Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przeprogramowanie linii komórek pochodzących z perycytów mózgu dorosłego człowieka na neurony indukowane

11.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51433

⸱

12 maja 2014

 ,  ,  , 
1Department of Physiological Genomics, Institute of Physiology, Ludwig Maximilians University Munich, 2Tumor Biology Lab, Neurosurgical Clinic, Ludwig-Maximilians University Munich, 3Institut für Biochemie, Emil-Fischer-Zentrum, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, 4Institute of Physiological Chemistry and Focus Program Translational Neuroscience, Johannes Gutenberg University Mainz

W tym artykule

Podsumowanie

Celowanie w komórki rezydujące w mózgu w celu bezpośredniego przeprogramowania linii otwiera nowe perspektywy dla naprawy mózgu. Tutaj opisujemy protokół, w jaki sposób przygotować kultury wzbogacone o perycyty rezydujące w mózgu z kory mózgowej dorosłego człowieka i przekształcić je w indukowane neurony przez ekspresję czynników transkrypcyjnych Sox2 i Ascl1 za pośrednictwem retrowirusa.

Streszczenie

Bezpośrednie przeprogramowanie komórek nieneuronalnych na neurony indukowane (iNs) może dostarczyć wglądu w mechanizmy molekularne leżące u podstaw neurogenezy i umożliwić nowe strategie modelowania in vitro lub naprawy chorego mózgu. Zidentyfikowanie typów komórek nieneuronalnych rezydujących w mózgu, które można bezpośrednio przekształcić w iNs, może pozwolić na wprowadzenie takiego podejścia in situ, tj. w uszkodzonej tkance mózgowej. W tym miejscu opisujemy protokół opracowany w celu identyfikacji komórek pochodzących z mózgu dorosłego człowieka, które spełniają to założenie. Protokół ten obejmuje: (1) hodowlę komórek ludzkich z kory mózgowej uzyskanych z biopsji mózgu dorosłego człowieka; (2) ekspansja in vitro (wymagająca około 2-4 tygodni) i charakterystyka hodowli za pomocą immunocytochemii i cytometrii przepływowej; (3) wzbogacanie poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) przy użyciu przeciwciał anty-PDGF przeciwko receptorowi β i anty-CD146; (4) transdukcja za pośrednictwem retrowirusa z neurogennymi czynnikami transkrypcyjnymi SOX2 i ASCL1; (5) i wreszcie charakterystyka powstałych neuronów indukowanych pochodzących z perycytów (PdiN) za pomocą immunocytochemii (14 dni do 8 tygodni po transdukcji retrowirusowej). Na tym etapie iN można badać ich właściwości elektryczne za pomocą rejestracji patch-clamp. Protokół ten zapewnia wysoce powtarzalną procedurę konwersji linii in vitro perycytów rezydujących w mózgu w funkcjonalne ludzkie iNs.

Wprowadzenie

W przeciwieństwie do przeprogramowania komórek somatycznych na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC), które z kolei są obdarzone mnóstwem potencjałów różnicowania, bezpośrednie przeprogramowanie ma na celu prostą konwersję jednego konkretnego typu komórki na inny. Jeśli chodzi o ich zastosowanie w kontekście modelowania chorób i potencjalnych terapii komórkowych, oba podejścia do przeprogramowywania mają określone zalety i wady. Przeprogramowanie na iPSC (i) zapewnia praktycznie nieskończone źródło komórek; (ii) pozwala na inżynierię genetyczną; (iii) obdarza niemal nieograniczonym potencjałem różnicowania. Jednak główne wady iPSC wiążą się z ryzykiem rakotwórczości niezróżnicowanych komórek (powstawanie potworniaków in vivo) oraz koniecznością hodowli ex vivo, a następnie przeszczepiania, jeśli komórki te mają być wykorzystywane w terapiach komórkowych. I odwrotnie, bezpośrednie przeprogramowanie linii jest ograniczone przez niższą wydajność pożądanych komórek, która jest bezpośrednio skorelowana z liczbą komórek docelowych w populacji wyjściowej, ale ma tę zaletę, że komórki przeprogramowane przez linię wydają się nie wykazywać ryzyka rakotwórczego po przeszczepieniu1,2; Co więcej, bezpośrednie przeprogramowanie można osiągnąć nawet in situ, tj. w narządzie, w którym komórki te byłyby wymagane, unikając w ten sposób konieczności przeszczepu.

Mając to na uwadze, nasze laboratorium badało możliwość przeprogramowania komórek rezydujących w mózgu na iNs jako nowatorskie podejście do terapii chorób neurodegeneracyjnych opartych na komórkach. Komórki rezydujące w mózgu, które mogą być potencjalnie uważane za cele komórkowe do przeprogramowania linii, obejmują różne typy makrogleju (astrocyty, komórki NG2 i oligodendrocyty), mikroglej i komórki związane z mikronaczyniami (komórki śródbłonka i perycyty). Dokładnie badaliśmy potencjał przeprogramowania in vitro astrogleju kory mózgowej myszy we wczesnym okresie postnatalnym3-5. W poszukiwaniu podobnie odpowiednich źródeł komórek do bezpośredniego przeprogramowania linii w mózgu dorosłego człowieka, natknęliśmy się na populację komórek, które można z powodzeniem przeprogramować na iN i wykazywać cechy charakterystyczne dla perycytów. Tutaj opisujemy protokół, w jaki sposób pobrać te komórki z biopsji mózgu dorosłego człowieka, aby rozszerzyć i wzbogacić te komórki in vitro, a na koniec skutecznie przeprogramować znaczną część tych rozszerzonych komórek in vitro (w zakresie 25-30%) na iNs. Przeprogramowanie można osiągnąć poprzez jednoczesną koekspresję dwóch czynników transkrypcyjnych, sox2 i ascl1, w której pośredniczy retrowirus. Stwierdzono, że te PdiN nabywają zdolność do powtarzalnego wystrzeliwania potencjału czynnościowego i służą jako cele synaptyczne dla innych neuronów, co wskazuje na ich zdolność do integracji z sieciami neuronowymi. Nasz protokół zapewnia prostą procedurę izolacji i konwersji linii perycytów mózgu dorosłego człowieka do iNs.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Izolacja i hodowla komórek mózgowych dorosłego człowieka

Eksperymenty z udziałem tkanek ludzkich powinny być przeprowadzane zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi regulacjami rządowymi i instytucjonalnymi dotyczącymi wykorzystania materiału ludzkiego do celów badawczych. Niniejszy protokół został opracowany zgodnie z aprobatą komisji etycznej Wydziału Medycznego LMU w Monachium i pisemną świadomą zgodą wszystkich pacjentów.

Ten protokół przygotowania kultur ludzkiej dorosłej kory mózgowej został opracowany przy użyciu próbek pacjentów obu płci cierpiących na padaczkę skroniową lub inne głęboko osadzone, nieurazowe, niezłośliwe zmiany. Tkanka pobrana z sali operacyjnej stanowiła wyłącznie kanał dostępowy do uszkodzenia mózgu i dlatego jest uważana za zdrową. Przedział wiekowy pacjentów wynosił 19-70 lat.

  1. Przygotuj pożywkę wzrostową, dodając inaktywowaną termicznie płodową surowicę cielęcą (FCS) do DMEM o wysokiej zawartości glukozy za pomocą GlutaMAX, aby uzyskać końcowe stężenie 20% FCS. Dodać 5 ml penicyliny/streptomycyny do łącznie 500 ml pożywki wzrostowej. Wykonaj ten i wszystkie kolejne kroki wymagające sterylnych warunków hodowli w odpowiednim okapie z przepływem laminarnym.
  2. Biopsję mózgu dorosłego człowieka uzyskaną na sali operacyjnej należy przechowywać w zrównoważonym roztworze soli Hanksa z pożywką CaCl2 i MgCl2 (HBSS), w tym HEPES (10 mM stężenie końcowe) na lodzie do czasu przetworzenia. Rozpocznij przetwarzanie tak szybko, jak to możliwe.
  3. Aby rozpocząć dysocjację na pojedyncze komórki, przenieś tkankę na szalkę Petriego o średnicy 65 mm i zmiel na małe kawałki za pomocą dwóch sterylnych skalpeli jednorazowego użytku. Do trawienia enzymatycznego należy użyć 3-6 ml TrypLE w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i inkubować przez 15-30 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
  4. Dodać 1 objętość wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej w celu ułatwienia dysocjacji i delikatnie rozprowadzić roztwór zawierający kawałki tkanki w górę i w dół, najpierw używając jednorazowej pipety o pojemności 5 ml, a następnie używając szklanej pipety Pasteura aż do homogenizacji zawiesiny komórek. Zazwyczaj niektóre resztkowe fragmenty tkanki, składające się głównie z istoty białej, pozostają w zawiesinie.
  5. Wirować w temperaturze 157 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić osad w odpowiedniej ilości podłoża wzrostowego (10 ml na niepowlekaną kolbę hodowlaną T75). Do biopsji o średnicy 5-10 mm należy użyć jednej kolby hodowlanej T75 i z niej ekstrapolować w przypadku większych próbek.
  6. Umieścić komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 i 5% O2 .
  7. Wymieniaj połowę pożywki co 3-4 dni, aż komórki osiągną zbieg. Zwykle trwa to do dwóch tygodni (określane jako przejście 0 [P0]).

2. Ekspansja in vitro i charakterystyka komórek mózgowych dorosłego człowieka

  1. Ekspansja in vitro:
    1. Odessać pożywkę hodowlaną i przemyć solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), przechowywaną w temperaturze pokojowej, przed dodaniem 3 ml TrypLE.
    2. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut, aż większość komórek się odłączy. Delikatnie postukać w kolby, aby ułatwić podnoszenie komórek; Po dodaniu 3 objętości pożywki wzrostowej, przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wirować w dół przy 157 x G przez 5 minut, a następnie ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej ilości pożywki wzrostowej.
    3. Pasaż komórek w stosunku 1:3 w celu uzyskania optymalnej wydajności do nowych kolb do hodowli komórkowych T75.
      Uwaga: Przeszliśmy te komórki aż do P5 bez żadnych oznak zmniejszonej wydajności przeprogramowywania. O ile w P0 hodowla zawiera znaczną frakcję komórek śródbłonka (ocenianą na podstawie ekspresji CD34), o tyle przy kolejnych pasażach ich liczba staje się znikoma.
  2. Charakterystyka kultur mózgu dorosłego człowieka:
    1. Immunocytochemia:
      1. W celu scharakteryzowania komórek, wysiewaj ~ 60 000 komórek na szkiełkach nakrywkowych pokrytych poli-D-lizyną w 500 μl świeżej pożywki wzrostowej na 24-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych i inkubuj w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i 5% O2 .
      2. Do analizy immunocytochemicznej hodowanych ludzkich komórek mózgowych należy usunąć pożywkę i przemyć 3x 1 ml PBS.
      3. Utrwal komórki, dodając 500 μl 4% paraformaldehydu w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
      4. Przenieś szkiełka szklanej pokrywy do odpowiedniej wilgotnej komory barwienia i zablokuj 80 μl PBS zawierającej 3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 0,5% Triton X-100 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
      5. Dodać przeciwciała pierwszorzędowe rozcieńczone w tym samym roztworze (współczynniki rozcieńczenia znajdują się w tabeli określonych odczynników i wyposażenia) i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C lub 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
        Uwaga: Znaczna, ale zmienna część komórek na tym etapie hodowli jest immunoreaktywna na β receptora płytkowego czynnika wzrostu (PDGFRβ), klaster różnicowania 146 (CD146), proteoglikan siarczanu chondroityny NG2 i aktynę mięśni gładkich (SMA), tj. markery charakterystyczne dla perycytów związanych z mikronaczyniami. Tylko mniejszość (<1%) wykazuje ekspresję markerów astrogleju: kwaśnego białka fibrylarnego gleju (GFAP) i S100β. Ponadto na tym etapie hodowla powinna być pozbawiona jakichkolwiek komórek wykazujących ekspresję markera neuronalnego βIII-tubuliny. Użyj wielu kombinacji przeciwciał pierwszorzędowych do wspólnego znakowania różnych markerów. Dalsze potwierdzenie ekspresji markerów glejowych, neuronalnych, śródbłonka i perycytów można uzyskać za pomocą odwrotnej transkrypcji i ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (nieopisanej w tym protokole).
      6. Po inkubacji z przeciwciałami pierwszorzędowymi przemyć trzykrotnie 1 ml PBS i dodać odpowiednie przeciwciała drugorzędowe (w odpowiednich rozcieńczeniach) do roztworu barwiącego i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Umyj komórki 3x PBS. W razie potrzeby przed montażem należy zabarwić go DAPI przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
      7. Użyj środka montażowego zapobiegającego blaknięciu i przeanalizuj szkiełka nakrywkowe za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego lub mikroskopu konfokalnego.
    2. Cytometria przepływowa:
      1. W celu analizy ekspresji markera powierzchniowego za pomocą cytometrii przepływowej, hoduj komórki do konfluencji w niepowlekanych kolbach do hodowli komórkowych T25 lub T75.
      2. Odłączyć komórki za pomocą TrypLE zgodnie z wcześniejszym opisem i ponownie zawiesić w roztworze barwiącym składającym się z PBS + 0,5% BSA. Na reakcję barwienia ponownie zawieś 100 000-200 000 komórek w 100 μl roztworu barwiącego. Przygotować pojedyncze reakcje barwienia dla każdego użytego przeciwciała (CD146-FITC, CD140b-PE, CD34-APC, CD13-FITC, odpowiednie przeciwciała kontrolne izotypu).
      3. Dodać przeciwciała sprzężone z fluorochromem do każdego roztworu barwiącego (w celu rozcieńczenia, patrz tabela określonych odczynników i sprzętu) bezpośrednio do zawiesiny komórkowej i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut w ciemności.
      4. Przemyć komórki trzykrotnie 500 μl PBS i odwirowywać między każdym etapem płukania przy 157 x g przez 5 minut.
      5. Zawiesić osad komórkowy w 0,5-1 ml roztworu barwiącego i przenieść komórki przez sitko do komórek (70 μm) do probówek FACS. Chronić próbkę przed działaniem światła.
      6. Wiruj próbki przed umieszczeniem ich w instrumencie FACS.
      7. Aby przeanalizować żywe komórki i wykluczyć szczątki i agregaty komórek, należy zastosować bramkę dla FSC-A i SSC-A. Duplikaty komórek są specjalnie bramkowane przez FSC-A i FSC-W. Aby określić właściwe warunki bramkowania dla markerów powierzchni komórki, należy ustawić bramki z kontrolą przeciwciał dopasowanych do izotypu sprzężonych z odpowiednim fluorochromem. Następnie określ proporcję komórek związanych z przeciwciałami.

3. Wzbogacanie komórek pochodzących z pericytów przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją

  1. Oczyść populację komórek perycytów (zawieszonych w pożywce wzrostowej) przed transdukcją poprzez sortowanie FACS za pomocą dyszy 70 μm. Użyj CD34-APC w połączeniu z CD140b-PE i CD146-FITC, aby wybrać perycyty. Sortuj według komórek CD34-ujemnych, CD140b i CD146-dodatnich.
  2. Zebrać posortowane komórki w pożywce wzrostowej i rozłożyć na szkiełkach nakrywkowych pokrytych poli-D-lizyną na 24-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i 5 %O2 .
  3. Po upływie 48 godzin od sortowania zastąpić pożywkę świeżą pożywką wzrostową i przeprowadzić transdukcję zgodnie z opisem w protokole 4.

4. Transdukcja retrowirusowa komórek pochodzących z pericytów i przeprogramowanie na neurony indukowane

Uwaga: Zapoznaj się z lokalnymi wytycznymi bezpieczeństwa biologicznego podczas obchodzenia się z cząstkami retrowirusowymi. W Niemczech stosowanie retrowirusów wymaga 2. poziomu bezpieczeństwa biologicznego. Informacje na temat produkcji cząstek retrowirusowych znajdują się w protokole6. Aby zapoznać się z konstruktami retrowirusowymi używanymi do przeprogramowania, zapoznaj się z Karow et al. (2012) . Retrowirusy były pseudotypowane za pomocą VSV-G (wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej – glikoproteina)5. Dla produkcji patrz Gavrilescu i wsp. 6.

  1. 24 godziny przed transdukcją retrowirusową wysiew ~ 60 000 komórek na szkle pokrytym poli-D-lizyną szkiełka nakrywkowe w 500 μl świeżej pożywki wzrostowej na 24-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych i inkubuj w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i 5% O2 .
  2. Następnego dnia zastąp pożywkę wzrostową 500 μl świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej i dodaj 1 μl odpowiednich skoncentrowanych supernatantów zawierających cząstki retrowirusowe (pCAG-IRES-dsred do kontroli, szczególnie podczas ustalania protokołu w laboratorium), pCAG-ascl1-IRES-dsred, pCAG-sox2-IRES-gfp.
  3. Dzień później usuń pożywkę wraz z cząsteczkami wirusa z komórek i dodaj 1 ml świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki różnicującej B27, składającej się z 49 ml DMEM o wysokiej zawartości glukozy z GlutaMAX i 1 ml suplementu B27 bez surowicy. Utrzymywać komórki w hodowli w temperaturze 37 °C w 5% CO2 i 5%O2 przez 4-8 tygodni bez zmiany pożywki, ponieważ powtarzające się zmiany pożywki stają się szkodliwe w miarę dojrzewania iN.

5. Charakterystyka neuronów indukowanych za pomocą immunocytochemii

  1. W celu określenia tożsamości komórkowej transdukowanych komórek, w szczególności w celu wykazania nabycia fenotypu neuronalnego, należy przeprowadzić immunocytochemię przeciwko antygenom neuronalnym, takim jak bIII-tubulina, MAP2 i NeuN (dla przeciwciał i ich odpowiednich rozcieńczeń, patrz tabela specyficznych odczynników i sprzętu; postępuj zgodnie z tą samą procedurą, jak wskazano w 2.2.1).
  2. Aby poprawić dojrzewanie PdiN, należy hodować te komórki razem z neuronami pochodzącymi z kory mózgowej myszy E14. W tym celu należy rozciąć korę mózgową i mechanicznie oddzielić tkankę za pomocą wypolerowanej ogniowo szklanej pipety Pasteura. Dodaj 10 000-50 000 mysich neuronów do kultur komórek pochodzących z pericytów 2-3 tygodnie po transdukcji retrowirusami kodującymi sox2 i ascl1 i kontynuuj hodowlę. Transdukowane komórki można odróżnić od neuronów mysich na podstawie ich ekspresji reporterowej (GFP i dsRed), albo przez żywą epifluorescencję, albo po immunocytochemii dla GFP i dsRed.
  3. Aby ocenić tworzenie synaps na PdiN przez neurony mysie, należy przeprowadzić immunocytochemię przeciwko pęcherzykowym receptorom neuroprzekaźników, takim jak pęcherzykowy transporter glutaminianu 1 (vGluT1).
  4. Sonda transdukowała komórki pod kątem ich właściwości elektrycznych (tj. zdolności do generowania potencjałów czynnościowych) i tworzenia funkcjonalnych synaps za pomocą elektrofizjologii patch-clamp. Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat procedury, patrz Heinrich et al. (2011) .

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pierwszym wynikiem niniejszego protokołu po pomyślnym ustanowieniu hodowli z próbki ludzkiej kory mózgowej dorosłego człowieka jest identyfikacja składu komórkowego hodowli. Immunocytochemia w kierunku białek specyficznych dla poszczególnych typów komórek wykazuje znaczny stopień heterogeniczności pomiędzy hodowlami pochodzącymi z próbek od różnych pacjentów (Rycina 1A). Jak określono za pomocą cytometrii przepływowej, zawsze występuje istotna frakcja komórek wykazujących ekspresję PDGFRβ (średnio ~75%, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejszy protokół opisuje in vitro ekspansję i wzbogacanie komórek pochodzących z perycytów po izolacji z kory mózgowej dorosłego człowieka, a następnie przekształceniu w iNs przez ekspresję neurogennych czynników transkrypcyjnych Sox2 i Ascl1 za pośrednictwem retrowirusa. Taki protokół zapewnia eksperymentalny system in vitro do badania konwersji linii komórek rezydujących w mózgu w neurony, a potencjalnie także w komórki glejowe, mając na celu ostateczne przełożenie tego bezpośredniego podejścia do k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni dr Magdalenie Götz za jej wkład podczas opracowywania tego protokołu. Dziękujemy dr Mariusowi Wernigowi (Uniwersytet Stanforda) za hojne udostępnienie nam sekwencji kodowania sox2. Jesteśmy również bardzo wdzięczni dr Alexandrze Lepier za produkcję wirusa. Prace te były wspierane przez granty Deutsche Forschungsgemeinschaft (BE 4182/2-2) i BMBF (01GN1009A) dla B.B., a Bawarskie Ministerstwo Nauki, Badań Naukowych i Sztuki dla M.K. i B.B. C.S. otrzymało finansowanie z dwunarodowego Wirtualnego Instytutu SYSTHER-INREMOS (niemieckie i słoweńskie federalne ministerstwa edukacji i badań naukowych) oraz DFG (SFB 824).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
anty-CD140b-PEBD Biosciences558821stosować
anty-CD146-FITCAbD SerotecMCA2141FTskali 1:100
AbD SerotecMVA1270A488Tskali 1:100
anty-PDGFR
βSygnalizacja komórkowa3169Sużyj 1:200
anty-CD146AbcamAb75769użyj 1:400
anty-NG2MilliporeAB5320użyj 1:400
anty-SMASigma-AldrichA2547użyj 1:400
anty-β III-tubulinaSigma-AldrichT8660zastosowanie
anty-MAP2 1:400 użycie anty-MAP2Sigma-AldrichM4403użycie 1:200
anty-GFAPSigma-AldrichG3893użycie 1:600
anty-GFPAves LabsGFP 10-20użycie 1:1,000
anty-RFPChromotek5F8użycie 1:500
anty-S100βSigma-AldrichS2532użyj 1:300
anty-NeuNMilliporeMAB377użyj 1:200
anty-GABASigma-AldrichA2052użyj 1:500
anty-kalretyninyMilliporeAB5054użyj 1:500
anty-vGluT1SYstemy SYnattyczne135511użyj 1:1,000
Kontrola izotypu IgG1 szczura FITCAbD Serotec11-4301-81zastosowanie 1:100
Kontrola izotypu IgG1 szczura PEAbD Serotec12-4301-81zastosowanie 1:100
Kontrola izotypu IgG1 szczura APCAbD Serotec17-4301-81zastosowanie 1:100
TrypLEInvitrogen12605-010
DMEM, wysoka glukoza, GlutaMAXInvitrogen61965
B27 suplement bez surowicyInvitrogen
płodowej surowicy cielęcejInvitrogen10106-169przeprowadzić inaktywację cieplną przez inkubację w temperaturze 56 &; C przez 30 min
Penicylina-streptomycynaInvitrogen15140122
HBSS (Hanks Balanced Salt Solution)Invitrogen24020-091
PBS firmy Dulbecco bez CaCl2 i MgCl2 (D-PBS, 1x)Invitrogen14190
HEPESSigma-AldrichH3375
Poli-D-lizyna bromowodorek (PDL)Sigma-AldrichP0899
PFA (paraformaldehyd)Sigma-AldrichP1648
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA9418
Triton X-100Sigma-AldrichT9284
DAPI (4′,6-Diamidin-2-fenyloindol) dilactanSigma-Aldrich042M4005
Aqua-Poly/ MountPolysciences18606-20
Rury z okrągłym dnem z polipropylenu BD Biosciences352063
Polistyrenowe rurki okrągłodenne z nakrętką z sitkiem komórkowym BD Biosciences352235
24-dołkowe płytkiOrange Scientific5530305
75 cm2 termosyGreiner Bio-One658175
25 cm2Greiner Bio-One690175
Pipety jednorazowe 10 mlSarstedt86.1254.001
Szklany Pasteur pipety (150 mm)FisherbrandFB50251
Szkiełka nakrywkowe szklane o średnicy 12 mmMenzelCB00120RA1
Chirurgiczne skalpele jednorazowe B. Braun5518083
Naczynia do hodowli tkankowych Greiner Bio-One633180
Probówki stożkowe 15 mlBD Biosciences352095
Okap
Wirówka i rotor wychylny z adapterami do probówek 15 ml i 50 mlHettich Lab Technology1406
Sortownik komórek do cytometrii przepływowej: FACSAria l z oprogramowaniem FACSDiva BD Biosciences
Humifikowany inkubator do hodowli komórkowychEppendorf Galaxy 170R
Wanher wanna w 37 & stopni; C
FACSPodcień do osłonek dolnych BD Biosciences342003
Mikroskop epifluorescencyjny BX61Olympus
Mikroskop konfokalny LSM710Zeiss
stosować anty-CD13-FITC w stosować anty-CD34-APC w 17504044 termosy z przepływem laminarnym

Bibliografia

  1. Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
  2. Kim, J., et al. Functional integration of dopaminergic neurons directly converted from mouse fibroblasts. Cell stem cell. 9, 413-419 (2011).
  3. Duan, B., et al. Interactions between water deficit, ABA, and provenances in Picea asperata. Journal of experimental botany. 58, 3025-3036 (2007).
  4. Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biol. 8, (2010).
  5. Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat Protoc. 6, 214-228 (2011).
  6. Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. , (2007).
  7. Karow, M., et al. Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells. Cell stem cell. 11, 471-476 (2012).
  8. Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6, 1847-1859 (2011).
  9. Ladewig, J., et al. Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts. Nat Methods. 9, 575-578 (2012).
  10. Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).
  11. Davila, J., Chanda, S., Ang, C. E., Sudhof, T. C., Wernig, M. Acute reduction in oxygen tension enhances the induction of neurons from human fibroblasts. J Neurosci Methods. 216, 104-109 (2013).
  12. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463, 1035-1041 (2010).
  13. Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 10343-10348 (2011).
  14. Lu, J., et al. Generation of Integration-free and Region-Specific Neural Progenitors from Primate Fibroblasts. Cell Rep. 3, 1580-1591 (2013).
  15. Yang, N., Ng, Y. H., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M. Induced neuronal cells: how to make and define a neuron. Cell Stem Cell. 9, 517-525 (2011).
  16. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476, 220-223 (2011).
  17. Yoo, A. S., et al. MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons. Nature. 476, 228-231 (2011).
  18. Son, E. Y., et al. Conversion of mouse and human fibroblasts into functional spinal motor neurons. Cell Stem Cell. 9, 205-218 (2011).
  19. Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 2527-2532 (2012).
  20. Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10, 473-479 (2012).
  21. Yang, N., et al. Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion. Nat Biotechnol. 31, 434-439 (2013).
  22. Najm, F. J., et al. Transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to expandable, myelinogenic oligodendrocyte progenitor cells. Nat Biotechnol. 31, 426-433 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Cytometria przep ywowasortowanie kom rek aktywowane fluorescencjtransdukcja retrowirusowaimmunocytochemiarejestracja patch clampprzeciwcia o przeciwko PDGFR betaprzeciwcia o przeciwko CD146
Przeprogramowanie linii komórek pochodzących z perycytów mózgu dorosłego człowieka na neurony indukowane
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.