Artykuł metodologiczny

Izolacja oznaczonych jąder z tkanek Drosophila w oparciu o powinowactwo do analizy ekspresji genów

DOI:

10.3791/51418

⸱

25 marca 2014

 , 
1Department of Biochemistry, Purdue University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tkanki Drosophila często zawierają niejednorodną mieszaninę typów komórek. Aby zbadać ekspresję genów w określonych typach komórek z danej tkanki, jądra mogą być genetycznie znakowane, a następnie izolowane przy użyciu podejścia opartego na powinowactwie. Wyizolowane jądra mogą być wykorzystywane do dalszych zastosowań, takich jak analiza ekspresji genów i immunoprecypitacja chromatyny.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tkanki embrionalne i larwalne Drosophila melanogaster często zawierają wysoce niejednorodną mieszaninę typów komórek, co może komplikować analizę ekspresji genów w tych tkankach. W związku z tym, aby przeanalizować specyficzne dla komórki profile ekspresji genów z tkanek Drosophila, może być konieczne wyizolowanie określonych typów komórek o wysokiej czystości i wystarczającej wydajności do dalszych zastosowań, takich jak profilowanie transkrypcji i immunoprecypitacja chromatyny. Jednak nieregularna morfologia komórkowa w tkankach takich jak ośrodkowy układ nerwowy, w połączeniu z rzadką populacją określonych typów komórek w tych tkankach, może stanowić wyzwanie dla tradycyjnych metod izolacji komórek, takich jak mikrodysekcja laserowa i sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS). W tym miejscu opisano alternatywne podejście do charakteryzowania specyficznych dla komórki profili ekspresji genów przy użyciu izolacji znakowanych jąder opartych na powinowactwie, a nie całych komórek. Jądra w określonym typie komórki będącym przedmiotem zainteresowania są genetycznie znakowane znacznikiem EGFP zlokalizowanym w otoczce jądrowej przy użyciu binarnego systemu ekspresji Gal4 / UAS. Te jądra znakowane EGFP można wyizolować za pomocą przeciwciał przeciwko GFP, które są sprzężone z kulkami magnetycznymi. Podejście opisane w tym protokole umożliwia konsekwentną izolację jąder z określonych typów komórek w ośrodkowym układzie nerwowym larw Drosophila przy wysokiej czystości i na poziomach wystarczających do analizy ekspresji, nawet jeśli te typy komórek stanowią mniej niż 2% całkowitej populacji komórek w tkance. Podejście to może być stosowane do izolowania jąder z szerokiej gamy typów komórek embrionalnych i larwalnych Drosophila przy użyciu specyficznych sterowników Gal4 i może być przydatne do izolowania jąder od typów komórek, które nie nadają się do FACS lub mikrodysekcji laserowej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tkanki Drosophila, takie jak centralny układ nerwowy, zawierają złożoną mieszaninę typów komórek. W związku z tym, aby przeanalizować specyficzne dla komórki profile ekspresji genów z tkanek Drosophila, konieczne jest najpierw wyizolowanie jednorodnej populacji określonych komórek w ilościach wystarczających do dalszych zastosowań. Metody izolowania komórek z nienaruszonych tkanek obejmują mikrodysekcję laserową i sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) całych komórek. Podczas gdy FACS był używany do izolowania komórek i jąder z zarodków Drosophila i z Caenorhabditis elegans w celu ekspresji genów i profilowania chromatyny1-3, FACS i mikrodysekcja laserowa mogą być trudne do skutecznego przeprowadzenia w tkankach zawierających wysoce wymieszane typy komórek lub zawierające komórki o nieregularnej morfologii, takie jak neurony. Aby przezwyciężyć tę trudność, z określonych typów komórek można wyizolować jądra, a nie komórki, i wykorzystać je do późniejszego profilowania ekspresji genów. Co ważne, analiza ekspresji mRNA w oparciu o mikromacierze przy użyciu próbek jądrowego RNA daje na ogół porównywalne wyniki z tą wykonaną przy użyciu całkowitego RNA 4,5. Co więcej, analiza ekspresji genów przy użyciu jądrowego RNA została z powodzeniem wykorzystana do badania ekspresji genów w wielu organizmach, w tym C. elegans, Arabidopsis thaliana, Drosophila i ludziach 4,5 2,3.

Ostatnio opisano kilka podejść do izolacji określonych populacji znakowanych jąder z tkanek Drosophila, które są odpowiednie do analizy ekspresji genów i/lub immunoprecypitacji chromatyny. Metoda wsadowej izolacji swoistej tkankowo chromatyny do immunoprecypitacji (BiTS-ChIP) wykorzystuje FACS do izolowania utrwalonych jąder na podstawie specyficznej dla typu komórki ekspresji zlokalizowanego jądrowo GFP2. Podejście to zostało z powodzeniem wykorzystane do analizy rozkładu modyfikacji histonów i czynników transkrypcyjnych za pomocą immunoprecypitacji chromatyny izolowanych jąder z mezodermy zarodków Drosophila 2. Jednak podejścia oparte na FACS mogą być mniej odpowiednie do izolowania znakowanych jąder, które stanowią tylko niewielką część populacji mieszanej, ze względu na wydłużony czas sortowania potrzebny do uzyskania odpowiednich liczb do dalszych zastosowań. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, kilka grup wykorzystało techniki izolacji oparte na powinowactwie do oczyszczania jąder, które są oznaczone określonym epitopem w określonym typie komórki. Metoda izolacji jąder znakowanych w określonych typach komórek (INTACT) opracowana do stosowania u Arabidopsis thaliana 6,7 została niedawno zaadaptowana do stosowania u Drosophila8. W tej metodzie białko fuzyjne otoczki jądrowej, które jest substratem do biotynylacji in vivo, ulega koekspresji z ligazą biotyny Escherichia coli BirA w określonych typach komórek. Jądra znakowane biotyną można następnie oczyścić z mieszanych populacji za pomocą izolacji powinowactwa opartej na streptawidynie. Korzystając z tego podejścia, jądra zostały z powodzeniem znakowane i wyizolowane z mezodermy zarodków Drosophila, w których białko fuzyjne otoczki jądrowej uległo ekspresji pod kontrolą wzmacniacza specyficznego dla mezodermy8. Autorzy stworzyli również białka fuzyjne otoczki jądrowej, które mogą ulegać ekspresji w dowolnym typie komórki pod kontrolą sekwencji regulatorowej Gal4, UAS9. Podejście to jest w stanie szybko wyizolować podzbiory znakowanych jąder z mieszanych populacji, ale wymaga trzech oddzielnych konstruktów transgenicznych i dlatego może być nieodpowiednie do określonych zastosowań genetycznych. Ostatnio opisano podejście, w którym białka zawierające domenę SUN (Sad1 i UNC-84), które lokalizują się w wewnętrznej błonie otoczki jądrowej, zostały oznaczone białkami fluorescencyjnymi i uległy ekspresji pod kontrolą systemu Gal4/UAS10. Jądra wyizolowano w obecności niejonowego detergentu w celu usunięcia zewnętrznej błony otoczki jądrowej i oczyszczono pod względem powinowactwa za pomocą kulek magnetycznych sprzężonych z przeciwciałami anty-GFP. Podejście to zostało z powodzeniem wykorzystane do wyizolowania małych populacji znakowanych jąder od określonych podtypów neuronalnych w dorosłym mózgu Drosophila10.

Tutaj opisany jest protokół izolacji oznaczonych jąder z mieszanej populacji komórek z tkanki larwalnej Drosophila. Metoda ta została opracowana niezależnie, ale jest podobna do podejścia opisanego przez Henry'ego i wsp.10 Po pierwsze, jądra znakowano znacznikiem fluorescencyjnym, który ulega ekspresji tylko w określonych typach komórek u Drosophila melanogaster, aby ułatwić późniejszą izolację znakowanych jąder z mieszanych populacji przy użyciu podejścia opartego na powinowactwie. Do znakowania jąder wykorzystano domenę KASH (Klarsicht/Anc-1/Syne homology). Domena KASH jest domeną transbłonową, która lokalizuje się na zewnętrznej błonie otoczki jądrowej, częściowo poprzez interakcje z białkami zawierającymi domenę SUN w przestrzeni okołojądrowej11. C-końcowa domena KASH białek takich jak Drosophila Msp-300 i Klarsicht zakotwicza te białka w zewnętrznej błonie jądrowej, podczas gdy ich N-końcowe domeny oddziałują z białkami cytoszkieletu, takimi jak aktyna lub mikrotubule w cytoplazmie12-14. Wygenerowano konstrukty, w których domena KASH Drosophila Msp-300 została połączona z C-końcem EGFP, pod kontrolą sekwencji regulatorowej Gal4, UAS w wektorze pUAST-attB 15,16. Korzystając z integracji specyficznej dla miejsca phiC31, wygenerowano transgeniczne muchy, w których transgen UAS-EGFP::Msp-300KASH został wprowadzony do loci attP2 na chromosomie 3L17. Muchy UAS-EGFP::Msp-300KASH mogą być krzyżowane z muchami, które wyrażają sterownik Gal4 w określonym typie komórki, co skutkuje ukierunkowaną ekspresją EGFP na zewnętrznej błonie jądrowej w typie komórki będącej przedmiotem zainteresowania. Znakowane jądra można następnie oczyścić z mieszanych populacji komórek przy użyciu przeciwciał przeciwko GFP sprzężonych z kulkami magnetycznymi. W tym podejściu stosowanie niejonowego detergentu nie jest wymagane, ponieważ znacznik EGFP jest zlokalizowany po cytoplazmatycznej stronie zewnętrznej błony jądrowej, a zatem jest dostępny dla przeciwciał.

Protokół opisany poniżej może być używany do izolacji/wzbogacania jąder znakowanych EGFP z określonych typów komórek w tkankach larwalnych Drosophila, do ilościowego określania czystości i wydajności izolowanych jąder oraz do ekstrakcji jądrowego RNA odpowiedniego do ilościowej analizy ekspresji genu reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR). Izolację i oczyszczanie jąder (z wyłączeniem rozwarstwienia tkanek) można przeprowadzić w czasie krótszym niż jedna godzina. Przedstawiono wyniki pokazujące, że jądra glejowe mogą być z powodzeniem izolowane z płata wzrokowego larwy i dysku wyobrażonego oka, a następnie wykorzystywane do późniejszej analizy ekspresji genów. Przewiduje się, że podejście to będzie przydatne do izolacji/wzbogacania znakowanych jąder z tkanek embrionalnych i larwalnych, w których komórki docelowe stanowią mniej niż 5% całej populacji. Wszystkie stada Drosophila i plazmidy wygenerowane w tym badaniu są dostępne u autorów na żądanie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generacja i charakterystyka EGFP::KASH Drosophila

  1. Kierowca Cross Gal4 leci do UAS-EGFP::Msp-300KASH lata. Alternatywnie, rekombinowane muchy, które są nosicielami zarówno sterownika Gal4, jak i transgenu UAS-EGFP::Msp-300KASH, mogą być generowane przy użyciu standardowych technik genetycznych. To drugie podejście jest korzystne, jeśli wymagana jest duża liczba potomstwa.
  2. Scharakteryzować ekspresję markera EGFP::KASH przy użyciu standardowych technik mikroskopowych. Uwaga: Ekspresję EGFP można zaobserwować za pomocą standardowych technik mikroskopowych w wypreparowanych, utrwalonych tkankach Drosophila lub w całych larwach i nie wymaga użycia przeciwciała.
    1. Określ wzorzec ekspresji markera EGFP::KASH w całym organizmie pod mikroskopem fluorescencyjnym (patrz Materiały PDF). Uwaga: Wiele sterowników Gal4, w tym sterownik repo-GAL4 pokazany na rycinie 1, wykazuje niespecyficzne wzorce ekspresji w innych tkankach larwalnych, takich jak gruczoł ślinowy (patrz Wyniki).
    2. Przeanalizuj wzorzec ekspresji EGFP::KASH w wypreparowanej tkance będącej przedmiotem zainteresowania za pomocą mikroskopii konfokalnej.
      1. Utrwal tkankę będącą przedmiotem zainteresowania za pomocą formaldehydu w końcowym stężeniu 4% i wybarwić DNA za pomocą DAPI w końcowym stężeniu 0,1 μg/ml, aby zobrazować lokalizację znacznika EGFP::KASH względem DNA.
      2. Uzyskuj obrazy za pomocą obiektywu immersyjnego 40X / 1,30 lub obiektywu immersyjnego 20X / 0,75, w zależności od rozmiaru tkanki będącej przedmiotem zainteresowania. Do akwizycji obrazu można wykorzystać następujące warunki wzbudzenia/emisji: 408 nm/425-475 nm (DAPI); 488 nm / 525-550 nm (GFP).

2. Wyizoluj jądra z tkanek larw Drosophila

  1. Przygotować sprzęt do wypreparowania tkanek larwalnych i późniejszej izolacji jąder. Należy pamiętać, że w razie potrzeby całe zarodki z odwążówką mogą być również wykorzystane jako materiał wyjściowy. Zaleca się stosowanie częściowo wypreparowanych tkanek larwalnych, a nie całych larw, jeśli interesujący typ komórki jest obecny w określonej tkance, takiej jak dysk wyobrażeniowy. Zmniejsza to niespecyficzne wiązanie, a także eliminuje problemy, które mogą być spowodowane ekspresją niektórych sterowników Gal4 w komórkach niedocelowych.
    1. Przygotuj dwie pary ostrych kleszczyków (patrz Materiały PDF), jedną silikonowaną 9-dołkową szklaną płytkę (patrz Materiały PDF) i PBT (1x PBS, pH 7,4; 0,1% Tween-20).
    2. Wstępnie zwiąż przeciwciało GFP z kulkami magnetycznymi. Ten etap należy rozpocząć przed rozpoczęciem sekcji. Dodać 10 μl kulek magnetycznych (Invitrogen, patrz Materiały PDF) i 2 μg przeciwciała GFP (Roche, patrz Materiały PDF) do 400 μl buforu do przemywania (1x PBS, pH 7,4; 2,5 mM MgCl2) w probówce o pojemności 1,5 ml. Ilość użytych kulek i przeciwciał można w razie potrzeby zoptymalizować w oparciu o ilość celu w próbce i powinowactwo wiązania przeciwciała do kulek.
    3. Inkubować kulki i przeciwciało z rotacją przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Umieść probówkę o pojemności 1,5 ml zawierającą kulki i przeciwciało w stojaku magnetycznym (patrz Materiały PDF) i pozwól kulkom związać się z magnesem przez około 1-2 minuty. Usuń supernatant zawierający niezwiązane przeciwciało i przemyj bufor za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Koraliki pozostaną przywiązane do ścianki probówki o pojemności 1,5 ml po stronie przylegającej do magnesu.
    5. Przepłukać kulki dwukrotnie 1 ml buforu do przemywania za każdym razem, jak opisano w ppkt 2.1.4. Wyjmij probówkę o pojemności 1,5 ml ze stojaka magnetycznego i odwróć na chwilę, aby wymieszać kulki i bufor do mycia podczas każdego etapu mycia.
    6. Przechowuj kulki związane z przeciwciałami w buforze do płukania, aż będą gotowe do kontynuowania kroku 2.7. Koraliki nie powinny być dopuszczone do wyschnięcia na żadnym etapie protokołu.
  2. Wypreparuj tkanki larwalne w PBT i przenieś wypreparowane tkanki do jednego dołka 9-dołkowej płytki. Zazwyczaj wypreparowanie płata wzrokowego i krążka imaginalnego oka od 100 larw w trzecim stadium rozwojowym dostarcza wystarczającego materiału do dalszej analizy ekspresji genów po izolacji jąder.
  3. Wyizolowaną tkankę przepłukać w buforze do ekstrakcji jądrowej (10 mM HEPES-KOH, pH 7,5; 2,5 mM MgCl2; 10 mM KCl) w probówce o pojemności 1,5 ml. Przenieść izolowane tkanki larwalne do 1 ml homogenizatora Dounce (patrz Materiały PDF) na lodzie, który zawiera 1 ml świeżego buforu do ekstrakcji jądrowej. Inkubować na lodzie przez 5 minut. Nie jest konieczne dodawanie inhibitorów proteazy, jeśli RNA ma być ekstrahowane po izolacji jąder.
  4. Rozbić tkankę przez 20 uderzeń luźnym tłuczkiem, a następnie inkubować próbkę na lodzie przez 10 minut, aby umożliwić komórkom pęcznienie. Wyciągnij jądra z komórek, wykonując 15 pociągnięć ciasnym tłuczkiem. Liczba uderzeń luźnymi i ciasnymi tłuczkami musi być zoptymalizowana dla różnych tkanek i typów komórek; Nadmierna homogenizacja może spowodować ścięte jądra, podczas gdy niewystarczająca homogenizacja nie usunie wszystkich jąder z tkanki.
  5. Przefiltrować homogenat, który zawiera jądra i szczątki komórkowe, przez sitko o wielkości porów 40 μm (patrz Materiały PDF), które zostało wstępnie przepłukane buforem do homogenizacji jądrowej. Zebrać przefiltrowany homogenat do świeżej probówki.
  6. Pobrać próbki przed izolacją do późniejszej analizy w celu określenia wydajności jąder, integralności jąder oraz określenia poziomów transkryptów docelowych genów przed izolacją jąder.
    1. Przenieść 50 μl przefiltrowanego homogenatu do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety. Jest to próbka sprzed izolacji. Dodać 500 μl odczynnika Trizol (patrz Materiały PDF, UWAGA), odwrócić do wymieszania i przechowywać w temperaturze -20 °C w celu późniejszej izolacji RNA (krok 3.1).
    2. Przenieść 20 μl przefiltrowanego homogenatu do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml.
      1. Dodać DAPI do końcowego stężenia 0,1 μg/ml i inkubować próbkę na lodzie przez 10 minut.
      2. Przenieść jądra barwione DAPI na szkiełko nakrywkowe pokryte polilizyną i umieścić na szkiełku mikroskopowym. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe przezroczystym lakierem do paznokci.
      3. Sprawdź integralność jąder i obecność jąder oznaczonych GFP za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Uwaga: Nie jest konieczne utrwalanie jąder ani barwienie na GFP, jeśli te szkiełka są analizowane stosunkowo szybko po przygotowaniu (w ciągu 24 godzin).
    3. Przenieść 10 μl przefiltrowanego homogenatu do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml i dodać 90 μl buforu do przemywania (1x PBS, pH 7,4; 2,5 mM MgCl2). Dodać DAPI do końcowego stężenia 0,1 μg/ml i inkubować na lodzie przez 10 minut. Określić wydajność jąder w próbce przed izolacją za pomocą hemocytometru, aby policzyć jądra DAPI-dodatnie za pomocą epifluorescencji pod 10-krotnym obiektywem powietrznym.
  7. Umieścić probówkę o pojemności 1,5 ml zawierającą kulki związane z przeciwciałami (przygotowane w sekcji 2.1.6) w stojaku magnetycznym i pozwolić, aby kulki magnetyczne związały się z magnesem przez co najmniej 2 minuty, jak opisano w sekcji 2.1.4. Usunąć bufor płuczący z kulek związanych z przeciwciałami za pomocą pipety o pojemności 1 ml i dodać przefiltrowany homogenat z kroku 2.5 do probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
  8. Delikatnie odwrócić probówkę kilka razy do wymieszania i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut, mieszając od końca do końca. Jeśli to możliwe, unikaj pęcherzyków w probówce, ponieważ mogą one spowodować zlepianie się jąder.
  9. Umieścić probówkę o pojemności 1,5 ml zawierającą kulki związane z przeciwciałami i homogenat w stojaku magnetycznym, a następnie pozwolić kulkom magnetycznym związać się z magnesem przez co najmniej 2 minuty, jak opisano w sekcji 2.1.4. Usunąć homogenat zawierający frakcję jąder niezwiązanych za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
  10. Przemyć próbkę 3 razy 1 ml buforu do przemywania za każdym razem. Wyjąć ze stojaka probówkę o pojemności 1,5 ml zawierającą kulki, związane jądra i bufor do płukania i odwrócić do kilkukrotnego wymieszania, a następnie umieścić probówkę w stojaku magnetycznym zgodnie z opisem w kroku 2.9 i usunąć supernatant za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
  11. Dodać 150 μl buforu do płukania do kulek, które powinny być związane z jądrami docelowymi. To jest próbka po izolacji. Przygotuj próbki do analizy mikroskopowej, a następnie ekstrakcji RNA.
    1. Przenieść 20 μl próbki po izolacji do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml i wybarwić DAPI i przeprowadzić analizę w sposób opisany w sekcji 2.6.2. Policz jądra GFP+/DAPI+ i GFP-/DAPI+ wychwycone przez kulki magnetyczne w celu określenia czystości wzbogaconych jąder GFP+ w próbce po izolacji.
    2. Dodać 1 ml odczynnika Trizol do pozostałej części próbki po izolacji, odwrócić w celu wymieszania i przechowywać w temperaturze -20 °C w celu późniejszej izolacji RNA (etap 3.1). Uwaga: W razie potrzeby próbki w Trizolu mogą być przechowywane przez kilka tygodni w temperaturze -20 °C. Nie jest konieczne eluowanie jąder z kulek magnetycznych przed ekstrakcją RNA za pomocą odczynnika Trizol, ponieważ kulki nie zakłócają późniejszej izolacji RNA.

3. Określ poziomy transkryptów w jądrach wyizolowanych z tkanek larw

  1. Wyizolować RNA z próbek przed izolacją i po izolacji przygotowanych w sekcjach 2.6.1 i 2.11.2 przy użyciu standardowego protokołu opisanego dla ekstrakcji RNA na bazie Trizolu (patrz Materiały PDF) z następującymi modyfikacjami:
    1. Po wytrąceniu się osadu RNA dodać 19,2 μl wody wolnej od RNaz i 0,8 μl odczynnika RNASecure (patrz Materiały PDF) do osadu i inkubować w temperaturze 60 °C przez 20 minut w celu inaktywacji RNA.
  2. Określić stężenie RNA za pomocą barwnika wiążącego fluorescencyjne RNA, takiego jak zestaw do oznaczania RNA Qubit (patrz Materiały PDF) za pomocą fluorometru QubitR 2.0 zgodnie z protokołem producenta.
  3. Zsyntetyzuj cDNA za pomocą amplifikującej odwrotnej transkryptazy, takiej jak zestaw do odwrotnej transkryptazy EpiScript i starterów oligodT, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Uwaga: Zazwyczaj od 50 do 100 ng RNA generuje wystarczającą ilość cDNA do przeprowadzenia wielu analiz ekspresji genów. Do wytworzenia cDNA należy użyć równoważnych ilości RNA przed izolacją i po izolacji.
  4. Dodaj 180 μl wody wolnej od nukleaz do próbki cDNA o objętości 20 μl, aby rozcieńczyć ją 10-krotnie przed analizą ilościową PCR (qPCR) w czasie rzeczywistym. To rozcieńczenie jest ważnym krokiem, ponieważ nierozcieńczone próbki cDNA mogą hamować qPCR.
  5. Przygotować główną mieszaninę qPCR z polimerazą i dNTP, po 4 pmole startera do przodu i do tyłu, uzupełnioną sterylną wodą do końcowej objętości reakcji 20 μl.
    1. Zaprojektuj startery qPCR tak, aby były ukierunkowane na geny, które mają ulec ekspresji w typie komórki będącej przedmiotem zainteresowania i na etapie rozwoju, na którym pobierana jest tkanka. Zaprojektuj startery tak, aby obejmowały intron, jeśli to możliwe, tak aby można było odróżnić produkty genomiczne i cDNA PCR. Uwaga: Jeśli profil ekspresji genów docelowego typu komórki nie jest znany, startery przeciwko eGFP, które powinny być wyrażane specyficznie w populacji znakowanych jąder, mogą być użyte do optymalizacji protokołu dla określonego typu komórki i tkanki (Tabela 1).
  6. Określić względne poziomy transkryptu każdego interesującego genu w próbkach przed izolacją i po izolacji, porównując z serią rozcieńczeń cDNA przygotowaną z całej tkanki. Poziomy transkryptów genów docelowych powinny być znormalizowane do genu referencyjnego, takiego jak Rpl32 (lub najlepiej kilku genów referencyjnych).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sterownik repo-GAL4 (numer katalogowy Bloomington 7415) jest specyficznie wyrażany w komórkach glejowych w układzie nerwowym Drosophila na wielu etapach rozwoju18. Wygenerowano muchy, które stabilnie wyrażają UAS-EGFP::Msp-300KASH pod kontrolą sterownika repo-GAL4 przy użyciu standardowych technik genetycznych. Aby scharakteryzować wzorzec ekspresji transgenu EGFP::KASH u tych muszek, zbadano wzorzec ekspresji GFP w wypreparowanym płacie wzrokowym i dysku imaginal...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten może być stosowany do izolowania lub wysoce wzbogacania specyficznie oznakowanych jąder z mieszanych populacji komórek w tkankach embrionalnych lub larwalnych Drosophila . Korzystając z tego protokołu, jądra można wyizolować z wypreparowanych tkanek w ciągu około 1 godziny. Czystość i wydajność izolowanych jąder musi być oznaczona doświadczalnie dla każdego typu komórki. Ilościowe określenie jąder związanych z kulkami na etapie protokołu po izolacji przy użyciu hemocytometru może być trudne ze wzglę...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Janice Fischer za dostarczenie plazmidu UAS-EGFP::Msp-300KASH. Przeciwciało mAB24B10 uzyskano z Banku Hybrydomy Badań Rozwojowych opracowanego pod auspicjami NICHD i utrzymywanego przez Wydział Biologii Uniwersytetu Iowa. Zapas repo-GAL4 (BL7415) został pozyskany z Bloomington Stock Center na Indiana University. Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie ze strony American Cancer Society Institutional Research Grant (IRG #58-006-53) dla Purdue University Center for Cancer Research. Jingqun Ma jest wspierany przez badania rolnicze w Purdue Assistantship in Food and Agriculture na Uniwersytecie Purdue.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało anty-chaoptin (mysie, monoklonalne)Badania rozwojowe Hybridoma BankmAB24B10
Przeciwciało anty-GFP (mysie, monoklonalne)Roche11814460001To specyficzne przeciwciało jest zalecane dla tego protokołu. Można jednak również zastosować alternatywne przeciwciała.
2x Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix z ROXMidSciBEQPCR-R
DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol, sól dichlorowodorku)Homogenizator Biotium40011
Dounce (1 ml)Pęseta VWR62400-595
Dumont #5, 11 cmWorld Precision Instruments14095
Dynabeads Białko G do immunoprecypitacjiInvitrogen10003DTa specyficzna marka koralików magnetycznych jest zalecana do tego protokołu.
Epicentrum odwrotnej transkryptazy EpiScriptERT12910Khttp://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf
Sitka komórkowe Falcona, 40 μ m wielkość porówVWR21008-949W zależności od wielkości docelowych jąder komórkowych można stosować alternatywne rozmiary porów.
Podstawka magnetyczna (8 x probówki 1,5 ml)MilliporeLSKMAGS08 
Mini rotator probówkowyGenemateH-6700
Zestaw startowy kubitówLife TechnologiesQ32871Podobne metody oparte na fluorescencji do ilościowego określania wydajności RNA mogą być stosowane. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ
RNAsecure (Ambion)Life TechnologiesAM7010Użycie tego odczynnika do inaktywacji RNA jest opcjonalne.
Maszyna RT-PCR Thermal CyclerBioRadCFX Connect Thermal Cycler
Silikonowana 9-dołkowa szklana płytkaHampton ResearchHR3-134
Stereomikroskop Adapter fluorescencyjny (Royal Blue (440-460 nm) wzbudzenie + żółta barieraNightseaTen adapter umożliwia badanie fluorescencji GFP za pomocą typowego mikroskopu preparacyjnego (np. Nikon)
Mikroskop StereoZoom 83604 Zestaw z okularami szerokokątnymi 10X i uniwersalnym stojakiem na wysięgnikTermocykler NikonSMZ 745
OdczynnikBioRadT100
TrizolLife Technologies15596018UWAGA; Można zastosować alternatywne metody ekstrakcji RNA. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf
Tween 20Amresco0777-1L

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weake, V. M., et al. Post-transcription initiation function of the ubiquitous SAGA complex in tissue-specific gene activation. Genes Dev. 25, 1499-1509 (2011).
  2. Bonn, S., et al. Cell type-specific chromatin immunoprecipitation from multicellular complex samples using BiTS-ChIP. Nat. Protoc. 7, 978-994 (2012).
  3. Haenni, S., et al. Analysis of C. elegans intestinal gene expression and polyadenylation by fluorescence-activated nuclei sorting and 3'-end-seq. Nucleic Acids Res. 40, 6304-6318 (2012).
  4. Barthelson, R. A., Lambert, G. M., Vanier, C., Lynch, R. M., Galbraith, D. W. Comparison of the contributions of the nuclear and cytoplasmic compartments to global gene expression in human cells. BMC Genom. 8, 340 (2007).
  5. Zhang, C., Barthelson, R. A., Lambert, G. M., Galbraith, D. W. Global characterization of cell-specific gene expression through fluorescence-activated sorting of nuclei. Plant Physiol. 147, 30-40 (2008).
  6. Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nat. Protoc. 6, 56-68 (2011).
  7. Deal, R. B., Henikoff, S. A simple method for gene expression and chromatin profiling of individual cell types within a tissue. Dev Cell. 18, 1030-1040 (2010).
  8. Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling. Genom. Res. 22, 766-777 (2012).
  9. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  10. Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. Cell type-specific genomics of Drosophila neurons. Nucleic Acids res. 40, 9691-9704 (2012).
  11. Starr, D. A. KASH and SUN proteins. Curr Biol. 21, 414-415 (2011).
  12. Fischer, J. A., et al. Drosophila klarsicht has distinct subcellular localization domains for nuclear envelope and microtubule localization in the eye. Genetics. 168, 1385-1393 (2004).
  13. Patterson, K., et al. The functions of Klarsicht and nuclear lamin in developmentally regulated nuclear migrations of photoreceptor cells in the Drosophila eye. Mol. Biol. Cell. 15, 600-610 (2004).
  14. Yu, J., et al. The KASH domain protein MSP-300 plays an essential role in nuclear anchoring during Drosophila oogenesis. Dev. Biol. 289, 336-345 (2006).
  15. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3312-3317 (2007).
  16. Kracklauer, M. P., Banks, S. M., Xie, X., Wu, Y., Fischer, J. A. Drosophila klaroid encodes a SUN domain protein required for Klarsicht localization to the nuclear envelope and nuclear migration in the eye. Fly. 1, 75-85 (2007).
  17. Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Nat. Genet. 40, 476-483 (2008).
  18. Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone. Dev. Biol. 238, 47-63 (2001).
  19. Fujita, S. C., Zipursky, S. L., Benzer, S., Ferrus, A., Shotwell, S. L. Monoclonal antibodies against the Drosophila nervous system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7929-7933 (1982).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

System Gal4 UASj dra oznakowane EGFPizolacja za pomoc kulek magnetycznychprofilowanie kom rkoweo rodkowy uk ad nerwowyprofilowanie transkrypcyjne

Powiązane artykuły