Proteomika ilościowa wykorzystująca dimetylację redukcyjną do znakowania stabilnych izotopów

Summary

Znakowanie stabilnych izotopów peptydów metodą redukcyjnej dimetylacji (znakowanie ReDi) to szybka, tania strategia dla dokładnej proteomiki ilościowej opartej na spektrometrii mas. W tym miejscu demonstrujemy solidną metodę przygotowania i analizy mieszanin białkowych przy użyciu podejścia ReDi, którą można zastosować do prawie każdego rodzaju próbki.

Abstract

Znakowanie stabilnych izotopów peptydów metodą redukcyjnej dimetylacji (znakowanie ReDi) to metoda dokładnego ilościowego określania różnic ekspresji białek między próbkami za pomocą spektrometrii mas. Znakowanie ReDi wykonuje się przy użyciu zwykłych (lekkich) lub deuterowanych (ciężkich) form formaldehydu i cyjanoborowodorku sodu w celu dodania dwóch grup metylowych do każdej wolnej aminy. W tym miejscu demonstrujemy solidny protokół znakowania ReDi i ilościowego porównania złożonych mieszanin białkowych. Próbki białek do porównania są trawione do peptydów, znakowane w celu przenoszenia lekkich lub ciężkich znaczników metylowych, mieszane i współanalizowane przez LC-MS / MS. Względną obfitość białek określa się ilościowo poprzez porównanie obszarów pików chromatogramu jonowego ciężkich i lekkich znakowanych wersji peptydu składowego wyekstrahowanego z pełnego widma MS. Opisana tutaj metoda obejmuje przygotowanie próbki przez ekstrakcję do fazy stałej w odwróconej fazie, znakowanie peptydów ReDi na kolumnie, frakcjonowanie peptydów za pomocą podstawowej chromatografii pH z odwróconymi fazami (BPRP) oraz oczyszczanie peptydów StageTip. Omawiamy zalety i ograniczenia znakowania ReDi w odniesieniu do innych metod indukcji stabilnych izotopów. Zwracamy uwagę na nowatorskie zastosowania wykorzystujące znakowanie ReDi jako szybką, niedrogą i dokładną metodę porównywania obfitości białek w prawie każdym typie próbki.

Introduction

Pomiar różnic w stężeniach wielu białek między złożonymi próbkami jest głównym wyzwaniem w proteomice. Coraz częściej odbywa się to poprzez znakowanie białek w każdej próbce różnymi znacznikami izotopowymi, łączenie próbek i stosowanie spektrometrii mas do ilościowego określania różnic stężeń. Istnieje kilka metod stabilnego znakowania izotopowego białek i peptydów. ¹⁵Znakowanie N¹ i SILAC² wprowadzają znaczniki izotopowe metabolicznie in vivo, podczas gdy iCAT³, iTRAQ⁴ i dimetylacja redukcyjna⁵ dodają stabilne znaczniki izotopowe po ekstrakcji i trawieniu białka. Wśród tych metod dimetylacja redukcyjna (znakowanie ReDi) zyskuje na popularności jako niedroga, powtarzalna metoda ilościowego określania różnic w stężeniach białek w prawie każdym typie próbki.

Etykietowanie ReDi polega na reakcji peptydów z formaldehydem w celu utworzenia zasady Schiffa, która jest następnie redukowana przez cyjanoborowodorek. Ta reakcja dimetylanuje wolne grupy aminowe na N-końcach i łańcuchach bocznych lizyny oraz monometyluje N-końcowe proliny. Opisany tutaj protokół metyluje peptydy w próbce 1 z "lekkim" znacznikiem przy użyciu odczynników z atomami wodoru w ich naturalnym rozkładzie izotopowym oraz w próbce 2 z "ciężkim" znacznikiem przy użyciu deuterowanego formaldehydu i cyjanoborowodorku (rysunek 1). Każda dimetyloowana grupa aminowa na peptydzie powoduje różnicę masy wynoszącą 6,0377 Da między formami lekkimi i ciężkimi, która jest wykorzystywana do rozróżnienia tych dwóch form za pomocą spektrometru masowego. W szczególności względna obfitość peptydów jest określana ilościowo jako stosunek obszarów chromatogramu jonowego wyekstrahowanych MS1 (stosunek powierzchni piku MS1) wersji lekkiej i ciężkiej dla każdej pary jonów peptydowych. Względną obfitość białka oblicza się jako średni stosunek powierzchni piku MS1 między wszystkimi peptydami w białku. W tym raporcie opisujemy solidny protokół przeprowadzania eksperymentów znakowania ReDi za pomocą LC-MS/MS, który obejmuje ekstrakcję peptydów w fazie stałej w odwróconej fazie, znakowanie ReDi na kolumnie, frakcjonowanie peptydów za pomocą podstawowej chromatografii pH z odwróconymi fazami (BPRP) oraz oczyszczanie mieszanin peptydów za pomocą StageTips (Rysunek 2). Omawiamy zalety i ograniczenia stosowania znakowania ReDi w proteomice ilościowej.

Protocol

UWAGA: Ta metoda została wcześniej opisana¹².

1. Izolacja białka

Przygotuj 1 mg białka komórkowego przez lizę komórek, najlepiej metodami fizycznymi, takimi jak prasa francuska, ubijanie koralików lub sonikacja. Unikaj lizy komórek za pośrednictwem lizozymu, ponieważ enzym zakłóci pomiary spektrometrii mas.

2. Wytrącanie białek TCA

Dodaj 1 objętość kwasu trichlorooctowego (TCA) do 4 objętości białka i schładzaj na lodzie przez 10 minut, aby wytrącić białka. Wirować przy 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. Zawiesić osad w 1 ml lodowatego acetonu i odwirować przy 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i odwrócić probówkę na stole, aby wysuszyć osad przez 15 minut. Przechowywać granulki białka w temperaturze -80 °C.

3. Denaturyzacja białek i redukcja wiązań dwusiarczkowych

Zawieś białka do ~2 mg/ml w 500 μl buforu denaturacyjnego i redukcyjnego (albo 4 M mocznik lub 3% SDS w 50 mM HEPES pH 8,5, 5 mM DTT). Opcjonalnie należy włączyć inhibitor proteazy do buforu. Inkubować białka przez 30 minut w temperaturze 56 °C, a następnie przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

4. Aklylate Free Sulfhydryl Groups Nieodwracalnie Zakłócają Tworzenie Wiązań Dwusiarczkowych

Przygotuj świeży 0,3 M jodoacetamid w wodzie. OSTROŻNOŚĆ! Jodoacetamid jest wysoce toksyczny. Dodać 25 μl 0,3 M jodoacetamidu (15 mM stężenie końcowe) do 500 μl białka i inkubować przez 20 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Ugasić jodoacetamid, dodając 10 μl 300 mM DTT (5 mM końcowe stężenie DTT). Białka alkilowane należy przechowywać w temperaturze -80 °C.

5. Trawienie białek

TCA wytrącić białka (jak opisano w kroku 2) i ponownie zawiesić w 1 ml 50 mM HEPES (pH 8.2), 1 M mocznik. Przygotować roztwór podstawowy endoproteinazy lizylowej (Lys-C) w wodzie o stężeniu 2 μg/μl i dodać 5 μl do roztworu białkowego. Inkubować mieszaninę przez 16 godzin w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że końcowe stężenie Lys-C wynosi 10 ng/μl, a stosunek białka do LysC (w/w) wynosi 1/50 do 1/200. Zawiesić 20 μg trypsyny do sekwencjonowania w 40 μl 50 mM kwasu octowego, dodać 5 μl (10 μg trypsyny) do roztworu Lys-C i inkubować przez 6 godzin w temperaturze 37 °C. Dla Lys-C należy stosować takie same stężenie proteazy i proporcje proteazy do białka, jak w przypadku trypsyny.

6. Ekstrakcja peptydów w odwróconej fazie

1. Zakwaszać peptydy przez dodanie kwasu trifluorooctowego (TFA) do końcowego stężenia 0,5% (pH≈2). Podłącz kolumnę C18 do kolektora wyciągowego. Stosować najwyższe możliwe natężenie przepływu na wszystkich etapach z wyjątkiem ładowania i elucji peptydów.
2. Mokra kolumna z 6 ml acetonitrylu (ACN). Przemyć kolumnę 6 ml 80% ACN, 0,1% TFA, a następnie zrównoważyć 6 ml 0,1% TFA. Nie pozwól, aby kolumna wyschła między stopniami.
3. Zatrzymać podciśnienie i załadować 500 μg peptydów do kolumny o natężeniu przepływu około 1 ml/min. Gdy peptydy zwiążą się z kolumną, ponownie odkurzyć i przemyć 6 ml 0,1% TFA, a następnie 3 ml buforu kwasu cytrynowego (0,09 M kwasu cytrynowego, 0,23 M Na₂HPO₄, pH 5,5).
   Uwaga: Większe ilości peptydów można oznaczyć, ale zdolność wiązania kolumny C18 powinna być co najmniej dwukrotnie wyższa niż ilość peptydu, aby uniknąć utraty próbki.

7. Etykietowanie peptydów na kolumnie metodą redukcyjnej dimetylacji (etykietowanie ReDi)

Wykonaj ten krok pod chemicznym kapturem, ponieważ cyjanowodór jest uwalniany w niskim stężeniu podczas procesu etykietowania.

1. Przygotuj 12 ml "lekkich" i "ciężkich" ReDi do metylacji amin wolnych od peptydów. Lekki bufor ReDi składa się z 0,8% formaldehydu i 0,12 M cyjanoborowodorku sodu przenoszącego wodór w ich naturalnym rozkładzie izotopowym w buforze kwasu cytrynowego. Ciężki bufor ReDi składa się z 0,8% deuterowanego formaldehydu i 0,12 M deuterowanego cyjanoborowodorku sodu w buforze kwasu cytrynowego.
2. Inkubować kolumnę zawierającą peptydy, dodając 10 ml lekkiego lub ciężkiego buforu ReDi do kolumn zawierających peptydy z szybkością przepływu 1 ml/min i powtórzyć czynność w celu zapewnienia pełnego oznakowania. Przepłukać kolumnę 6 ml 0,1% TFA, a następnie 1 ml 0,5% kwasu octowego.
3. Zatrzymaj próżnię i wymyj znakowane peptydy najpierw 1 ml 40% ACN, 0,5% kwasu octowego, a następnie 1 ml 80% ACN, 0,5% kwasu octowego, stosując natężenie przepływu około 0,5 ml/min. W razie potrzeby należy zmierzyć skuteczność etykietowania poszczególnych próbek za pomocą spektrometrii mas przed zmieszaniem ciężkich i lekkich próbek (patrz "Reprezentatywne wyniki"). Zmieszać ciężkie i znakowane światłem próbki peptydów w stosunku 1:1 w celu ilościowego określenia za pomocą spektrometrii mas.

8. Oddzielna mieszanina peptydów metodą chromatografii podstawowej fazy odwróconej pH (BPRP)

Podstawowa chromatografia odwróconej fazy pH (BPRP) w celu rozdzielenia mieszaniny peptydów na wiele frakcji, które są niezależnie analizowane przez LC-MS/MS w celu zwiększenia pokrycia proteomu.

1. Frakcjonować mieszaninę peptydów na kolumnie C18-HPLC, stosując gradient rosnącego stężenia ACN w 10 mM wodorowęglanie amonu (pH 8). Zacznij od 5% (v/v) ACN przez 5 minut, zwiększ do 35% ACN w 60 minut, a następnie do 90% ACN w 1 minutę. Utrzymuj 90% ACN przez 4 minuty, a następnie zmniejsz ACN do 5%, aby ponownie wyrównać kolumnę przez 9 minut. Zbierz 96 frakcji o równej objętości na 96-dołkowej płytce (od A1 do H12). Monitoruj frakcjonowanie za pomocą detektora UV przy 220 nm, podczas gdy peptydy uwalniają się z kolumny (10-70 minut dla opisanych tutaj warunków).
2. Połącz frakcje z dołków A1, C1, E1 i G1 (frakcja A1), z dołków B1, D1, F1 i H1 (frakcja B1), z dołków A2, C2, E2 i G2 (frakcja A2) i odpowiednio dla pozostałych frakcji. Usunąć rozpuszczalnik za pomocą wirówki próżniowej. Ponownie zawiesić peptydy z frakcji A1, B2, A3, B4, A5, B6, A7, B8, A9, B10, A11 i B12 w 130 μl 1 M mocznika/0,5% TFA i oczyścić za pomocą StageTips zgodnie z opisem w kroku 9. Przechowuj frakcje B1, A2, B3, A4, B5, A6, B7, A8, B9, A10, B11 i A12 w temperaturze -20 ºC.

9. Oczyszczanie peptydów metodą ekstrakcji STop i Go (StageTips)

Przygotuj mikrokolumny C18-StageTip⁷, pakując 200 μl końcówek do pipet z dwoma krążkami C18 o średnicy wewnętrznej (ID) 1,07 mm. Umieść końcówki Stage w probówkach Eppendorf. Za pomocą mikrowirówki umyj końcówki 130 μl metanolu, a następnie 130 ul 80% ACN, 0,5% kwasu octowego. Zrównoważ StageTips za pomocą 130 μl 0,1% TFA. Przenieś mieszaninę peptydów do StageTips i przemyj 130 μl 0,1% TFA, następnie 40 μl 0,1% TFA, a następnie 40 μl 0,5% kwasu octowego. Peptydy elute najpierw zawierają 20 μl 40% ACN, 0,5% kwasu octowego, a następnie 20 μl 80% ACN, 0,5% kwasu octowego. Połączyć eluaty i wysuszyć przez filtrację próżniową.

10. Mikrokapilar LC-MS/MS

1. Rozpuścić peptydy w 1-5 μl 5% kwasu mrówkowego, 5% ACN do stężenia około 1 μg/μl. Rozpuścić peptydy ~1 μg na kolumnie HPLC o odwróconej fazie 100 μm × 20 cm z gradientem 6-22% ACN w 0,125% kwasie mrówkowym podawanym przez 75 lub 100 minut przy natężeniu przepływu ~300 nl/min.
2. Identyfikuj peptydy za pomocą LTQ Orbitrap Velos¹² lub podobnej platformy do chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas ze spektrometrem masowym zapewniającym wysoką rozdzielczość i dokładność masy. Eksploatuj spektrometr masowy w trybie zależnym od danych z pełnym skanem MS (rozdzielczość 60 000) uzyskanym w analizatorze Orbitrap. Wygeneruj liniowe widma pułapek jonowych MS/MS dla 20 najliczniej występujących jonów wykrytych w pełnym spektrum MS. Ustaw cele automatycznej kontroli wzmocnienia (AGC) na 1 x 10⁶ dla pełnego MS i 2,000 dla MS/MS. Ustaw maksymalne czasy akumulacji jonów na 1,000 ms dla MS i 150 ms dla MS/MS. Wyklucz rozdrobnione jony prekursorowe peptydów z dalszej selekcji z MS/MS na 20–60 sek.

11. Akwizycja danych MS/MS

Zidentyfikuj peptydy, porównując pliki RAW widm MS/MS z teoretyczną bazą danych za pomocą algorytmu takiego jak SEQUEST⁸ przy użyciu tych parametrów (Tabela 1).

Tabela 1. Parametry wyszukiwania w bazie danych peptydów.

Parametry ogólne	w pełni tryptyczne trawienie z maksymalnie 2 pominiętymi cięciami
	Tolerancja jonów prekursorowych 25 ppm
	Tolerancja jonów fragmentacyjnych 1,0 Da
Modyfikacje statyczne	+57.02146 Da na cysteinie, karboksyamidometylacji
	+28.03130 Da na lizynie i N-końcu peptydu, znacznik lekkiej dimetylacji
Dynamiczne modyfikacje	+15.99491 Da na metioninie, utlenianie
	+6,03766 Da na lizynie i N-końcu peptydu, etykieta ciężkiej dimetylacji

1. Filtruj peptydy do 1% wskaźnika fałszywych odkryć za pomocą metody takiej jak strategia celu-wabika⁹, korzystając z bazy danych otwartych ramek odczytu w orientacji rzeczywistej i odwróconej.

12. Kwantyfikacja peptydów

Oblicz obszary ciężkich i lekkich par chromatogramów jonowych ekstrahowanych MS1 (obszary pików MS1) i stosunek sygnału do szumu peptydów (S/N)¹⁰. Uwzględnij pary peptydów tylko wtedy, gdy ich średni stosunek sygnału do szumu wynosi powyżej pięciu. Określ ilościowo względną obfitość peptydu w dwóch próbkach jako stosunek powierzchni pików MS1 ciężkich i lekkich wersji tego samego peptydu (stosunek powierzchni piku MS1). Oblicz względną obfitość białka jako medianę stosunku powierzchni piku MS1 dla wszystkich peptydów w białku.

Results

Oceniliśmy dokładność, precyzję i powtarzalność znakowania ReDi za pomocą lizatów całych komórek Saccharomyces cerevisiae i Clostridium phytofermentans. Najpierw określiliśmy ilościowo skuteczność znakowania ReDi mieszanki lizatów białkowych C. phytofermentans z kultur celulozy (znakowanej ciężko, H) i glukozy (znakowana światłem, L). Po przefiltrowaniu do 1% współczynnika fałszywego wykrywania peptydów, próbka ta zawierała 11 194 unikalne sekwencje peptydowe z 98% skutecznością znakowania ReDi...

Discussion

Kilka punktów sprawia, że znakowanie stabilnymi izotopami peptydów za pomocą redukcyjnej dimetylacji (znakowanie ReDi) jest atrakcyjną metodą dla proteomiki ilościowej: niedrogie odczynniki do znakowania (odczynniki kosztują mniej niż 1 USD za próbkę), szybka szybkość reakcji (~ 10 min), brak produktów ubocznych, wysoka odtwarzalność (ryc. 3, 4), stabilne produkty reakcji, możliwość użycia dowolnej proteazy i wysoka skuteczność jonizacji znakowanych peptydów. Znakowanie chemiczne za pomocą ReDi jest równ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kwas trichlorooctowy	Wytrącanie białka	Sigma-Aldrich	T9159
Aceton	Wytrącanie białka	Sigma-Aldrich	650501
Dodecylosiarczan sodu	Sigma-Aldrich	71736	denaturacja, redukcja białka
Wodorotlenek sodu	Sigma-Aldrich	S8045	denaturacja, redukcja białka
DL-Ditiothreitol	Sigma-Aldrich	43816	denaturacja, redukcja, białko alkilatowe
Inhibitor proteazy Complete Mini Cocktail	Roche	4693124001	denaturacji, redukcji białka
Jodoacetamid	Sigma-Aldrich	I6125	białko alkilatowe
HEPES	Sigma-Aldrich	H7523	resuspens, ekstrakt, etykieta białko
Chlorek wapnia	Sigma-Aldrich	C5670	Ponowne zaparowanie białka
Lysyl Endoproteaza	Wako Chemicals	129-02541	trawienie białek
Sekwencjonowanie klasy trypsyny	Trawienie białek	Promega	V5111
Kwas octowy	Sigma-Aldrich	320099	trawienie białek
Kwas trifluorooctowy	Sigma-Aldrich	299537	Ekstrakcja peptydów w odwróconej fazie
tC18 Sep-Pak Wkłady C18	Wody	WAT054960	Ekstrakcja peptydów w odwróconej fazie
Kolektor ekstrakcyjny	Wody	WAT200609	Ekstrakcja peptydów w odwróconej fazie
Acetonitryl	Sigma-Aldrich	14261	różne
Formaldehyd	Sigma-Aldrich	252549	" światło" znakowanie peptydów
Cyjanoborowodorek	Sigma-Aldrich	71435	" światło" etykietowanie peptydów
Deuterowany formaldehyd	Sigma-Aldrich	492620	" ciężki" znakowanie peptydów
Izotopy CDN	cyjanoborodeuterku sodu	D-1797	" ciężki" znakowanie peptydów
MES	Sigma-Aldrich	M3671	znakowanie peptydów
kolumna C18-HPLC (4,6 x 250 mm, 5 &mikro; m wielkość cząstek)	Agilent	770450-902	zasadowa chromatografia odwróconych faz pH
Kwas mrówkowy	Sigma-Aldrich	399388	różne
dyski C18 Empore 3M		14-386-3	Wskazówki dotyczące STAGE
Metanol	Sigma-Aldrich	494437	STAGE wskazówki