Artykuł metodologiczny

Zmodyfikowana metoda heterotopowego przeszczepu serca myszy

DOI:

10.3791/51423

⸱

23 czerwca 2014

 ,  ,  ,  , 
1Collaborative Transplant Laboratory, University of Sydney

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technika jest demonstrowana dla procedury mikrochirurgicznej do heterotopowego przeszczepu serca u myszy, w tym uproszczone metody pobierania dawców i zespolenia naczyń biorców.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myszy są często wykorzystywane jako dawcy i biorcy przeszczepów serca w badaniach immunologii transplantacyjnej ze względu na szeroki zakres dostępnych transgenicznych myszy i odczynników. Trudność wynika z niewielkich rozmiarów zwierzęcia i znacznych wyzwań technicznych związanych z mikrochirurgią związaną z przeszczepem serca. W szczególności wysoki odsetek niepowodzeń technicznych wcześnie po przeszczepie może wynikać ze śmierci biorcy i powikłań pooperacyjnych, takich jak paraliż kończyn tylnych lub niebijące serce. Zademonstrowano tu pełną technikę heterotopowego przeszczepu serca myszy, polegającą na pobraniu serca dawcy, a następnie jego wszczepieniu myszowi biorcy. Serce dawcy pobiera się natychmiast po perfuzji in situ zimną heparynizowaną solą fizjologiczną i przecięciu aorty wstępującej i tętnicy płucnej. Operacja biorcy polega na przygotowaniu aorty brzusznej i żyły głównej dolnej (IVC), a następnie zespoleniu końca do boku aorty dawcy z aortą biorcą za pomocą pojedynczego mikroszwu 10-0 i podobnego zespolenia tętnicy płucnej dawcy z IVC biorcy. Po operacji zwierzęciu wstrzykuje się podskórnie 0,6 ml soli fizjologicznej i pozostawia do odzyskania sił na poduszce grzewczej o temperaturze 37 °C. Wyniki 227 przeszczepów serca myszy są podsumowane ze wskaźnikiem sukcesu po 48 godzinach wynoszącym 86,8%. Spośród 13,2% niepowodzeń w ciągu 48 godzin, 5 (2,2%) doświadczyło paraliżu kończyn tylnych, 10 (4,4%) miało niebijące serce z powodu urazu niedokrwiennego przeszczepu i/lub zakrzepicy, a 15 (6,6%) zmarło w ciągu 48 godzin.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zwierzęce modele transplantacji narządów mogą dostarczyć cennych informacji dla poprawy leczenia klinicznych pacjentów po przeszczepach. Modele mysie są szczególnie przydatne do badania mechanizmu immunologicznego odrzucenia lub akceptacji przeszczepu narządu ze względu na szeroką gamę genetycznie modyfikowanych myszy i odczynników specyficznych dla myszy, które nie są dostępne dla innych modeli zwierzęcych1-3. Wyzwaniem związanym z mysimi modelami transplantacji jest niewielki rozmiar dawców i biorców, co wymaga znacznych umiejętności technicznych, aby osiągnąć zadowalające wyniki.

Po raz pierwszy opisano technikę heterotopowego przeszczepu serca u szczurów4, która następnie została zaadaptowana do przeszczepu serca myszy przez Corry'ego i wsp.5. Technika ta polegała na przygotowaniu biorcy przed operacją dawcy i braku perfuzji serca dawcy, co może zagrozić przeżyciu przeszczepionego serca lub biorcy. Procedura ta jest szeroko stosowana, zgodnie z pierwotnym opisem, w celu zbadania mechanizmów odrzucenia przeszczepu i tolerancji6-8. Inni zaadaptowali oryginalną procedurę przeszczepu serca szczura Ono i Lindsey do przeszczepów serca u myszy9,10. Niedawno opublikowano technikę przeszczepu serca u myszy, która przezwyciężyła niektóre problemy związane z metodą Corry'ego i wsp. 11. Opisany tutaj protokół zawiera nasze modyfikacje, oparte na metodzie Mottram i wsp. 12, które obejmują: perfuzję in situ zimną heparynizowaną solą fizjologiczną natychmiast po torakotomii i wykonanie operacji dawcy przed operacją biorcy w celu zminimalizowania czasu operacji biorcy. Ponadto używamy małych atraumatycznych zacisków naczyniowych zamiast jedwabnych wiązań 6-0. Chociaż zaciski do naczyń mają tę wadę, że zajmują więcej miejsca, są łatwiejsze do kontrolowania niż opaski, które nie powinny być zbyt ciasne ani luźne i są mniej łatwe do usunięcia niż zaciski. W naszej metodzie wykorzystuje się pojedynczy szew biegowy do zespolenia naczyniowego, chociaż w początkowych etapach nauki alternatywą jest stosowanie szwów rozciągowych w narożniku bliższym i dalszym, aby zapewnić równość szwów, a tym samym drożność zespolenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przed rozpoczęciem eksperymentów, uzyskaj zgodę Komisji Etyki Opieki nad Zwierzętami odpowiedniej instytucji na planowane eksperymenty. Utrzymuj myszy w zgodzie z wymaganiami swojej instytucji. Poniższy protokół został zatwierdzony przez komitety Uniwersytetu w Sydney i Królewskiego Szpitala Księcia Alfreda.

Przed rozpoczęciem operacji, wszystkie narzędzia powinny być dokładnie oczyszczone i wysterylizowane przez namoczenie w 80% etanolu. Niektóre instytucje wymagają sterylizacji w autoklawie, jednak w dłuższej perspektywie może to uszkodzić drobne narzędzia mikrochirurgiczne. Jeśli to możliwe, używaj sterylnego sprzętu jednorazowego użytku.

1. Znieczulenie

  1. Znieczulij mysz izofluranem w szczelnie zamkniętym pojemniku, a następnie umieść ją na wznak na tablicy operacyjnej, szybko łącząc znieczulający stożek nosowy. Sprawdź adekwatność znieczulenia, ściskając tylną stopę, aby upewnić się, że nie ma odruchu.
  2. Ogol skórę ostrzem chirurgicznym i wysterylizuj 80% etanolem. Ponadto 2% chlorheksydyny w 70% alkoholu izopropylowym może być używane do sterylizacji skóry. Podczas indukcji znieczulenia stężenie izofluranu wynosi 3%, ale zmniejsza się do 1-1,5% w celu podtrzymania. Dokonaj niewielkich korekt tego stężenia, aby utrzymać regularny oddech i tętno. Utrzymuj temperaturę zwierzęcia na poduszce grzewczej.

2. Operacja dawcy

  1. Wykonaj torakotomię, aby odsłonić serce i naczynia, przecinając klatkę piersiową po obu stronach klatki piersiowej od krawędzi żebra do pachy, a następnie poprzeczne cięcie na poziomie wyrostka mieczykowatego, aby utworzyć płat ściany klatki piersiowej. Podnieś tę klapkę obok głowicy i przypnij ją do tablicy operacyjnej. Oderwij osierdzie, aby odsłonić serce i naczynia.
  2. Jedną ręką podnieś żyłę główną dolną za pomocą kleszczy, a drugą wstrzyknij 1 ml zimnej heparynizowanej soli fizjologicznej proksymalnie do serca przez IVC, a następnie umieść mały zacisk tętniczy na IVC, aby zapobiec przepływowi roztworu perfuzyjnego z powrotem przez otwór igły.
  3. Za pomocą gazy i wacika cofnij serce w dół, aby odsłonić aortę wstępującą i tętnicę płucną. Przełóż jedno ostrze pary mikronożyczek przez kanał (zatokę poprzeczną) z tyłu do pęczka aorty i tętnicy płucnej i przeciąć aortę i tętnicę płucną tak daleko, jak to możliwe, aby zapewnić wystarczającą długość do zespolenia.
  4. Zawiąż i podziel IVC, prawą żyłę główną górną (SVC), lewą SVC i żyły płucne za pomocą nici jedwabnej 6-0. Zawiąż IVC i prawy SVC oddzielnie, a następnie umieść pojedynczą nić za sercem, aby otoczyć lewy SVC razem z żyłami płucnymi i zawiązać go. Pobrać serce z miejsca dawczego, przecinając naczynia dystalnie do wiązań, a następnie przechowywać je w zimnym, sterylnym roztworze soli fizjologicznej w temperaturze 4 °C do czasu przeszczepienia. Powoduje to śmierć dawcy w wyniku wykrwawienia.

3. Operacja odbiorcy

  1. Znieczulić biorcę jak wyżej (punkt 1). Ostrożnie ogol brzuch, aby uniknąć podrażnienia, a następnie wykonaj laparotomię przez nacięcie linii środkowej od łona do xiphisternum i wycofaj się za pomocą spinaczy do papieru zgiętych w celu utworzenia retraktorów. Owiń jelita ciepłą, sterylną gazą nasączoną solą fizjologiczną i cofnij się do prawej górnej części brzucha.
  2. Aby odsłonić aortę podnerkową i IVC, należy uwolnić wiązki aorty i IVC z lewej tętnicy nerkowej i żyły do rozwidlenia biodrowego, oddzielając je od naczyń lędźwiowych za pomocą urządzenia do kauteryzacji. Zadbaj o to, aby kauteryzator miał odpowiednią temperaturę i był używany przez wystarczająco długi czas, aby podzielić i uszczelnić końce naczynia.
  3. Zastosuj małe atraumatyczne zaciski naczyniowe do segmentów aorty i IVC dystalnie i proksymalnie. Wykonaj nacięcie w przedniej ścianie aorty, najpierw nakłuwając otwór igłą 30 G; Następnie wytnij nacięcie pionowo za pomocą mikronożyczek, aby dopasować je do wielkości aorty dawcy. Przepłucz światło aorty heparynizowaną solą fizjologiczną, aby usunąć wszelkie skrzepy krwi.
  4. Przynieś serce dawcy do miejsca biorczego pokryte gazą nasączoną zimną solą fizjologiczną i umieść je po prawej stronie brzucha. Upewnij się, że aorta dawcy znajduje się obok nacięcia na aorcie biorcy, a tętnica płucna dawcy znajduje się obok IVC biorcy.
  5. Zespoleć aortę dawczą koniec do boku z aortą biorcy za pomocą biegnących szwów nylonowych 10-0, zaczynając od bliższego rogu i zszywając wzdłuż lewej strony najpierw aż do osiągnięcia dystalnego rogu, na którym to etapie zwierzę jest obracane o 180°. Delikatnie przesuń serce dawcy na lewą stronę brzucha, aby odsłonić prawą stronę aorty i kontynuuj szycie przez prawą stronę ściany aorty od dystalnego końca do bliższego końca. Przed zamknięciem zespolenia aorty delikatnie przepłucz światło heparynizowaną solą fizjologiczną, aby usunąć skrzep i powietrze.
  6. Zespolenie tętnicy płucnej dawcy (PA) z boku biorcy IVC. Wykonaj nacięcie pionowo mikronożyczkami w przedniej ścianie IVC w miejscu zgodnym z zespoleniem tętnicy. Zespolenie PA dawcy z biorcą IVC za pomocą prowadzenia nylonowych szwów 10-0, zaczynając od dystalnego końca lewej ściany w świetle IVC. Po osiągnięciu bliższego końca kontynuuj szwy wzdłuż przedniej prawej ściany bocznej aż do dystalnego końca, aby zakończyć zespolenie. Przed zamknięciem zespolenia należy delikatnie przepłukać światło, aby usunąć wszelkie skrzepy i powietrze.
  7. Przed zwolnieniem zacisków naczyń umieść kawałki pianki żelowej wokół miejsc zespolenia i delikatnie uciskaj bawełnianym aplikatorem, aż do uzyskania hemostazy. W momencie rewaskularyzacji najpierw zwolnij dystalny zacisk, a następnie zacisk proksymalny.
  8. Po rewaskularyzacji nałóż na przeszczep zewnętrznie ciepłą sól fizjologiczną w temperaturze 37 °C, aby wspomóc jego regenerację. Przeszczep zwykle natychmiast rozpoczyna migotanie i spontanicznie powraca do rytmu zatokowego w ciągu kilku minut. Wstrzyknąć podskórnie 0,6 ml ciepłej soli fizjologicznej, aby utrzymać nawodnienie biorcy. Wstrzyknąć buprenorfinę podskórnie w celu znieczulenia przed zakończeniem operacji
  9. Zamknij ranę brzuszną jednym wchłanialnym szwem biegowym 5-0 dla obu warstw. Zacznij od ukończenia warstwy wewnętrznej i kontynuuj wzdłuż skóry.

4. Odzyskiwanie i monitorowanie przeszczepów

  1. Wstrzyknąć ampicylinę w celu profilaktyki infekcji i umieścić biorcę na poduszce grzewczej w temperaturze 37 °C w celu wyzdrowienia. Większość zwierząt szybko wraca do zdrowia i zwykle pije i często je w ciągu 3 godzin. Jeśli mysz wykazuje oznaki niepokoju, przyjrzyj się uważnie, aby ustalić przyczynę. Jeśli nie ma oczywistej przyczyny, należy leczyć buprenorfiną i uważnie monitorować. Skonsultuj się z weterynarzem, jeśli objawy są ciężkie lub utrzymują się dłużej niż 8 godzin i rozważ eutanazję. Jeśli to konieczne, należy kontynuować wstrzykiwanie buprenorfiny co 12 godzin, aż do ustąpienia objawów. Jeśli mysz wykazuje oznaki niepokoju po 8 godzinach, należy kontynuować 12-godzinne wstrzyknięcia buprenorfiny, aż do ustąpienia. Skonsultuj się z weterynarzem, jeśli objawy utrzymują się dłużej niż 48 godzin i w razie potrzeby poddaj się eutanazji.
  2. Monitoruj bicie serca przeszczepu za pomocą bezpośredniego badania palpacyjnego jamy brzusznej i rejestruj siłę bicia jako ++++ dla zdrowego przeszczepu do + dla słabego bicia z powodu zaawansowanego odrzucenia i – jako brak bicia z powodu całkowitego odrzucenia przeszczepu. Monitoruj myszy codziennie przez pierwsze 10 dni, a następnie 3 razy w tygodniu przez cały czas trwania eksperymentu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po wstępnym okresie szkolenia przeanalizowano 227 przypadków heterotopowego przeszczepienia serca u myszy przeprowadzonych w naszej grupie. Wskaźnik sukcesu w ciągu pierwszych 24 h wyniósł 90,3%, a w 48 h było to 86,8%. spośród 30 (13,2%) niepowodzeń w ciągu 48 h, u 5 (2,2%) wystąpił paraliż kończyn tylnych i zwierzęta musiały zostać poddane eutanazji, u 10 (4,4%) stwierdzono brak pracy serca z powodu uszkodzenia niedokrwiennego przeszczepu i/lub zakrzepicy, natomiast 15 (6,6%) padło w ciągu 48 h. Niektóre wyniki przeżyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeszczep serca myszy to trudna metoda mikrochirurgiczna, której opanowanie wymaga znacznych umiejętności chirurgicznych. Najtrudniejszym aspektem jest mała średnica zbiorników. Ponadto konieczne jest ograniczenie czasu operacji biorcy i krwawienia. Technika przeszczepu serca myszy została po raz pierwszy opisana przez Corry'ego i wsp. w 1973 r., a następnie przez Mottram i wsp. 12. Nasze modyfikacje obejmują następujące punkty. Po pierwsze, natychmiastowa perfuzja serca dawcy zimnym heparyn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Health and Medical Research Council (NHMRC) of Australia Project Grant 1029205, przez Microsearch Foundation of Australia oraz przez Myee Codrington Medical Research Foundation.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroskop operacyjny Leica, Heerbrugg, SzwajcariaM65110-25X powiększenie
Maszyna anestezjologiczna Vet Quip Pty Ltd, Sydney, AustraliaVett3Zdolny do dostarczania mieszaniny izofluranu i tlenu w powietrzu 
Tablica operacyjna Sklep z narzędziami lub dostawcaGęsty korek lub syntetyczny zdolny do przyjmowania szpilek
Heparynizowana sól fizjologiczna (5 U/ml, 4 & deg; C)Pfizer, USAFW25W strzykawce 1 ml z igłą 23 G na lodzie
Sól fizjologiczna (37 ° C)AstraZeneca Pty Ltd, Australia4538Strzykawka w 1 ml z igłą 23 G na ciepłej podkładce
Szwy 10-nylonowe, 5-0 VicrylEthicon, Inc. NJ, USA2870G/J421H
Buprenorfina (0,05 mg/kg w 0,1 ml soli fizjologicznej)Reckitt Benckiser, Sydney, AustraliaW strzykawce 1 ml z igłą 23 G na lodzie
Ampułkilina (5 mg/kg w 0,1 ml soli fizjologicznej)Osika, Sydney, AustraliaW strzykawce 1 ml z igłą 23 G na lodzie
Gel FoamPharmacia & Upjohn Co. USA801289304Pocięte na małe kawałki
Wysokotemperaturowe urządzenie do kauteryzacjiMedtronic, USA8444000
Poduszka grzewcza / Prawa temperaturaKent Scientific Corporation, Turrington, CT 06790
Instrumenty mikrochirurgiczne:Shanghai Medical Instruments Co. Ltd.,   
MikroigłownikiSzanghaj, ChinyWT2020
Mikronożyczki        "                  "Mikrokleszcze WT1020
(końcówka prosta)        "                  "WA3010
Mikrokleszcze (zakrzywiona końcówka)        "                  "WA3020
(1 para)        "                  "W40350
Zaciski atraumatyczne mikronaczyniowe (1 para)        "                  "W40130/W40150
biurowy Zaciski do mikrokomarów

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aramaki, O., et al. Interleukin-10 but not transforming growth factor-beta is essential for generation and suppressor function of regulatory cells induced by intratracheal delivery of alloantigen. Transplantation. 79, 568-576 (2005).
  2. Chen, R. H., Bushell, A., Fuggle, S. V., Wood, K. J., Morris, P. J. Expression of granzyme A and perforin in mouse heart transplants immunosuppressed with donor-specific transfusion and anti-CD4 monoclonal antibody. Transplantation. 61, 625-629 (1996).
  3. Poulin, L. F., et al. Interleukin-9 promotes eosinophilic rejection of mouse heart allografts. Transplantation. 76, 572-577 (2003).
  4. Ono, K., Lindsey, E. S. Improved technique of heart transplantation in rats. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 57, 225-229 (1969).
  5. Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of heart in mice. Transplantation. 16, 343-350 (1973).
  6. Larsen, C. P., et al. CD40-gp39 interactions play a critical role during allograft rejection. Suppression of allograft rejection by blockade of the CD40-gp39 pathway. Transplantation. 61, 4-9 (1996).
  7. Saitovitch, D., Bushell, A., Mabbs, D. W., Morris, P. J., Wood, K. J. Kinetics of induction of transplantation tolerance with a nondepleting anti-Cd4 monoclonal antibody and donor-specific transfusion before transplantation. A critical period of time is required for development of immunological unresponsiveness. Transplantation. 61, 1642-1647 (1996).
  8. Callaghan, C. J., et al. Regulation of allograft survival by inhibitory FcgammaRIIb signaling. J. Immunol. 189, 5694-5702 (2012).
  9. Qian, S., et al. Impact of donor MHC Class I or Class II antigen deficiency on first- and second-set rejection of mouse heart or liver allografts. Immunology. 88, 124-129 (1996).
  10. Wang, C., et al. Spontaneous acceptance of mouse kidney allografts is associated with increased Foxp3 expression and differences in the B and T cell compartments. Transpl. Immunol. 24, 149-156 (2011).
  11. Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic Heart Transplantation in Mice. J. Vis. Exp. , (2007).
  12. Mottram, P. L., et al. Electrocardiographic monitoring of cardiac transplants in mice. Cardiovasc. Res. 22, 315-321 (1988).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przeszczep serca myszytransplantacja heterotopowapobieranie serca dawcyanastomoza biorcytechnika mikrochirurgicznat tnica aorty i p ucnas l fizjologiczna z heparynch odna sterylna s l fizjologicznaanaliza odrzucania przeszczepumonitorowanie pooperacyjne

Powiązane artykuły