Prosty i szybki protokół pomiaru neutralnych lipidów w komórkach glonów za pomocą fluorescencji

Podsumowanie

Opisany jest prosty protokół do określania neutralnej zawartości lipidów w komórkach glonów za pomocą procedury barwienia czerwienią Nilu. Ta oszczędzająca czas technika stanowi alternatywę dla tradycyjnych protokołów kwantyfikacji lipidów opartych na grawimetrii. Został zaprojektowany z myślą o konkretnym zastosowaniu monitorowania wydajności bioprocesów.

Streszczenie

Algi są uważane za doskonałych kandydatów na odnawialne źródła paliwa ze względu na ich naturalne zdolności magazynowania lipidów. Solidne monitorowanie procesów fermentacji glonów i badania przesiewowe w poszukiwaniu nowych szczepów bogatych w olej wymaga szybkiego i niezawodnego protokołu oznaczania zawartości lipidów wewnątrzkomórkowych. Obecne praktyki opierają się w dużej mierze na metodach grawimetrycznych do oznaczania zawartości oleju, technikach opracowanych dziesiątki lat temu, które są czasochłonne i wymagają dużych objętości próbek. W tym artykule czerwień nilowa, barwnik fluorescencyjny, który został użyty do identyfikacji obecności ciał lipidowych w wielu typach organizmów, został włączony do prostego, szybkiego i niezawodnego protokołu pomiaru neutralnej zawartości lipidów w Auxenochlorella protothecoides, zielonej aldze. Metoda wykorzystuje etanol, stosunkowo łagodny rozpuszczalnik, do przepuszczalności błony komórkowej przed barwieniem oraz 96-dołkową mikropłytkę w celu zwiększenia pojemności próbki podczas pomiarów intensywności fluorescencji. Został zaprojektowany z myślą o konkretnym zastosowaniu monitorowania wydajności bioprocesów. W teście można wykorzystać wcześniej wysuszone próbki lub żywe próbki z rosnącej kultury.

Wprowadzenie

Ze względu na ich zdolność do magazynowania ciał lipidowych w pewnych warunkach stresu, glony zyskały w ostatnich latach wiele uwagi jako potencjalne źródło paliwa odnawialnego^1,2. Neutralne lipidy mogą stanowić ponad 60% suchej masy komórki w odpowiednich warunkach wzrostu³. Jednak przemysł nie ma prostego, czystego, szybkiego i niezawodnego ustandaryzowanego protokołu do ilościowego oznaczania zawartości lipidów w komórkach glonów w celu prawidłowego monitorowania wydajności bioprocesów, analizowania kultur i badań przesiewowych w poszukiwaniu nowych szczepów.

Metoda grawimetryczna Bligh-Dyera, opracowana około 50 lat temu, pozostaje jedną z najczęściej używanych technik dzisiaj^4,5. Chociaż procedura ta jest prosta, niezawodna i łatwa do przeprowadzenia, jest czasochłonna, wymaga dużych objętości próbek i wykorzystuje toksyczne rozpuszczalniki. Nie jest to praktyczne w przypadku analizy wielu próbek z przebiegu fermentacji lub przesiewania w poszukiwaniu nowych szczepów bogatych w olej. Opracowano inne metody, ale zwykle wymagają one zaawansowanego sprzętu i nie zostały ustandaryzowane⁶.

Alternatywą, która wzbudziła duże zainteresowanie, jest plama Nilu Czerwona. Czerwień nilowa, barwnik, który preferencyjnie fluoryzuje w środowiskach niepolarnych, został użyty do identyfikacji lub ilościowego określenia ciał lipidowych w różnych organizmach, w tym nicieniach⁷, drożdżach⁸, bakteriach⁹ i algach^10-19. Początkowe techniki z wykorzystaniem czerwieni nilowej były głównie jakościowe lub półilościowe, łącząc barwienie ze spektrofotometrią jednokuwetową lub cytometrią przepływową. Ponadto niektóre klasy glonów, takie jak zielone algi, mają grube dobytki komórkowe, które są w większości nieprzepuszczalne dla barwnika, co ograniczało zakres tej techniki¹⁰.

Ostatnie ulepszenia metody barwienia czerwienią Nilu zostały zgłoszone, aby ominąć początkowe niedociągnięcia protokołu^10,11. Barwienie komórek w obecności rozpuszczalnika nośnikowego, takiego jak DMSO¹⁰ lub etanol^10,11, linearyzuje zależność między zawartością oleju a absorbancją, umożliwiając wiarygodne pomiary ilościowe. Rozpuszczalnik pomaga przeniknąć przez błonę komórkową, dzięki czemu cząsteczki czerwieni nilowej mogą przez nią przejść. Ponadto zastosowanie spektrofotometru z możliwością odczytu mikropłytek umożliwia stosowanie protokołów o wysokiej przepustowości odpowiednich do analizy ilościowej.

W tym artykule szczegółowo opisujemy prostą metodę pomiaru zawartości oleju w komórkach glonów poprzez barwienie kultur czerwienią nilową w obecności etanolu, łagodnego rozpuszczalnika. W celu jak najdokładniejszego uwzględnienia szumu tła w pomiarach, przy użyciu komórek glonów o znanym składzie oleju opracowano standardową krzywą korelacji intensywności fluorescencji z zawartością oleju. Metoda jest zaadaptowana z wcześniej opublikowanych protokołów^10,11. Korzystając z 96-dołkowego spektrofotometru, można przeanalizować taką samą ilość próbek w ciągu godziny, która zajęłaby kilka dni do monitorowania metodami grawimetrycznymi. Ponadto, dzięki kalibracji przy użyciu reprezentatywnych próbek pożądanych gatunków glonów, metoda ta pozwala uzyskać stosunkowo precyzyjne pomiary, które można bezpośrednio zinterpretować. Istnieje wiele protokołów przedstawiających metody barwienia glonów czerwienią nilową zoptymalizowane dla różnych szczepów i zastosowań; przedstawiony tutaj protokół został pierwotnie opracowany przez de la Hoz Siegler i wsp.¹¹ dla Auxenochlorella protothecoides, Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus i Scenedesmus obliquus, chociaż prawdopodobnie nadaje się do wielu innych gatunków i klas. Został zaprojektowany z myślą o monitorowaniu wydajności bioprocesów i działa równie dobrze w przypadku próbek wcześniej wysuszonych, jak i próbek mokrych z hodowli.

Protokół

1. Izolacja suchej biomasy glonów jako wzorce odczytów fluorescencji

1. Usunąć objętość próbki z rosnącej kultury glonów, która dostarczy co najmniej 200 mg suchej biomasy, preferowane jest 400-600 mg.
2. Odwirować próbkę w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 10 000 x g. Odrzucić supernatant i przemyć osad równą objętością buforu fosforanowego o tym samym pH co pożywka wzrostowa.
3. Powtórz krok 1.2, aby uzyskać łącznie 3 etapy prania.
4. Ponownie zawiesić osad w wodzie dejonizowanej i przenieść do wstępnie zważonego naczynia wagowego. Pozostaw do wyschnięcia w temperaturze 50 °C przez 48 godzin. UWAGA: Suszenie w próżni skróci czas suszenia, a suszenie kultury w temperaturach powyżej 50 °C może utrudnić ponowne zawieszenie.
5. Przechowuj wysuszone kultury glonów w temperaturze pokojowej do wykorzystania w przyszłości.

2. Grawimetryczna kwantyfikacja neutralnych lipidów metodą ekstrakcji heksanu (na podstawie Bligh i Dyer⁴)

1. Odmierzyć około 50 mg suchej biomasy glonów w naczyniu wagowym. UWAGA: Masy w zakresie 40-80 mg mogą być stosowane bez utraty odtwarzalności.
2. Przenieś biomasę do zaprawy wstępnie umytej heksanem. W razie potrzeby umyć naczynie wagowe niewielką ilością (1 ml) heksanu za pomocą pipety Pasteura w celu całkowitego przeniesienia biomasy do moździerza. UWAGA: Heksan jest substancją wysoce lotną i toksyczną. Należy się z nim obchodzić w dygestorium w odpowiedniej odzieży ochronnej.
3. Miel biomasę glonów przez 5 minut za pomocą tłuczka. Zacznij od delikatnego mielenia i stopniowo zwiększaj intensywność. Zmiel biomasę na drobną i gładką pastę w ciągu 5 minut. Jeśli podczas przenoszenia biomasy do zaprawy używa się nadmiaru heksanu, najlepiej poczekać, aż heksan odparuje przed mieleniem.
4. Dodaj kilka ml heksanu do moździerza i wymieszaj powstałą zawiesinę z tłuczkiem, aż się zhomogenizuje. Upewnij się, że wszystkie resztki komórek przyklejone do ścianek zaprawy zostały odbite i zawieszone w cieczy.
5. Przenieść mieszaninę masy heksanowo-komórkowej do probówki wirówkowej. UWAGA: Probówka wirówkowa musi być wykonana ze szkła lub odpowiedniego polimeru kompatybilnego z heksanem, takiego jak teflon.
6. Powtarzaj kroki 2.4 i 2.5, aż cała biomasa zostanie przeniesiona do probówki wirówkowej (3-5x).
7. Odwirować próbkę w temperaturze 4 °C przez 20 minut przy 10 000 x g.
8. Ostrożnie odpipetować supernatant do wstępnie zważonego metalowego naczynia wagowego. Przechowywać w dygestorium.
9. Wykonaj 2. ekstrakcję heksanu, dodając 3 ml heksanu do granulki i energicznie wirując przez 1 minutę.
10. Powtórz kroki 2.7 i 2.8. W razie potrzeby należy umieścić próbki w wirówce przez 30 minut podczas drugiej ekstrakcji, aby upewnić się, że wszystkie resztki komórek całkowicie się osadzą. Określić masę oleju ekstrahowanego grawimetrycznie po całkowitym odparowaniu heksanu.

3. Fluorometryczna kwantyfikacja neutralnych lipidów przy użyciu czerwieni nilowej (zgłoszona przez de la Hoz Siegler et al.¹¹)

UWAGA: Do odczytu fluorescencji potrzebne jest tylko 10 μl zawiesiny glonów o stężeniu 5 g/L. Ogólnie rzecz biorąc, izolacja suchej biomasy glonów z 1,5 ml bulionu hodowlanego jest więcej niż wystarczająca. Również natężenie światła lampy w spektrofotometrze może z czasem ulec pogorszeniu. Zaleca się uwzględnianie wzorców w każdym eksperymencie, aby upewnić się, że zmiany w instrumencie nie dodają niepotrzebnych błędów do pomiarów.

1. Przygotować roztwór czerwieni nilowej o stężeniu 10 μg/ml rozpuszczony w alkoholowym odczynniku etanolowym. Roztwór należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C.
2. Przygotować 30% (v/v) roztwór etanolu w wodzie dejonizowanej i przechowywać w temperaturze 4 °C.
3. Przygotować wszystkie próbki glonów o tym samym stężeniu biomasy (zalecane jest 5 g/l) i w taki sam sposób, jak wzorce użyte w pomiarze. W tym celu należy zawiesić wstępnie wysuszone próbki w odpowiedniej ilości buforu fosforanowego (0,6 g/l dwuzasadowego fosforanu potasu, 1,4 g/l jednozasadowego fosforanu potasu) lub dostosowując stężenie rosnącej kultury glonów do 5 g/l za pomocą buforu fosforanowego po zmierzeniu zmętnienia. UWAGA: pomiary wykonywane na żywych kulturach glonów często będą miały większy błąd związany z nimi, w zależności od precyzji krzywej kalibracji zmętnienia. Ponowne zawieszenie wysuszonych próbek może wymagać użycia homogenizatora w celu pełnego rozproszenia biomasy.
4. Dla każdej próbki wymieszać 80 μl 30% roztworu etanolu, 10 μl roztworu czerwieni nilowej i 10 μl zawiesiny glonów w jednym dołku na 96-dołkowej płytce. W celu prawidłowego uwzględnienia zmienności pomiaru fluorescencji należy wykonać 5 powtórzeń każdej próbki.
5. Przeprowadź dwupunktową krzywą kalibracyjną z wcześniej przygotowanymi wzorcami, aby uwzględnić codzienne zmiany w przyrządzie i przygotowaniu. Przygotować wzorce do pomiaru fluorescencji, stosując tę samą procedurę, co próbki. UWAGA: Generalnie do ponownej kalibracji przyrządu wystarczą dwa punkty, trzy punkty można uruchomić w celu sprawdzenia liniowości.
6. Wykonaj pomiary fluorescencji w spektrofotometrze z wielodołkowym czytnikiem płytek. Stwierdzono, że następujące warunki dają najbardziej spójne wyniki¹¹:
   1. Wstrząsać z prędkością 1 200 obr./min, orbita 3 mm, przez 30 sek.
   2. Inkubować w temperaturze 40 °C przez 10 minut.
   3. Wstrząsać z prędkością 1 200 obr./min, orbita 3 mm, przez 30 sek.
   4. Zapis fluorescencji, wzbudzenia przy 530 nm, emisji przy 604 nm.
7. Przelicz pomiary fluorescencji na zawartość oleju, korzystając z wyników z wzorców wewnętrznych.

4. Technika mikroskopii fluorescencyjnej

UWAGA: Protokół barwienia opisany w sekcji 3 jest przeznaczony do analizy ilościowej, ale może być również przydatny do dostarczania wizualnych reprezentacji technik opartych na barwieniu w celach edukacyjnych i ilustracyjnych. Do uzyskania obrazów fluorescencji próbki potrzebny jest mikroskop optyczny z tradycyjną transmisją oraz dodatkowymi źródłami oświetlenia epifluorescencyjnego. Do barwienia czerwieni nilowej potrzebne są filtry światła wzbudzenia i emisji odpowiednio w zakresie 530 nm (zielony) i 604 nm (czerwony), a także kamera zamontowana na mikroskopie z powiązanym oprogramowaniem. Obrazy pokazane w tym badaniu (ryc. 1) zostały uzyskane przy użyciu mikroskopu jasnego pola wyposażonego w kamerę i konwerter monochromatyczny na RGB. Procedura tworzenia obrazów fluorescencji czerwieni nilowej przy użyciu tych narzędzi jest opisana poniżej:

1. Przygotować próbkę kultury z czerwonym barwnikiem nilowym zgodnie z sekcją 3 protokołu. UWAGA: próbka o stężeniu 5 g/l wytwarza szkiełka o odpowiedniej gęstości komórek bez nadmiernego przepełnienia.
2. Po wykonaniu kroku 3.6 protokołu barwienia należy przygotować szkiełko mikroskopowe z przetworzonej próbki zgodnie ze standardowymi procedurami laboratoryjnymi.
3. Zaczynając od mikroskopu w trybie transmisyjnym, załaduj przygotowany szkiełko do mikroskopu i zlokalizuj komórki pod żądanym powiększeniem (obrazy pokazane w tym artykule zostały uzyskane za pomocą obiektywu 100X).
4. Po ustawieniu ostrości przełącz mikroskop z trybu oświetlenia transmisyjnego na epifluorescencyjny. Źródło światła powinno teraz pochodzić bezpośrednio z soczewki obiektywu (można to potwierdzić wizualnie, obserwując przestrzeń między szkiełkiem a soczewką obiektywu).
5. Włóż zielony filtr wzbudzenia do źródła światła, a czerwony filtr emisyjny do obserwacyjnej ścieżki światła; fluorescencja zabarwionych komórek powinna być teraz bezpośrednio widoczna przez okular.
6. Przełącz tryb obserwacji mikroskopowej z okularu na zamontowaną kamerę i użyj viewoprogramowanie do przechwytywania obrazu komórek fluoryzujących. W zależności od czułości aparatu, próbka może początkowo nie pojawić się w oknie podglądu (tj. ekran będzie); Aby temu zaradzić, dostosuj czas naświetlania i wzmocnienie kamery do poziomu, w którym komórki są widoczne. Konkretne ustawienia będą się różnić w zależności od instrumentów, sprzętu i typów komórek.

Wyniki

Reprezentatywne komórki glonów barwione barwnikiem czerwieni nilowej są przedstawione na rysunku 1. Części A i B rysunku 1 przedstawiają obrazy A. protothecoides hodowanych w nadmiarze azotu, co prowadzi do bardzo niskiej wewnątrzkomórkowej akumulacji lipidów. W częściach C i D przedstawiono próbki A. protothecoides uprawianych z ograniczeniem azotu. W oświetleniu transmisyjnym ciała lipidowe komórki mo...

Dyskusja

Glony użyte w krzywej standardowej muszą należeć do tych samych gatunków, które są hodowane w tych samych warunkach doświadczalnych, co algi mierzone. Znaczące zmiany w składzie podłoża, technice uprawy i protokole barwienia mogą wpływać na intensywność odczytu fluorescencji. Ekstrakcję heksanem (opisaną w sekcjach 1 i 2) zastosowano w celu oznaczenia neutralnej zawartości lipidów w próbkach użytych w krzywej wzorcowej. W celu dokładnych pomiarów intensywności fluorescencji wszystkie próbki muszą być analizowane przy tym...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pipety jednorazowe o
Bulb do pipet	Fisher	13-681-51
40 ml Teflonowe probówki	Fisher	05-562-16A	Teflon potrzebny do
naczyń wagowych heksanu (polipropylen)	Fisher	2-202B
Probówki	Fisher	05-408-129
Wirówka	Sorvall	RC6plus
Piec do suszenia (Fisher 625D)	Fisher	13-254-2
Fiolki do przechowywania	Fisher	0337-4
Mikrowirówka stołowa (Eppendorf 5415D)	Fisher	05-40-100
Kwant grawimetryczny
Moździerz porcelanowy (Coorstek)	Fisher	12-961A
Tłuczek porcelanowy (Coorstek)	Fisher	12-961-5A
40 ml Probówki wirówkowe (FEP)	Fisher	05-562-16A	Można również używać szklanych probówek
Pipety szklane Pasteura	Fisher	13-678-20C
Aluminiowe naczynia wagowe	Fisher	08-732-101
Hexanes	Fisher	H292-4
Fluorometryczna kwantyfikacja zawartości
Fluorescencyjny czytnik płytek wielodołkowych	Thermo Lab Systems	fluorescencji Fluoroskan Ascent
	Systems Thermo Lab	Systems Ascent Software 2.6
COSTAR 96 dołkowa płytka z okrągłym dnem	Fisher	06-443-2
Nile Red	Sigma	N3013-100MG
Etanol (odczynnik alkoholowy)	Fisher	AC65109-0020
Obrazowanie Komórki
Mikroskop Leica DMRXA2 (lub równoważny)	Leica	DMRXA2
Szkiełka nakrywkowe	Fisher	12-550-15
Szkiełka nakrywkowe do mikroskopu	Fisher	12-541B
Aparat	fotograficzny Qimaging	Retiga Ex
Oprogramowanie do obrazowania	Qimaging	QCapture v.1.1.8