Obecność HPV wysokiego ryzyka w tkance nowotworowej głowy i szyi wiąże się z korzystnymi wynikami. Niedawno opracowana technika hybrydyzacji RNA in situ zwana RNAscope umożliwia bezpośrednią wizualizację mRNA HPV E6/E7 w skrawkach tkanek FFPE.
Artykuł metodologiczny
RNAscope do wykrywania in situ transkrypcyjnie aktywnego wirusa brodawczaka ludzkiego w raku płaskonabłonkowym głowy i szyi
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
'Złotym standardem' w wykrywaniu onkogennych HPV jest wykazanie aktywnego transkrypcyjnie wirusa HPV wysokiego ryzyka w tkance nowotworowej. Jednak wykrycie mRNA E6/E7 za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR) wymaga ekstrakcji RNA, która niszczy tkankę nowotworową w kontekście krytycznym dla korelacji morfologicznej i jest trudna do przyjęcia w rutynowej praktyce klinicznej. Nasza niedawno opracowana technologia hybrydyzacji RNA in situ, RNAscope, umożliwia bezpośrednią wizualizację RNA w tkance utrwalonej w formalinie, zatopionej w parafinie (FFPE) z czułością pojedynczej cząsteczki i rozdzielczością pojedynczej komórki, co umożliwia bardzo czułą i specyficzną analizę in situ dowolnego biomarkera RNA w rutynowych próbkach klinicznych. Test RNAscope HPV został zaprojektowany do wykrywania mRNA E6/E7 siedmiu genotypów HPV wysokiego ryzyka (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52 i 58) przy użyciu puli sond specyficznych dla genotypu. Wykazał doskonałą czułość i swoistość w porównaniu z obecnym "złotym standardem" metody wykrywania mRNA E6/E7 za pomocą qRT-PCR. Status HPV określany za pomocą RNAscope jest silnie prognostyczny dla wyniku klinicznego u pacjentów z rakiem jamy ustnej i gardła.
Wprowadzenie
Zakażenie wirusem brodawczaka ludzkiego wysokiego ryzyka (HR-HPV) stanowi około 5% wszystkich nowotworów na świecie1. Częstość występowania raka jamy ustnej i gardła związanego z HPV wzrosła w ciągu ostatnich dziesięcioleci, zwłaszcza wśród mężczyzn. Rak płaskonabłonkowy jamy ustnej i gardła (OPSCC) HPV-dodatni prawdopodobnie będzie stanowił większość wszystkich nowotworów głowy i szyi w Stanach Zjednoczonych w ciągu najbliższych 20 lat2. Rak płaskonabłonkowy jamy ustnej i gardła wywołany przez HPV wiąże się z korzystnym przeżyciem, a status guza HPV jest silnym i niezależnym czynnikiem prognostycznym dla przeżycia3.
Dowody na transkrypcyjną aktywację onkogenów wirusa E6 i E7 są uważane za złoty standard dla obecności klinicznie istotnego HPV4. Jednak wykrywanie mRNA E6/E7 ze świeżej tkanki nowotworowej za pomocą techniki RT-PCR nie jest praktyczne w rutynowej praktyce klinicznej i zostało ograniczone do laboratoriów badawczych. Niedawno opracowaliśmy nowatorską technologię RNA ISH o nazwie RNAscope, która umożliwia multipleksową detekcję w pojedynczych komórkach z czułością pojedynczej cząsteczki RNA w próbkach tkanek zatopionych w parafinie utrwalonej w formalinie (FFPE)5-10. Przedstawiliśmy trzy linie dowodowe dotyczące wykrywania pojedynczych cząsteczek5. Po pierwsze, konstrukcja sondy RNAscope i system wzmacniania sygnału umożliwiły wykrywanie pojedynczych kopii genomowego DNA HER2 w liniach komórkowych HeLa i SK-BR-3. Po drugie, w porównaniu z sygnałami genomowego DNA HER2, rozkład intensywności fluorescencji kropek sygnałowych mRNA HER2 w komórkach HeLa był zgodny z jedną cząsteczką na kropkę. Po trzecie, liczba kropek sygnałowych mRNA HER2 na komórkę była ściśle zgodna z liczbą kopii mRNA HER2 oszacowaną za pomocą testu ilościowego opartego na roztworze, co dodatkowo wspiera wykrywanie pojedynczych cząsteczek. Co więcej, barwienie przeciwstawne jąder za pomocą DAPI w mikroskopii fluorescencyjnej lub hematoksyliny w mikroskopii jasnego pola umożliwia wizualizację pojedynczych jąder, co z kolei umożliwia wykrywanie i kwantyfikację celów RNA na podstawie pojedynczej komórki10. Możliwość analizy ekspresji genów in situ w rutynowych próbkach klinicznych sprawia, że RNAscope jest obiecującą platformą do diagnostyki patologii, zwłaszcza tych testów opartych na sekcjach tkanek FFPE10,11. Opracowaliśmy test HPV oparty na RNAscope do wykrywania mRNA E6/E7 siedmiu genotypów HPV wysokiego ryzyka (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52 i 58) przy użyciu puli sond specyficznych dla genotypu. Nasze ostatnie badania w OPSCC wykazały, że test RNAscope HPV jest bardzo czuły i specyficzny w określaniu statusu HPV w tkankach FFPE12-17, a także informuje o rokowaniu w OPSCC12,16.
Zasada działania technologii RNAscope została wcześniej opisana5. W tym miejscu opisujemy pełny protokół testu RNAscope i demonstrujemy jego zastosowanie w wykrywaniu HR-HPV w skrawkach tkanki nowotworowej FFPE.
Protokół
1. Próbka, sprzęt i przygotowanie odczynnika
- Pokrój próbkę tkanki na bloki o grubości 3-4 mm, utrwal w świeżej 10% neutralnie buforowanej formalinie przez 16-32 godziny w temperaturze pokojowej (25 °C) i zanurz w parafinie. Pociąć FFPE na odcinki o grubości 5±1 μm z bloków FFPE, zamontować sekcje na prowadnicach i wysuszyć na powietrzu. Uwaga: Szkiełka można przechowywać w temperaturze pokojowej w stanie wysuszenia do 3 miesięcy. Zamontowane szkiełka tkankowe należy piec w suchym pomieszczeniu w temperaturze 60 °C przez 1 godzinę przed testem RNAscope.
- Rozgrzej piekarnik do hybrydyzacji do 40 °C. Umieść papier nawilżający na tacy kontroli wilgotności. Dodaj 50 mldH2Odo bibuły nawilżającej, aby całkowicie ją zwilżyć. Włóż przykrytą blachę do piekarnika, aby rozgrzać się przez co najmniej 30 minut przed użyciem.
- Przygotować 700 ml 1x Roztwór do obróbki wstępnej 2 (10 nl, bufor cytrynianu pH 6), rozcieńczając 10 razy roztwór do obróbki wstępnej w dH2O. Podgrzej 1x roztwór do obróbki wstępnej 2 do wrzenia i utrzymuj temperaturę w zakresie 100-104 °C, zapobiegając przegotowaniu.
- Przygotować 3 l 1x bufor do płukania (0,1x SSC), rozcieńczając wstępnie podgrzany 50x bufor do płukania w dH2O.
- Przygotować 2 x 200 ml ksylenu i 2 x 200 ml 100% EtOH do odparafinowania pod wyciągiem.
- Przygotuj 50% roztwór do barwienia hematoksyliny i odczynnik do niebieszczenia (0,01% wody amoniakalnej) do barwienia po barwieniu pod wyciągiem.
- Przygotować 200 ml ksylenu, 200 ml 70% i 2 x 200 ml 100% EtOH do odwodnienia pod wyciągiem.
- Wstępnie rozgrzej sondy docelowe w temperaturze 40 °C przez 10 minut i doprowadź odczynnik RTU Detection Kit do temperatury pokojowej, w tym RTU Amp1, Amp2, Amp3, Amp4, Amp 5-Brown i Amp6-Brown, z wyjątkiem DAB Chromogen Brown-A i Brown-B.
2. Test RNAscope
Deparafinizacja i odwodnienie
Po upieczeniu, odparafinować skrawki tkanek w ksylenie przez 2 x 5 min z częstym mieszaniem, a następnie odwadniać w 100% EtOH przez 2 x 3 min z częstym mieszaniem. Suszyć na powietrzu przez 5 minut i narysować hydrofobową barierę wokół części tkanki za pomocą pisaka z barierą hydrofobową.
Zabiegi wstępne
- Inkubować skrawki tkanek za pomocą Pretreat 1 przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu wygaszenia endogennej aktywności peroksydazy, przepłukać w dH2O.
- Inkubować skrawki tkanek za pomocą Pretreat 2 utrzymywanego w temperaturze wrzenia przez 15 minut w celu pobrania RNA, płukać dwukrotnie w dH2O.
- Inkubować skrawki tkanek za pomocą Pretreat 3 przez 30 minut w temperaturze 40°C w celu trawienia białka w piecu HybEZ, płukać dwukrotnie w dH2O.
Hybrydyzacja sondy docelowej
Sondy docelowe HPV-HR 7 pula obejmują: HPV16, 18, 31, 33, 35, 52 i 58. Dodaj sondy HPV, ubikwitynę C (UBC) i sondy genowe dapB bakterii oddzielnie na trzy sąsiadujące ze sobą odcinki tkanki. Hybrydyzować w temperaturze 40 °C w piekarniku przez 2 godziny, a następnie płukać w 1x bufor do mycia przez 2 x 2 minuty w temperaturze pokojowej.
Wzmocnienie sygnału
- Inkubować skrawki tkanek za pomocą Amp1 (przedwzmacniacz) przez 30 minut w temperaturze 40 °C, Amp2 (reduktor tła) przez 15 minut w temperaturze 40 °C, Amp3 (wzmacniacz) przez 30 minut w temperaturze 40 °C i Amp4 (sonda etykietowa) przez 15 minut w temperaturze 40 °C w piecu HybEZ. Po każdym etapie hybrydyzacji płukać w 1x bufor do płukania przez 2 x 2 minuty w temperaturze pokojowej.
- Inkubować skrawki tkanek z Amp5 przez 30 minut i Amp6 przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po każdym etapie inkubacji płukać w 1x bufor do płukania przez 2 x 2 minuty w temperaturze pokojowej.
Wykrywanie sygnału
Inkubuj skrawki tkanek z mieszanką 1:1 DAB, mieszając równą objętość Brown-A i Brown-B przez 10 minut w temperaturze RT, przepłukać dwukrotnie w dH2O.
Przeciwbarwienie
Plamić skrawki tkanek 50% roztworem Hematoksyliny przez 2 minuty w temperaturze RT, płukać dH2O, aż szkiełka będą czyste, podczas gdy tkanka pozostanie fioletowa. Zanurz się w 0,01% amoniaku wdH2O przez 5 razy, a następnie 5 zanurzeń w dH2O.
Montaż na suwaku
Odwodnić skrawki tkanek w 70%, 100% i 100% EtOH przez 2 minuty każdy, ksylen przez 5 minut, zamontuj za pomocą nośnika montażowego na bazie ksylenu.
Wyniki
Procedura analizy RNAscope HPV
Test RNAscope charakteryzuje się bardzo usprawnionym schematem pracy, który jest podobny do IHC (Rysunek 1). Składa się on z czterech głównych etapów: przygotowania wstępnego, hybrydyzacji, amplifikacji sygnału i detekcji. Wykorzystuje on unikalną strategię projektowania sond, która zapewnia wysoką wierność amplifikacji sygnału5. W teście RNAscope HPV siedem zestawów sond HR-HPV jest łączonych w puli, a wszystkie są rozpoznawane przez ten sam system amplifikacji sygnału sprzężony z peroksydazą chrzanową (HRP). Specyficzne sygnały hybrydyzacji są wykrywane jako brązowe osady powstałe w wyniku chromogenicznej reakcji katalizowanej przez HRP z użyciem DAB jako substratu, co można łatwo zwizualizować za pomocą standardowej mikroskopii w polu jasnym.
Reprezentatywne barwienie w celu wykrycia HPV
Rycina 2 przedstawia przykładowe obrazy z barwionych przekrojów FFPE z nowotworu płaskonabłonkowego głowy i szyi. W przypadku HPV-dodatnim (Rycina 2A) sondy HR-HPV wykryły silne sygnały punktowe specyficznie w komórkach nowotworowych. Sonda UBC wykryła liczne punktowe sygnały cytoplazmatyczne zarówno w komórkach nowotworowych, jak i w komórkach zrębu (Rycina 2B). Sonda dla bakteryjnego genu dapB wykazała czyste tło (Rycina 2C). W przypadku HPV-ujemnym zarówno sonda HR-HPV, jak i sonda dapB nie wykryły żadnych sygnałów (Ryciny 2D oraz 2F), podczas gdy silne sygnały wykryto przy użyciu sondy UBC (Rycina 2E). W tym badaniu UBC służy jako kontrola pozytywna do oceny jakości RNA w tkance, a dapB jako kontrola negatywna dla sygnałów tła. Ocena stanu HPV polega na zbadaniu wszystkich trzech preparatów dla każdego przypadku. Poziom barwienia na preparacie kontroli negatywnej (dapB) służy jako punkt odcięcia: pozytywność HPV definiuje obecność punktowego barwienia cytoplazmatycznego i/lub jądrowego, które przekraczało poziom sygnału na preparacie dapB.
Rycina 1. Schemat analizy RNAscope. Ilustracja przebiegu analizy RNAscope. Analiza RNAscope składa się z 4 głównych etapów: wstępnego traktowania, hybrydyzacji sond docelowych, amplifikacji sygnału oraz detekcji sygnału. Cała procedura analizy może zostać ukończona w ciągu 8 hr. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.
Rysunek 2. Przykładowe obrazy preparatów barwionych metodą RNAscope. Przekroje FFPE barwione sondami przeciwko HR-HPV, UBC (kontrola pozytywna) i dapB (kontrola negatywna) z dwóch przypadków HNSCC. A-C. Przypadek HPV-dodatni. A, ekspresja mRNA HR-HPV E6/E7 w komórkach nowotworowych. Wstawka, powiększenie 40X ukazujące punktowe sygnały. B i C) sąsiednie przekroje tkankowe wykazujące odpowiednio pozytywne barwienie UBC (B) oraz negatywne barwienie dla dapB (C). D-F) Przypadek HPV-ujemny. D) brak barwienia dla mRNA HPV E6/E7, podobnie jak w negatywnej kontroli dapB (F). E) pozytywne barwienie UBC. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.
Dyskusja
Test RNAscope HPV umożliwił bezpośrednią wizualizację mRNA E6/E7 in situ w raku płaskonabłonkowym głowy i szyi związanym z HPV. Test RNAscope jest w pełni kompatybilny z rutynowo utrwaloną tkanką nowotworową i zachowuje morfologię tkanki dla korelacji histopatologicznych (ryc. 2). Kluczową zaletą testu RNAscope w porównaniu z konwencjonalnymi metodami CISH jest to, że specyficznie wzmacnia sygnały hybrydyzacji (rysunki 2B i 2E) bez wzmacniania szumu tła (ryc. 2C i 2F).
W praktyce procedura testu RNAscope HPV może zostać zakończona w ciągu 8 godzin lub wygodnie rozłożona na dwa dni. Test RNAscope HPV został wykorzystany do określenia statusu HPV w raku płaskonabłonkowym głowy i szyi12-16, wykazując 97% czułość i 93% swoistość przy użyciu qRT-PCR jako metody referencyjnej16. Konwencjonalny chromogenny ISH dla HR-HPV DNA jest wysoce specyficzny, ale ma czułość ~80%12. Barwienie immunohistochemiczne (IHC) dla komórkowego markera zastępczego p16 wykazuje doskonałą czułość, ale może generować fałszywie dodatnie wyniki15,18, szczególnie w nieustno-gardłowych nowotworach głowy i szyi15. Obecna metoda qRT-PCR "złotego standardu" do wykrywania mRNA HPV E6/E7 wymaga świeżo zamrożonej tkanki w celu uzyskania optymalnych wyników i jest technicznie złożona, co ogranicza jej zastosowanie wyłącznie do laboratorium badawczego. Ponadto wymaga ekstrakcji RNA, co uniemożliwia skorelowanie ekspresji mRNA HR-HPV E6/E7 z histopatologią.
Istnieje kilka krytycznych czynników decydujących o powodzeniu testu RNAscope. Po pierwsze, aby uzyskać najlepsze wyniki, tkanki należy utrwalić w świeżej 10% neutralnie buforowanej formalinie w temperaturze pokojowej przez 16-32 godziny zgodnie z wytycznymi ASCO/CAP19. Po drugie, piec HybEZ jest wysoce zalecany, ponieważ umożliwia optymalną kontrolę temperatury i wilgotności na etapie hybrydyzacji sondy i wzmocnienia sygnału. Po trzecie, ważne jest, aby usunąć nadmiar resztkowych przed każdym krokiem, ale nadal nie dopuścić do wyschnięcia części tkanki podczas któregokolwiek z tych etapów.
Opisana tutaj ręczna procedura RNAscope została w pełni zautomatyzowana w komercyjnym systemie automatycznego barwieniaszkiełek 10. Powinno to znacznie ułatwić standaryzację warunków testowych i zaoszczędzić cenną pracę ręczną w laboratoriach patologii klinicznej. Ponadto opracowano dedykowane oprogramowanie do analizy obrazu10 w celu automatycznej identyfikacji komórek i sygnałów barwienia na zdigitalizowanym szkiełku, co powinno pomóc w wyeliminowaniu subiektywności i poprawie odtwarzalności w punktacji.
Podsumowując, test RNAscope HPV wykrywa obecność transkryptów mRNA HR-HPV E6/E7 in situ w tkankach FFPE. Ma przepływ pracy, który jest znany z laboratoriów patologii klinicznej, umożliwiając bezpośrednią wizualizację tych elementów w sekcjach tkanek. Stanowi idealną platformę do badania próbek tkanek (FFPE) i może być łatwo zaadoptowany przez laboratoria patologii diagnostycznej.
Oświadczenia
Wszyscy autorzy są zatrudnieni i posiadają akcje w Advanced Cell Diagnostics, Inc.
Podziękowania
Częściowo wspierane przez grant NIH (R43/44CA122444) i grant DOD BRCP (W81XWH-06-1-0682) dla YL.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| SuperFrost Plus Prowadnice | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HybEZ Piekarnik, taca i stojak | Zaawansowana diagnostyka komórek | 310011, 310012, 310014 | |
| Zestaw odczynników FFPE RNAscope 2.0 - Brown | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | |
| Sonda RNAscope HPV-HR7 do zaawansowanej diagnostyki komórek HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52 i 58, E6/E7 mRNA | 312351 | ||
| ImmEdge Hydrofobowy długopis barierowy | Vector Laboratory | H-4000 | |
| 100% EtOH | American Master Tech Scientific | ALREAGAL | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
| Gill's Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | HXGHE1LT | |
| Wodorotlenek amoniaku | Sigma-Aldrich | 320145-500mL | |
| Szklana osłona 24 mm x 50 mm | Fisher Scientific | 12-545-F | |
| Płyta grzejna | Piec | ||
| 1 &stopnie; C | |||
| Łaźnia | Zdolna do utrzymywania temperatury na poziomie 40 i plusmn; 1 &stopnie; Z |
Bibliografia
- Parkin, D. M. The global health burden of infection-associated cancers in the year 2002. Int. J. Cancer. 118 (12), 3030-3044 (2006).
- Chaturvedi, A. K., et al. Human papillomavirus and rising oropharyngeal cancer incidence in the United States. J. Clin. Oncol. 29 (32), 4294-4301 (2011).
- Ang, K. K., et al. Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer. N. Engl. J. Med. 363 (1), 24-35 (2010).
- Smeets, S. J., et al. A novel algorithm for reliable detection of human papillomavirus in paraffin embedded head and neck cancer specimen. Int. J. Cancer. 121 (11), 2465-2472 (2007).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J. Mol. Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
- Liu, X., et al. Specific regulation of NRG1 isoform expression by neuronal activity. J. Neurosci. 31 (23), 8491-8501 (2011).
- Yan, K. S., et al. The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (2), 466-471 (2012).
- Payne, R. E., et al. Viable circulating tumour cell detection using multiplex RNA in situ hybridisation predicts progression-free survival in metastatic breast cancer patients. Br. J. Cancer. 106 (11), 1790-1797 (2012).
- Bordeaux, J. M., et al. Quantitative in situ measurement of estrogen receptor mRNA predicts response to tamoxifen. PLoS One. 7 (5), (2012).
- Wang, Z., et al. Automated quantitative RNA in situ hybridization for resolution of equivocal and heterogeneous ERBB2 (HER2) status in invasive breast carcinoma. J. Mol. Diagn. 15 (2), 210-219 (2013).
- Tubbs, R. R., et al. Ultrasensitive RNA in situ Hybridization for Detection of Restricted Clonal Expression of Low Abundance Immunoglobulin Light Chain mRNA in B-Cell Lymphoproliferative Disorders. Am. J. Surg. Pathol. In press, (2013).
- Ukpo, O. C., Flanagan, J. J., Ma, X. J., Luo, Y., Thorstad, W. L., Lewis, J. S. Jr. High-risk human papillomavirus E6/E7 mRNA detection by a novel in situ hybridization assay strongly correlates with p16 expression and patient outcomes in oropharyngeal squamous cell carcinoma. Am. J. Surg. Pathol. 35 (9), 1343-1350 (2011).
- Lewis, J. S. Jr., et al. Transcriptionally-active high-risk human papillomavirus is rare in oral cavity and laryngeal/hypopharyngeal squamous cell carcinomas--a tissue microarray study utilizing E6/E7 mRNA in situ hybridization. Histopathology. 60 (6), 982-991 (2012).
- Lewis, J. S. Jr., et al. Partial p16 staining in oropharyngeal squamous cell carcinoma: extent and pattern correlate with human papillomavirus RNA status. Mod. Pathol. 25 (9), 1212-1220 (2012).
- Bishop, J. A., et al. Detection of transcriptionally active high-risk HPV in patients with head and neck squamous cell carcinoma as visualized by a novel E6/E7 mRNA in situ hybridization method. Am. J. Surg. Pathol. 36 (12), 1874-1882 (2012).
- Schache AG,, et al. Validation of a novel diagnostic standard in HPV-positive oropharyngeal squamous cell carcinoma. Br. J. Cancer. 108 (6), 1332-1339 (2013).
- Mehrad, M., et al. Papillary Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck: Clinicopathologic and Molecular Features With Special Reference to Human Papillomavirus. Am. J. Surg. Pathol. Jun. , (2013).
- Jordan, R. C., et al. Validation of methods for oropharyngeal cancer HPV status determination in US cooperative group trials. Am. J. Surg. Pathol. 36, 945-954 (2012).
- Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer (unabridged version). Arch. Pathol. Lab. Med. 134 (7), 48-72 (2010).
Przedruki i uprawnienia
