcja peptydów w odwróconej fazie
tC18 Sep-Pak Wkłady C18WodyWAT054960Ekstrakcja peptydów w odwróconej fazie
Kolektor ekstrakcyjnyWodyWAT200609Ekstrakcja peptydów w odwróconej fazie
AcetonitrylSigma-Aldrich14261różne
FormaldehydSigma-Aldrich252549" światło" znakowanie peptydów
CyjanoborowodorekSigma-Aldrich71435" światło" etykietowanie peptydów
Deuterowany formaldehydSigma-Aldrich492620" ciężki" znakowanie peptydów
Izotopy CDNcyjanoborodeuterku soduD-1797" ciężki" znakowanie peptydów
MESSigma-AldrichM3671znakowanie peptydów
kolumna C18-HPLC (4,6 x 250 mm, 5 &mikro; m wielkość cząstek)Agilent770450-902zasadowa chromatografia odwróconych faz pH
Kwas mrówkowySigma-Aldrich399388różne
dyski C18 Empore 3M14-386-3 Wskazówki dotyczące STAGE
MetanolSigma-Aldrich494437STAGE wskazówki

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Washburn, M. P., Ulaszek, R., Deciu, C., Schieltz, D. M., Yates III, J. R. Analysis of quantitative proteomic data generated via multidimensional protein identification technology. Analytical chemistry. 74 (7), 1650-1657 (2002).
  2. Ong, S. -E., Blagoev, B., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Reductive DimethylationStable Isotope LabelingQuantitative ProteomicsPeptide FractionationLC MS MS AnalysisSolid Phase ExtractionBasic pH Reversed Phase ChromatographyStageTip PurificationMass Spectrometry QuantificationProtein Abundance Comparison

Related Articles