Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowe ilościowe badania przesiewowe i oczyszczanie stosowane do rekombinowanych, bogatych w dwusiarczki białek jadowych wytwarzanych w E. coli

26.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51464

⸱

30 lipca 2014

 ,  ,  , 
1Architecture et Fonction des Macromolécules Biologiques (AFMB), Aix-Marseille Université, 2iBiTec-S, Service d'Ingénierie Moléculaire des Protéines (SIMOPRO), Commissariat à l'énergie atomique et aux énergies alternatives (CEA) Saclay, France

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ilościowego, wysokoprzepustowego badania ekspresji i analitycznego oczyszczania białek fuzyjnych z małych kultur Escherichia coli jest opisany i zastosowany do ekspresji bogatych w dwusiarczki białek jadu zwierzęcego.

Streszczenie

Escherichia coli (E. coli) jest najczęściej używanym systemem ekspresji do produkcji białek rekombinowanych do badań strukturalnych i funkcjonalnych. Jednak oczyszczanie białek jest czasami trudne, ponieważ wiele białek ulega ekspresji w postaci nierozpuszczalnej. Dlatego podczas pracy z trudnymi lub wieloma celami zaleca się stosowanie wysokoprzepustowych (HTP) badań przesiewowych ekspresji białek na małą skalę (1-4 ml kultur), aby szybko zidentyfikować warunki rozpuszczalnej ekspresji. Aby poradzić sobie z różnymi programami genomiki strukturalnej laboratorium, wdrożono ilościowy (w zakresie 0,1-100 mg/l kulturę rekombinowanego białka) i protokół przesiewowy ekspresji białka HTP i zwalidowano go na tysiącach białek. Protokoły zostały zautomatyzowane przy użyciu robota do obsługi cieczy, ale mogą być również wykonywane ręcznie bez specjalistycznego sprzętu.

Bogate w dwusiarczki białka jadu zyskują coraz większe uznanie ze względu na swój potencjał jako terapeutyczne leki prowadzące. Mogą być bardzo silne i selektywne, ale ich złożone sieci wiązań dwusiarczkowych sprawiają, że są trudne do wyprodukowania. Jako członek projektu European Venomics (www.venomics.eu FP7), naszym wyzwaniem jest opracowanie skutecznych strategii produkcji w celu wyprodukowania tysięcy nowych białek jadowych do charakterystyki funkcjonalnej. Wspomagani właściwościami redoks izomerazy o wiązaniach dwusiarczkowych DsbC, dostosowaliśmy nasz rurociąg produkcyjny HTP do ekspresji utlenionych, funkcjonalnych peptydów jadowych w cytoplazmie E. coli. Protokoły mają również zastosowanie do produkcji różnorodnych białek bogatych w dwusiarczki. Tutaj prezentujemy nasz rurociąg stosowany do produkcji białek jadu zwierzęcego. Dzięki opisanym tutaj protokołom jest prawdopodobne, że rozpuszczalne białka bogate w dwusiarczki zostaną uzyskane w ciągu zaledwie tygodnia. Nawet na małą skalę istnieje możliwość wykorzystania oczyszczonych białek do walidacji stopnia utlenienia za pomocą spektrometrii mas, do charakterystyki w badaniach pilotażowych lub do czułych mikrotestów.

Wprowadzenie

Motywowany postępem genomiki i przyspieszonym tempem odkrywania nowych białek, opracowano wysokoprzepustowe rurociągi, aby zrównoleglić tradycyjne podejścia do badań przesiewowych i identyfikacji optymalnych strategii produkcji białek. Potencjalne zmienne, które należy zoptymalizować, obejmują między innymi różne szczepyekspresji 1,2, temperaturę3,4, pożywkę2,3, warianty docelowe5, partnerów fuzyjnych6-13, koekspresję z białkami opiekuńczymi14,15, ekspresję cytoplazmatyczną lub peryplazmatyczną16-18 oraz składniki buforu oczyszczającego3. Dzięki wdrożeniu podejść o wysokiej przepustowości można równolegle testować wiele zmiennych lub wiele celów z wysokim poziomem wydajności, przy jednoczesnym ograniczeniu zmienności między partiami. Z naszego doświadczenia wynika, że strategia zapewnia również dobrą odtwarzalność po zwiększeniu skali przy użyciu tych samych kultur (temperatura, pożywka, napowietrzanie itp.) i warunków oczyszczania (ta sama żywica, itp.). W ciągu ostatniej dekady wykorzystano kilka wysokoprzepustowych platform do identyfikacji warunków ekspresji rozpuszczalnych białek, a mianowicie poprzez różne parametry, takie jak partnerzy fuzyjny, szczepy ekspresji lub temperatura19-23.

Ostatnio użyliśmy naszego wysokoprzepustowego podejścia do badania przesiewowego do ekspresji rozpuszczalnych białek bogatych w dwusiarczki11. Wybrane białka pochodziły nie tylko ze źródeł jadowitych, ale zawierały również bogate w dwusiarczki inhibitory enzymów z szerokiej gamy gatunków, w tym roślin, świń, krów i ludzi. W eksperymencie porównano wpływ 12 różnych partnerów fuzyjnych i trzech różnych szczepów ekspresyjnych na rozpuszczalność i fałdowanie 28 białek siatkowanych dwusiarczkiem. Wykazaliśmy, że użycie DsbC jako partnera fuzyjnego do produkcji w szczepie BL21 (DE3) pLysS znacznie przewyższało (zarówno pod względem wydajności, jak i liczby uzyskanych rozpuszczalnych białek) jakąkolwiek inną kombinację szczepu i fuzji11. Wyniki tego eksperymentu stanowiły podstawę do adaptacji naszego pierwotnego ogólnego potoku o wysokiej przepustowości (który został wykorzystany do badania przesiewowego ekspresji szerokiego zakresu białek)22,24 do bardziej odpowiedniego do ekspresji celów bogatych w dwusiarczki. Szczególnie interesujące są białka bogate w dwusiarczki pochodzące z jadów zwierzęcych. Jady są złożoną mieszaniną bioaktywnych peptydów i białek, o potencjalnej wartości farmakologicznej i terapeutycznej. Jednak ekspresja białek zawierających wiązania dwusiarczkowe nie jest trywialna. Białka te na ogół zawierają od jednego do siedmiu wiązań dwusiarczkowych i muszą być utlenione z odpowiednimi wzorcami wiązań dwusiarczkowych, aby były aktywne. Obecnie platforma jest wykorzystywana do badań przesiewowych ekspresji dużej liczby bogatych w dwusiarczki białek jadu zwierzęcego w ramach europejskiego projektu VENOMICS (www.venomics.eu) 7PR oraz do analizy porównawczej nowych protokołów dla wysokowydajnej ekspresji tysięcy celów. W tym przypadku zapewniono zautomatyzowaną metodę wysokoprzepustowego badania przesiewowego i oczyszczania ekspresji na małą skalę (patrz rysunek 1) stosowanej do bogatych w dwusiarczki białek jadu zwierzęcego. Strategia dla peptydów i białek bogatych w dwusiarczki wykorzystuje znacznik HIS do oczyszczania i aktywnego partnera fuzyjnego redoks, DsbC, tworząc rozszczepialne fuzje HIS-DsbC z białkami docelowymi (patrz rysunek 2).

Chociaż głównym celem tych protokołów jest automatyzacja za pomocą robota do obsługi cieczy i elektroforezy HTP, metody te są również odpowiednie dla wysokoprzepustowego podejścia ręcznego, co oznacza, że nawet laboratoria z podstawową konfiguracją mogą korzystać z protokołów bez żadnych warunków wstępnych dla drogiego sprzętu. Ręczne protokoły transformacji do oczyszczania i analizy (niespecyficzne dla białek bogatych w dwusiarczki) zostały opublikowane w innym miejscu24 i nie będą tutaj powtarzane. Przepustowość procedury ręcznej (od klonu ekspresji, wytworzonego przez klonowanie rekombinacyjne25, do analizy poziomów rozpuszczalnych białek) wynosi 96 (przy użyciu detekcji SDS-PAGE) lub 384 (przy użyciu 4 x 96; przy użyciu dot blot i SDS-PAGE26) kultur tygodniowo (patrz ryc. 1). Wartość tę można zwiększyć, jeśli jest wykonywana w sposób półautomatyczny (przy użyciu robota do obsługi cieczy i elektroforezy punktowej26 lub elektroforezy HTP, np. za pomocą systemu Caliper GXII LabChip22 do analizy wyników) do 1 152 (12 x 96) kultur równolegle przez jeden tydzień, jak opisano w niniejszym dokumencie. Hodowlę przeprowadza się w formacie Deep Well 24 (DW24), dzięki czemu można stosować regularne inkubatory z wytrząsaniem w przeciwieństwie do kultur hodowanych w formacie Deep Well 96 (DW96), które wymagają stosowania krótkich orbitalnych inkubatorów z szybkim wytrząsaniem w celu wystarczającego napowietrzenia (wytrząsanie przy 800 obr./min). Zastosowanie nośników z automatyczną indukcją27 upraszcza również odciąganie pokarmu, eliminując etap indukcji ręcznej. Nawet tam, gdzie laboratoria już stosują predefiniowane warunki odciągania i oczyszczania, można je przenieść bezpośrednio do tego systemu HTP po prostu w celu poprawy wydajności. Szczegółowy schemat wysokoprzepustowego procesu przesiewowego białek bogatych w dwusiarczki przedstawiono na rysunku 3. Parametry w pipeline zostały dobrane na podstawie obszernych eksperymentów przesiewowych 11,22, które pozwoliły nam wybrać najbardziej przydatne warunki do produkcji białka.

Charakterystyka może być przeprowadzona na oznakowanych białkach oczyszczonych bezpośrednio z ekspresji na małą skalę w badaniach pilotażowych, gdzie wystarczają dziesiątki mikrogramów próbki, lub dla czułych testów funkcjonalnych i testów wiązania (na przykład, systemy zacisków krosowych HTP o małej objętości28). To samo można wykonać nawet na nieoznakowanych celach po rozszczepieniu, pod warunkiem, że znacznik i proteaza zostaną usunięte (na przykład za pomocą HPLC z odwróconą fazą). Kontrolę jakości można również przeprowadzić za pomocą spektrometrii mas (w celu potwierdzenia oczekiwanej wielkości i stopnia utlenienia) lub metod chromatograficznych (w celu potwierdzenia czystości lub niejednorodności)29. Czasami rozszczepienie znaczników jest niepotrzebne lub nawet niepożądane (szczególnie w przypadku słabo rozpuszczalnych białek30,31), więc w tym protokole rozszczepienie jest opcjonalne. Niezależnie od tego, we wszystkich konstruktach znajduje się miejsce cięcia proteazy TEV (ENLYFQ/[G]32) bezpośrednio poprzedzające gen docelowy w celu wytworzenia natywnego białka po rozszczepieniu (patrz Ryc. 2 i Dyskusja). Jeśli pożądane jest rozszczepienie znacznika fuzyjnego, rozszczepienie można przetestować (na frakcji elucyjnej lub "na kolumnie") w małej skali w celu analizy wydajności, optymalizacji warunków w razie potrzeby i uzyskania wiarygodnych szacunków wydajności dla kolejnych eksperymentów na dużą skalę.

Są dwie opcje dotyczące ilości koralików używanych podczas oczyszczania powinowactwa, w zależności od celów i oczekiwań eksperymentu. Aby móc wychwycić jak największą ilość białka (w celu oczyszczenia do testów pilotażowych lub MS lub w celu ekstrapolacji w celu zwiększenia wydajności), należy użyć końcowej objętości 200 μl żywicy, umożliwiającej wykrycie rozpuszczalnego białka w zakresie 1-100 mg/l kultury przed nasyceniem systemu (patrz protokół (A) w sekcji 8.1). Jeżeli jednak celem doświadczenia jest wykrycie niewielkich ilości rozpuszczalnych białek, wówczas odpowiednia jest końcowa objętość 50 μl żywicy, pozwalająca na wykrycie rozpuszczalnego białka w zakresie 0,1-25 mg/l kultury (patrz protokół (B) w sekcji 8.2).

Produkcja może być zwiększana, jeśli jest to wymagane, aby uzyskać miligramowe ilości oczyszczonych celów do dalszych badań strukturalnych i funkcjonalnych przy użyciu warunków określonych dla rozpuszczalnego wyrażenia. Szczegóły dotyczące protokołów scale-up stosowanych w AFMB zostały omówione w innym miejscu22,24.

Dalsze szczegóły dotyczące konfiguracji eksperymentalnej, krytycznych kroków w protokole, modyfikacji i rozwiązywania problemów oraz ograniczeń techniki znajdują się w dyskusji. Prosimy o zapoznanie się z dyskusją przed rozpoczęciem eksperymentów.

We wszystkich protokołach oczekujemy wskaźnika sukcesu na poziomie 90% na każdym kroku (na przykład, co najmniej 90% kultur musi rosnąć na danym etapie). Jeśli wskaźnik powodzenia któregokolwiek kroku w eksperymencie spadnie poniżej 90%, próbki są odrzucane, a eksperyment jest powtarzany dla pełnej kolekcji konstruktów. Jednak ten wskaźnik sukcesu nie ma zastosowania do liczby konstruktów, które wyrażają się jako rozpuszczalne białka, ani do proporcji konstruktów, które rozszczepiają się ze 100% wydajnością, ponieważ będzie to w dużym stopniu zależało od badanych białek.

Szczegółowe informacje dotyczące konfiguracji stołu roboczego robota są podane dla każdego protokołu (zobacz również Rysunek 4), jednak mogą być dostosowane do alternatywnych ustawień stołu roboczego. Osprzęt robota (Tecan) składa się z 96-kanałowego ramienia (MCA96), manipulatora robota (RoMa) i 8-kanałowej głowicy do obsługi cieczy (LiHa). Wszystkie czynności przy użyciu MCA96 można również wykonać za pomocą LiHa, jeśli MCA96 nie jest dostępny, jednak zajmie to więcej czasu, ponieważ LiHa będzie musiał być myty między krokami. Chociaż z technicznego punktu widzenia robot nie jest sterylnym środowiskiem, włączenie antybiotyków generalnie zapewnia, że nie ma problemów z zanieczyszczeniem lub sterylnością.

Protokół

Część A: Transformacja i wyrażenie testowe

Ręczne procedury klonowania22 i transformacji do oczyszczenia są omówione gdzieindziej 24. Protokół transformacji można w pełni wykonać na robocie26, ale zwykle bardziej efektywne czasowo jest wykonanie tego ręcznie. W związku z tym protokoły w niniejszym dokumencie rozpoczynają się od zaszczepienia ekspresji prekultur i posiewu przemiany z mieszanek transformacyjnych z szokiem cieplnym, wykonanych ręcznie. Więcej informacji na temat procedur ręcznego klonowania i przekształcania można znaleźć w odpowiednich pozycjachbibliograficznych 22,24.

1. Hodowle wstępne i poszycie

  1. Przygotuj stół roboczy robota (patrz rysunek 4 dla pozycji):
    1. Umieść koryto o pojemności 300 ml zawierające 150 ml sterylnego bulionu LB (uzupełnionego ampicyliną (100 μg/ml)/chloramfenikolem (34 μg/ml) lub innym odpowiednim antybiotykiem) w pozycji 8.
    2. Umieść sterylny DW96 w pozycji 11. Umieścić 4x wstępnie przygotowane 24-dołkowe płytki do hodowli tkankowych z agarem LB (Amp/Cam) (zawierające 2 ml agaru w każdej studzience) z pokrywkami w pozycjach od 14 do 17.
    3. Umieścić płytkę transformacyjną (zawierającą 96 mieszanek transformacyjnych po szoku cieplnym) w pozycji 13. Zostanie to wykorzystane do zaszczepienia płynnych kultur wstępnych i płytek agarowych LB. Umieść pudełko ze sterylnymi końcówkami do pipet o pojemności 200 μl w pozycji 18.
  2. Za pomocą 96-kanałowego ramienia (MCA96) i końcówek o pojemności 200 μl zassać 200 μl bulionu LB (pozycja 8) i dozować do DW96 w pozycji 11. Powtarzaj, aż w każdej studzience DW96 znajdzie się końcowa objętość 1 ml bulionu LB. Stanie się to płynną prekulturą.
  3. Za pomocą manipulatora robota (RoMa) zdejmij pokrywę pierwszej 24-dołkowej płytki agarowej LB i umieść ją w innym miejscu (na przykład w transporterze hotelowym), aż zostanie zakończone powlekanie tej płytki.
  4. Za pomocą 8-kanałowej głowicy do obsługi cieczy (LiHa) wymieszać, a następnie zassać 50 μl pierwszej kolumny mieszanki transformacyjnej w pozycji 13. Ta objętość mieszanki transformacyjnej jest wystarczająca, aby dobrze pokryć LB-Agar.
  5. Za pomocą pierwszych 4 kanałów dozować na pierwszą kolumnę pierwszej 24-dołkowej płytki agarowej LB w pozycji 14 (jak pokazano na rysunku 5).
  6. Za pomocą ostatnich 4 kanałów dozować na drugą kolumnę pierwszej 24-dołkowej płytki agarowej LB.
  7. Po dozowaniu dokładnie umyj wszystkie końcówki.
  8. Kontynuuj ten proces, aż wszystkie przemiany zostaną posiane na pierwszej płytce w pozycji 14, przenosząc z dołka 96 do 24 przy użyciu schematu przedstawionego na rysunku 5.
  9. Po zakończeniu pracy z pierwszą płytką użyj RoMa, aby założyć pokrywkę i zdejmij pokrywkę z następnej płytki w pozycji 15. Kontynuuj stosowanie schematu poszycia dla następnych 3 płytek.
  10. Po zakończeniu powlekania ustaw Te-Shake na 1,200 obr./min i potrząsaj wszystkimi płytkami przez 1 minutę, aby uzyskać jednorodny rozkład mieszanki transformacyjnej.
  11. Używając MCA96 i oryginalnych końcówek pipet, wymieszaj, a następnie odessaj 60 μl pozostałej mieszanki transformacyjnej (pozycja 13) i dozuj do DW96 zawierającego bulion LB w pozycji 11.
  12. Uszczelnij prekultury DW96 oddychającą folią samoprzylepną, aby umożliwić napowietrzenie hodowli.
  13. Umieścić w inkubatorze wytrząsającym o temperaturze 37 °C z maksymalną prędkością O/N (200/800 obr./min w zależności od orbitalu wytrząsarki).
  14. Płytki agarowe LB należy umieścić w kapturze ze zdjętymi pokrywkami do wyschnięcia (10 min). Następnie umieszcza się je odwrócone w inkubatorze płytkowym o temperaturze 37 °C do następnego ranka.
  15. Następnego dnia prekultura jest używana do inokulacji ekspresji testowej w pożywce autoindukcyjnej i do przygotowania zapasów glicerolu. Umieść płytki agarowe w lodówce, jako kopię zapasową. W razie konieczności, zaczynając od płytek agarowych lub zapasów gliceryny, ekspresję testową można powtórzyć poprzez bezpośrednie zaszczepienie świeżej prekultury LB.

2. Przygotowanie płyt DW24 ZYP-5052

UWAGA: Ta procedura zajmuje około 5 minut dla każdego zestawu 4x płyt DW24.

  1. Uzupełnić 500 ml pożywki autoindukcyjnej ZYP-5052 dla każdej kontrpróby 96 kultur (464 ml pożywki ZY, 250 μl 2 MMgSO4, 10 ml 50x 5052, 25 ml 20x NPS, w tej kolejności – przepisy dla każdego składnika podano w Tabeli 1) uzupełnionych odpowiednimi antybiotykami.
  2. Przygotuj stół roboczy robota:
    1. Umieść dwie korytka o pojemności 300 ml, każda zawierająca ~250 ml pożywki w pozycji 5 i 6. Umieść cztery sterylne płytki DW24 w pozycjach od 14 do 17. Umieść końcówki o pojemności 200 μl w pozycji 18.
  3. Za pomocą końcówek MCA96 i 200 μl odessać 200 μl ZYP-5052 z pozycji 5 i dozować do pierwszej płytki DW24 w pozycji 14. Zrób to w sumie 5 razy (4 końcówki zostaną jednorazowo dozowane do jednej studzienki, co daje w sumie 4 ml). Powtórz dla pozostałych 3 płytek DW24 w pozycjach od 15 do 17, przełączając się na ZYP-5052 w pozycji 6 dla dwóch ostatnich płytek DW24.

3. Inokulacja i wzrost kultur ekspresji testowej

UWAGA: Inokulacja trwa około 10 minut dla każdego zestawu 4x płytek DW24, a wzrost trwa O/N.

  1. Przygotuj stół roboczy robota:
    1. Umieść tabliczkę DW96 zawierającą prekultury (z kroku 1.15) w pozycji 11. Umieść cztery płytki DW24 zawierające pożywkę ZYP-5052 (od kroku 2.3) w pozycjach od 14 do 17.
  2. Używając LiHa odessać 100 μl kultury wstępnej z pozycji 11 w celu zaszczepienia kultur ekspresji testowej (rozcieńczenie 1/40) przy użyciu schematu przedstawionego na rysunku 5. Dokładnie umyj głowę LiHa w stacji mycia między każdą kolumną 96-dołkowych kultur wstępnych.
  3. Uszczelnić płytki DW24 oddychającą folią i inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (200/400 obr./min) przez 4 godziny. Jest to czas fazy wzrostu, podczas której glukoza z pożywki zostanie preferencyjnie zubożona27.
  4. Obniżyć temperaturę do 17 °C. Po 4 godzinach i wyczerpaniu glukozy laktoza zacznie być metabolizowana, co doprowadzi do indukcji ekspresji, zapewniając optymalne warunki wzrostu dla BL21 (DE3) pLysS lub Rosetta 2 (DE3) pLysS, w tej pracy22. Pozostaw komórki do ekspresji O/N. Użyj pozostałej kultury wstępnej do wytworzenia zapasów glicerolu.

4. Przygotowanie zapasów glicerolu

UWAGA: Zapasy glicerolu powinny być sporządzane w trzech egzemplarzach, aby można je było przechowywać w różnych miejscach na wypadek awarii zamrażarki.

  1. Przygotuj stół roboczy robota:
    1. Umieść płytki do mikromiareczkowania w pozycjach od 5 do 7, aby pomieścić zapasy glicerolu. Umieść koryto o pojemności 300 ml wypełnione 50 ml 100% glicerolu w pozycji 8. Umieścić DW96 zawierający 800 μl kultury wstępnej (po kroku 3.2) w każdym dołku w pozycji 11. Umieść końcówki o pojemności 200 μl w pozycji 18.
  2. Korzystając z powolnej prędkości zasysania i dozowania, użyj końcówek MCA96 i 200 μl, aby dodać glicerol do DW96 zawierającego prekultury.
    1. Odessać 200 μl glicerolu (z pozycji 8).
    2. Najpierw dozuj 150 μl (w pozycji 11), a następnie zatrzymaj się na 20 sekund, aby pozostały glicerol dotarł do dolnej części końcówki. Dozować pozostałe 50 μl.
  3. Używając tych samych końcówek, wymieszaj kulturę i glicerol w DW96 w pozycji 11, aż dokładnie się wymieszają. Końcowe stężenie glicerolu wynosi 20%. Odessać 140 μl z DW96 i dozować do pierwszej płytki do mikromiareczkowania w pozycji 5.
  4. Powtórzyć krok 4.3 dla każdej pozostałej płytki do mikromiareczkowania (pozycje 6 i 7).
  5. Uszczelnić każdą płytkę do mikromiareczkowania plastikową taśmą klejącą i przechowywać w temperaturze -80 °C. Pozostałą kulturę należy wyrzucić do DW96, odkażając ją środkiem przeciwdrobnoustrojowym przed usunięciem.

5. Ocena rozwoju kultur

UWAGA: Zazwyczaj nie jest konieczne ocenianie końcowego tempa wzrostu, ponieważ końcowa wartość OD600 jest zwykle taka sama dla większości kultur (około 12 w tych warunkach), jednak wszelkie kultury, które nie rosną, powinny być odnotowane.

  1. Pobrać 50 μl każdej kultury (z kroku 3.4) i rozlać na płaskodenną, przezroczystą płytkę do mikromiareczkowania zawierającą 150 μl pożywki.
  2. Zmierzyć OD600, biorąc pod uwagę 4-krotne rozcieńczenie. Jeśli są takie, które nie rosły zbyt dobrze, zanotuj to w końcowej analizie.

6. Zbieranie komórek

UWAGA: Ta procedura trwa około 45 minut.

  1. Odwirować 4 płytki DW24 (od kroku 3.4) przy 3 000 x g przez 10 minut, a następnie wyrzucić supernatant do pojemnika na odpady zawierającego środek przeciwdrobnoustrojowy. Postukaj talerzami do góry nogami o chłonny papier, aby usunąć nadmiar podłoża.
  2. W międzyczasie należy przygotować 100 ml buforu do lizy (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol pH 8 lub inny preferowany bufor) zawierającego lizozym (stężenie końcowe 0,25 mg/ml).
  3. Przygotuj stół roboczy robota:
    1. Umieścić bufor do lizy w korycie o pojemności 300 ml w pozycji 5. Umieść czysty DW96 w pozycji 11. Umieść 4 x DW24 płytki zawierające granulki komórek (z kroku 6.1) w pozycjach 14-17. Umieść końcówki o pojemności 200 μl w pozycji 18.
  4. Za pomocą końcówek MCA96 i 200 μl odessać 125 μl buforu do lizy z pozycji 5 i dozować do każdej płytki DW24 (pozycje 14-17). Powtórzyć. UWAGA: 4 końcówki zostaną jednorazowo dozowane do jednego dołka, aby uzyskać końcową objętość 1 ml w każdym dołku płytek DW24.
  5. Potrząsaj płytkami w pozycjach 14-17 za pomocą Te-Shake (1,000 obr./min) przez 15 minut, aby ponownie zawiesić granulki.
  6. Po ponownym zawieszeniu granulek należy użyć pierwszych 4 kanałów LiHa do zassania 550 μl z próbek od 1 do 4 (pierwsza kolumna pierwszego DW24, w pozycji 14), a następnie za pomocą ostatnich 4 kanałów LiHa zasysać 550 μl próbek od 5 do 8 (druga kolumna pierwszego DW24). Dozować do pierwszego rzędu DW96 w pozycji 11.
  7. Powtórz krok 6.6, aby cała zawiesina komórek została przeniesiona do DW96.
  8. Po każdym zestawie próbek umyć końcówki LiHa w stacji myjącej.
  9. Powtórz kroki od 6.6 do 6.8 dla każdej kolumny w każdej płycie DW24 (pozycje 15-17), korzystając ze schematu przedstawionego na rysunku 5. Uszczelnij folią z tworzywa sztucznego.
  10. W celu oczyszczenia tego samego dnia lub krótkotrwałego zamrożenia przechowywać w temperaturze -80 °C przez co najmniej 1 godzinę, w przeciwnym razie przechowywać w temperaturze -20 °C.

Część B: Oczyszczanie i analiza

7. Liza komórek

UWAGA: Ta procedura trwa około 60 minut.

  1. Rozmrażać zamrożone zawiesiny komórek (od etapu 6.10) w łaźni wodnej (w temperaturze pokojowej lub 37 °C) przez około 15 minut i ponownie zawiesić w inkubatorze do wytrząsania na dodatkowe 10 minut. Kultury powinny stać się lepkie.
  2. Weź 500 μl bulionu DNazy i wymieszaj go z 1 ml bulionu MgSO4. Ręcznie za pomocą pipety 8-kanałowej lub za pomocą robota LiHa dozować 15 μl do każdej studzienki DW96, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μg/ml DNazy i 20 mMMgSO4.
  3. Ponownie zamknij płytkę plastikową taśmą i potrząsaj przez kolejne 15 minut. W tym momencie kultury powinny być nielepkie. Sprawdź dokładnie (poprzez oględziny), czy wszystkie kultury nie są już lepkie. UWAGA: Ma to kluczowe znaczenie, jeśli niektóre kultury są nadal lepkie (na przykład, jeśli DNaza została przypadkowo zapomniana lub nie została odpowiednio dozowana w niektórych studzienkach), filtr zatka się, generując nierównomierne ciśnienie na próbkach i może dojść do przepełnienia lub całkowitego zatkania płytki filtracyjnej podczas oczyszczania.
  4. W przypadku próbek SDS-PAGE lizatu całego komórkowego należy odessać 10 μl lizatu i dozować do 96-dołkowej płytki PCR zawierającej 10 μl 4x buforu próbki SDS-PAGE i 20 μl wody. Denaturację przez 3 minuty w temperaturze 95 °C i zamrażać do czasu analizy (frakcja całkowita). Jeśli dostępny jest system elektroforezy HTP, próbki można na nim analizować, zamiast tego postępować zgodnie z zalecanym przez producenta protokołem przygotowania próbki. Więcej informacji na temat analizy próbek znajduje się w sekcji 10.

8. Oczyszczanie powinowactwa Ni

UWAGA: Do pipetowania wszystkich zawiesin żywicy należy używać niskiej prędkości zasysania, ponieważ zawiesiny są dość gęste. Nadmierne wysuszenie żywicy spowoduje zmniejszenie zdolności wiązania. Do oczyszczania określone stężenia imidazolu mają zastosowanie do żywicy o powinowactwie do niklu. W przypadku stosowania jonów alternatywnych (np. kobaltu) należy odpowiednio dostosować stężenia.

  1. A - oczyszczanie powinowactwa do Ni do wykrywania w zakresie 1-100 mg/L (końcowa objętość żywicy = 200 μl)
    UWAGA: Ta procedura oczyszczania trwa około 1,5 godziny, co oznacza, że w ciągu jednego dnia można wykonać do 4 zabiegów.
    1. Przygotuj stół roboczy robota:
      1. Umieścić 300 ml koryt zawierających bufor wiążący (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol pH 8), bufor do przemywania (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazol pH 8) i bufor elucyjny (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol pH 8) odpowiednio w pozycjach od 6 do 8.
      2. Pozostawić puste koryto o pojemności 300 ml w pozycji 5 na zawiesinę żywicy. Na pozycjach 9 i 10 umieść uchwyty na talerze. W pozycji 10 umieść DW96 z blokiem SPE i płytką filtrująco-odbiorczą (20 μm) na górze.
      3. Umieść DW96 zawierający lizat (od kroku 7.3) w pozycji 14. Na pozycjach 18 i 19 umieść odpowiednio końcówki o szerokim otworze 200 μl i końcówki o średnicy 200 μl. Umieść dwie zapasowe płytki DW96 do mycia i elucji w hotelu. UWAGA: Można je również umieścić w alternatywnym miejscu na stole roboczym, jeśli hotel jest niedostępny.
    2. Przygotować 105 ml zbilansowanej 33% zawiesiny żywicy (35 ml żywicy + 70 ml buforu wiążącego). Dodać zawiesinę żywicy do koryta w pozycji 5 bezpośrednio przed rozpoczęciem zabiegu.
    3. Używając MCA96 i końcówek o szerokim otworze 200 μl (pozycja 18), dokładnie wymieszaj zawiesinę żywicy w pozycji 5 przed zasysaniem i dozowaniem 200 μl zawiesiny żywicy do DW96 zawierającej lizat w pozycji 14. Powtórz dwukrotnie, aby do lizatu dodano 600 μl zawiesiny żywicy, mieszając zawiesinę żywicy przed każdym zasysaniem.
    4. Wykonaj 10-minutowy etap mieszania za pomocą MCA96 w pozycji 14, aby umożliwić wiązanie i zapobiec granulowaniu żywicy.
    5. Zassać z pozycji 14 i dozować 800 μl (w partiach po 200 μl) na płytkę filtracyjną w pozycji 9, mieszając przed każdym zasysaniem, w przeciwnym razie żywica zostanie zatrzymana na dnie DW96.
    6. Włącz próżnię w pozycji 10 na około 90 sekund, aby przefiltrować lizat przez płytkę do DW96 w celu zebrania przepływu, uważając, aby nie wysuszyć żywicy. Wyłącz odkurzacz.
    7. Powtórz kroki 8.1.5 i 8.1.6, aby cała żywica znalazła się w płycie filtracyjnej.
    8. Za pomocą ramienia RoMa przesunąć blok SPE przytrzymujący płytę filtracyjną z pozycji 10 do pozycji 9 tak, aby następny etap mycia trafił bezpośrednio do odpadu i przenieść DW96 zawierający przepływ w pozycji 10 w inne miejsce (np. do nośnika hotelowego) do końca procedury.
    9. Za pomocą nowego zestawu końcówek o pojemności 200 μl (w pozycji 19) przemyć żywicę (w pozycji 9) łącznie 800 μl buforu wiążącego (z pozycji 6) i zastosować próżnię w pozycji 9, aż bufor przejdzie przez nią. Powtórz jeszcze raz.
    10. Użyj ramienia RoMa, aby umieścić świeży DW96 w pozycji 10, aby zebrać 50 mM płukania imidazolem i przesunąć blok SPE i płytkę filtracyjną z powrotem na górę (pozycja 10).
    11. Dodać 800 μl buforu do płukania z pozycji 7 do pozycji 10, włączyć próżnię, aż bufor przejdzie przez nią. Wyłącz odkurzacz.
    12. Za pomocą ROMA wyjmij blok SPE i płytę filtracyjną do pozycji 9, a DW96 zawierającą próbkę mycia do hotelu i odłóż je na bok do końca procedury.
    13. Przemyć żywicę kolejnym 800 μl buforu do przemywania (od pozycji 7 do pozycji 9), zastosować próżnię, aż bufor przejdzie przez nią. Powtórz jeszcze raz.
    14. Użyj RoMa, aby umieścić świeży DW96 w pozycji 10 i umieść blok SPE i płytkę filtracyjną z powrotem na górze, aby zebrać elucję.
    15. Dodać łącznie 500 μl buforu elucyjnego (z pozycji 8 do pozycji 9) i inkubować in situ przez 3 minuty. Włączyć próżnię, aż cały bufor przejdzie przez nią.
    16. Opcjonalnie: W przypadku białek o wysokiej ekspresji można przeprowadzić drugą elucję do świeżego DW96, jak w krokach 8.1.14 i 8.1.15.
    17. Pobrać próbki przepływu, przemywania i elucji do elektroforezy SDS-PAGE lub HTP.
      1. W przypadku próbek przepływowych SDS-PAGE należy dozować 10 μl do 96-dołkowej płytki PCR zawierającej 10 μl buforu do próbek 4X SDS-PAGE i 20 μl wody. W przypadku próbek SDS-PAGE z płukania i elucji/s należy dozować 30 μl do płytek PCR zawierających 10 μl 4x buforu próbek SDS-PAGE. Denaturację przez 3 minuty w temperaturze 95 °C i zamrażać do czasu analizy.
      2. W przypadku próbek elektroforezy HTP postępuj zgodnie z instrukcjami producenta. Więcej informacji na temat analizy próbek znajduje się w sekcji 10.
  2. B - Oczyszczanie powinowactwa do Ni do wykrywania w zakresie 0,1-25 mg/L (końcowa objętość żywicy = 50 μl)
    UWAGA: Ta procedura oczyszczania trwa około 30 minut, co oznacza, że w ciągu jednego dnia można wykonać do 12 zabiegów.
    1. Przygotuj stół roboczy robota:
      1. Umieścić 300 ml koryt zawierających bufor wiążący (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol pH 8), bufor do przemywania (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazol pH 8) i bufor elucyjny (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol pH 8) odpowiednio w pozycjach od 6 do 8.
      2. Pozostawić puste koryto o pojemności 300 ml w pozycji 5 na zawiesinę żywicy. Na pozycjach 9 i 10 umieść uchwyty na talerze. W pozycji 10 umieść DW96 z blokiem SPE i płytką filtrująco-odbiorczą (20 μm) na górze.
      3. Umieść DW96 zawierający lizat (od kroku 7.3) w pozycji 14. Na pozycji 18 i 19 umieść odpowiednio końcówki o szerokim otworze 200 μl i końcówki o pojemności 200 μl. Umieść zapasową 96-dołkową płytkę do mikromiareczkowania do elucji w hotelu. UWAGA: Można go również umieścić w alternatywnym miejscu na stole roboczym, jeśli hotel jest niedostępny.
    2. Przygotować 50 ml zbilansowanej 25% zawiesiny żywicy (12,5 ml żywicy + 37,5 ml buforu wiążącego). Dodać zawiesinę żywicy do koryta w pozycji 5 bezpośrednio przed rozpoczęciem zabiegu.
    3. Używając MCA96 i końcówek o szerokim otworze 200 μl (pozycja 18), dokładnie wymieszaj zawiesinę żywicy w pozycji 5 przed zasysaniem i dozowaniem 200 μl zawiesiny żywicy do DW96 zawierającej lizat w pozycji 14.
    4. Inkubować w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem za pomocą Te-Shake przy 1400 obr./min przez 10 minut, aby umożliwić wiązanie.
    5. Zassać z pozycji 14 i dozować pełne 1 200 μl (w partiach 200 μl) za pomocą końcówek o szerokim otworze (pozycja 18) na płytkę filtracyjną w pozycji 10. Wymieszaj przed każdym zasysaniem, w przeciwnym razie żywica zostanie zatrzymana na dnie DW96.
    6. Włącz próżnię w pozycji 10 na około 30 sekund, aby przefiltrować lizat przez płytkę do DW96 w celu zebrania przepływu, uważając, aby nie wysuszyć żywicy. Wyłącz odkurzacz.
    7. Za pomocą ramienia RoMa przesunąć blok SPE przytrzymujący płytę filtracyjną z pozycji 10 do pozycji 9 tak, aby następny etap mycia trafił bezpośrednio do odpadu i przenieść DW96 zawierający przepływ w pozycji 10 w inne miejsce (np. do nośnika hotelowego) do końca procedury.
    8. Za pomocą końcówek o objętości 200 μl (w pozycji 19) przemyć żywicę (w pozycji 9) łącznie 800 μl buforu wiążącego (z pozycji 6) i zastosować próżnię w pozycji 9, aż bufor przejdzie przez nią. Powtórzyć.
    9. Za pomocą ramienia RoMa umieść świeży DW96 w pozycji 10, aby zebrać 50 mM płynu do płukania imidazolem i przesuń blok SPE i płytkę filtracyjną z powrotem na górę (pozycja 10).
    10. Dodać 150 μl buforu do płukania z pozycji 7 do pozycji 10, włączyć próżnię, aż bufor przejdzie przez nią. Wyłącz odkurzacz.
    11. Za pomocą ROMA wyjmij blok SPE i płytę filtracyjną do pozycji 9, a DW96 zawierającą próbkę mycia do hotelu i odłóż ją na bok do końca procedury.
    12. Przemyć żywicę kolejnym 800 μl buforu do przemywania (od pozycji 7 do pozycji 9), zastosować próżnię, aż bufor przejdzie przez nią. Powtórzyć.
    13. Użyj RoMa, aby umieścić mikropłytkę w pozycji 9 i umieść blok SPE i płytkę filtracyjną z powrotem na górze, aby zebrać elucję.
    14. Dodać 190 μl buforu elucyjnego (z pozycji 8 do pozycji 9) i inkubować in situ przez 3 minuty. Stosować próżnię, aż cały bufor przejdzie przez nią.
    15. Pobrać próbki przepływu, przemywania i elucji do elektroforezy SDS-PAGE lub HTP.
      1. W przypadku próbek przepływowych SDS-PAGE należy dozować 10 μl do 96-dołkowej płytki PCR zawierającej 10 μl buforu do próbek 4X SDS-PAGE i 20 μl wody. W przypadku próbek SDS-PAGE z płukania i elucji/s należy dozować 30 μl do płytek PCR zawierających 10 μl 4x buforu próbek SDS-PAGE. Denaturację przez 3 minuty w temperaturze 95 °C i zamrażać do czasu analizy.
      2. W przypadku próbek elektroforezy HTP postępuj zgodnie z instrukcjami producenta. Więcej informacji na temat analizy próbek znajduje się w sekcji 10.

9. Znacznik Dekolt (Opcjonalnie)

  1. Dodać proteazę TEV (2 mg/ml) do eluowanego białka (z kroku 8.1.15 (i 8.1.16) lub kroku 8.2.14) w stosunku 1/10 (v/v).
  2. Inkubować w temperaturze pokojowej (lub 4 °C w przypadku białek wrażliwych na temperaturę) O/N, delikatnie wstrząsając.
  3. Pod koniec rozszczepienia dozować 30 μl do płytki PCR zawierającej 10 μl 4x buforu próbki SDS-PAGE lub postępować zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi próbek do elektroforezy HTP.
  4. Przefiltrować pozostałą mieszaninę rozszczepienia (z kroku 9.2) przez 96-dołkową płytkę filtracyjną 0,22 μm i zebrać rozpuszczalny przepływ w DW96, stosując próżnię. Można to zrobić w jednym z miejsc podciśnienia (np. w pozycji 10) na robocie do obsługi cieczy, tak jak w przypadku etapów elucji w sekcjach 8.1 i 8.2. Powoduje to usunięcie wszelkich białek, które wytrąciły się podczas rozszczepienia.
  5. Po filtracji dozować 30 μl do płytki PCR zawierającej 10 μl 4x buforu próbki SDS-PAGE lub przygotować jako próbki do elektroforezy HTP. Pozwala to na porównanie białka przed rozszczepieniem, mieszaniny po rozszczepieniu i rozpuszczalnego białka pozostałego po rozszczepieniu oraz daje dobre wskazówki co do oczekiwanych wyników w kolejnych eksperymentach na dużą skalę. Więcej informacji na temat analizy próbek znajduje się w sekcji 10.

10. Analiza wyników

  1. Zidentyfikuj konstrukty wyrażające rozpuszczalne białko, analizując próbki oczyszczające za pomocą SDS-PAGE, dot blot lub systemu elektroforezy HTP, takiego jak Caliper LabChip.
    1. Najpierw przeanalizuj próbki elucji, aby zidentyfikować konstrukty wytwarzające rozpuszczalne białko. W większości przypadków analizowane są tylko próbki elucji, jeśli zidentyfikowane zostaną rozpuszczalne konstrukty, aby zminimalizować czas poświęcony na analizę.
    2. Jeśli białko nie znajduje się w elucji, uruchom próbki do płukania i przepływu, aby sprawdzić, czy uległo ekspresji i nie wiąże się prawidłowo z żywicą.
    3. W przypadku konstruktów, w których nie można wykryć rozpuszczalnego białka, uruchom lizat całej komórki, aby sprawdzić, czy białko uległo ekspresji.
      UWAGA: Jednym z ograniczeń jest to, że jeśli białko będące przedmiotem zainteresowania nie jest obecne powyżej poziomów ekspresji tła, może nie być możliwe zobaczenie białka i może to prowadzić do fałszywie ujemnego wyniku. Należy zauważyć, że zawsze możliwe jest, aby białka przywierały i wytrącały się na żywicy powinowactwa, co może prowadzić do fałszywie ujemnego lub niedoszacowania plonu przy użyciu zalecanego protokołu (rzadkie zdarzenie w tej pracy). W przypadku, gdy białko wytrąca się podczas elucji (biała osadka jest widoczna kilka minut/godzin po elucji), zaleca się zmianę składu buforu (na przykład stężenia soli) i/lub wykonanie różnicowego testu fluorymetrii skaningowej w celu optymalizacji. Niewielka próbka żywicy może być również ponownie zawieszona w buforze próbek SDS-PAGE i gotowana w celu wykrycia, czy białko jest zatrzymywane na żywicy.
    4. Jeśli białko nie uległo ekspresji, ale komórki rosły, zastosuj nową strategię ekspresji lub, jeśli OD600 nie było wystarczająco wysokie, odhoduj i ponownie przeanalizuj kulturę.
    5. Jeśli próbki rozszczepienia mają być analizowane, powinny być analizowane w sposób równoległy, tak aby każdy konstrukt mógł być pokazany przed rozszczepieniem i po rozszczepieniu na sąsiednich pasach, aby uprościć analizę.
  2. O ile nie stosuje się metody, która daje bezpośrednie określenie ilościowe stężenia elucji, oznaczanie ilościowe należy przeprowadzić dla próbek dodatnich, mierząc absorbancję przy 280 nm (A280).
    1. Zmierzyć A280, biorąc pod uwagę współczynnik ekstynkcji białka i wykorzystując bufor elucyjny jako ślepą próbę, aby zapewnić oszacowanie wydajności białka w celu zidentyfikowania rozpuszczalnych konstruktów o najwyższej ekspresji.
    2. W celu uzyskania najbardziej wiarygodnego porównania plonów rozpuszczalnych zaleca się normalizację plonów przez gęstość kultury (przy użyciu pomiaru OD600), który został wykonany w sekcji 5. Jeśli wszystkie kultury osiągnęły w przybliżeniu tę samą gęstość, normalizacja nie jest wymagana.

11. Kontrola jakości

  1. Próbki mogą być analizowane bezpośrednio z próbki elucyjnej lub rozszczepialnej za pomocą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC/MS).
  2. Alternatywnie, najpierw odsolić (w celu usunięcia imidazolu i wszelkich soli buforowych, które mogą być obecne) za pomocą końcówek do pipet ZipTip lub metod chromatografii cieczowej, a następnie przeanalizować za pomocą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-TOF) lub spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylania (ESI).
  3. Można przeprowadzić badania funkcjonalne na małą skalę, aby sprawdzić, czy funkcja białka jest zgodna z oczekiwaniami. Jeśli do działania wymagane są większe ilości, można wykonać hodowlę na dużą skalę i przetestować funkcję na podstawie większej hodowli po potwierdzeniu wielkości i stopnia utlenienia w małej skali.

Wyniki

Reprezentatywne wyniki przedstawiono na Rycina 6 do przesiewowej analizy ekspresji 96 białek bogatych w mostki dwusiarczkowe z potoku VENOMICS. Białka zostały uporządkowane według rosnącej liczby wiązań dwusiarczkowych, a następnie według rosnącej liczby reszt. Peptydy wyekspresowano w cytoplazmie z zastosowaniem znacznika HIS oraz białka fuzyjnego DsbC. Przy zastosowaniu zalecanych warunków hodowli, wartość OD600 zazwyczaj osiąga się wartość 12. Peptydy oczyszczono zgodnie z protokołem 8.2-B, uzyskując końcową objętość wynoszącą 50 µl żywicą z powinowactwem do niklu, zatem w tym doświadczeniu można było wykryć maksymalnie ok. 25 mg/L białka fuzyjnego.

Rysunek 6A przedstawia wynik elektroforezy z systemu Caliper LabChip (pokazujący fuzję przed cięciem) oraz system punktacji oparty na ekstrapolacji wydajności w mg/L hodowli białka fuzyjnego (w zakresach od 0,1 do 2 mg/L hodowli, 2 do 10 mg/L hodowli, 10 do 25 mg/L hodowli oraz nie wykryto). Należy zauważyć, że odcięty znacznik DsbC zazwyczaj wędruje w okolicach 32 kDa, a nie 27 kDa, jak oczekiwano. Podobnie białka fuzyjne DsbC wędrują o około 5 kDa wyżej niż oczekiwano. W przypadku wielu celów obserwujemy nie tylko nienaruszoną fuzję (górny prążek), ale także sam partner fuzyjny (dolny prążek). W przypadku niektórych z tych celów optymalizacja warunków hodowli może poprawić stosunek nienaruszonej fuzji (górny prążek) w stosunku do samego DsbC, co pozwala na zwiększenie końcowej wydajności. Punktacja opiera się wyłącznie na poziomie nienaruszonej fuzji. Tylko 16 z 96 białek nie udało się wykryć na poziomie fuzji. Odpowiada to ogólnemu poziomowi sukcesu wynoszącemu 83%. Spośród 80 białek, które udało się wykryć, 45 z nich wykryto na poziomach przekraczających 2 mg/L hodowli (56%). W zależności od celu i fuzji, wydajność białek zazwyczaj mieści się w zakresie 2-100 mg/L hodowli (choć w tym przykładzie, stosując protokół 8.2 B, można wykryć maksymalnie ~25 mg/L białka fuzyjnego).

Analiza sukcesu w zależności od liczby obecnych mostków dwusiarczkowych (przedstawiona na Rysunku 6B) wykazuje zadowalający sukces dla wszystkich testowanych liczb mostków dwusiarczkowych (od 1 do 7), przy czym najniższy poziom sukcesu wyniósł 66% dla celów zawierających 6 mostków dwusiarczkowych. Analiza rozkładu sukcesu ekspresji w zależności od punktu izoelektrycznego i liczby reszt (przedstawiona na Rysunku 6C) nie wykazuje żadnej szczególnej stronniczości techniki, gdyż zarówno pomyślnie wyeksponowane cele, jak i cele niewykryte są rozproszone na całym wykresie.

Rycina 6D przedstawia przykład wyników spektrometrii mas uzyskanych za pomocą spektrometrii mas z jonizacją w elektroryaju (ESI-MS) dla pojedynczego celu, przed i po redukcji próbki za pomocą DTT. Zazwyczaj tak wyczerpująca analiza spektrometryczna nie byłaby konieczna (próbka zredukowana nie wymagałaby analizy), jednak w celu dokładnej demonstracji przedstawiliśmy oba wyniki. Przedstawionym celem jest białko jadu o masie 5,7 kDa, bogate w mostki disiarczkowe, posiadające 4 wiązania disiarczkowe. Widmo po lewej stronie pokazuje wyniki dla białka przed redukcją DTT, w stanie po trawieniu i odsoleniu, bez dalszej interwencji. Widmo po prawej stronie przedstawia białko po redukcji DTT, a następnie odsoleniu w celu usunięcia nadmiaru DTT. Jony odpowiadające masom eksperymentalnym są oznaczone strzałkami na widmie, a oznaczenie każdego jonu wyświetla się na zielono. W tabeli przedstawiono obliczone eksperymentalne masy macierzyste dla tych jonów (dla białka przed redukcją (-DTT) i po redukcji (+DTT)). Masy (5709,6 Da dla próbki przed redukcją i 5717,6 Da dla próbki zredukowanej) wykazują różnicę masy wynoszącą 8 Da. Różnica masy 2 Da odpowiada obecności 1 utlenionego wiązania disiarczkowego, zatem różnica masy 8 Da wskazuje na obecność 4 wiązań disiarczkowych (zgodnie z oczekiwaniami) w próbce nieredukowanej.

Schemat procesu transformacji genów z płytkami PCR96, wektorami ekspresyjnymi i analizą SDS-PAGE.
Rysunek 1. Schematyczna reprezentacja protokołu wysokoprzepustowego przesiewania ekspresji. Stosując ten protokół, jedna osoba może w ciągu tygodnia przetestować od 96 do 384 warunków metodami manualnymi lub do 1 152 warunków przy użyciu opisanego sprzętu półautomatycznego. Plasmidy ekspresyjne są konstruowane przy użyciu technologii klonowania rekombinacyjnego, co pozwala na jednoczesne subklonowanie wielu celów. Po zidentyfikowaniu warunków ekspresji rozpuszczalnej i ewentualnym przeprowadzeniu cięcia, białko może zostać przekazane do kontroli jakości w celu sprawdzenia utleniania i czystości, do mikroanaliz i/lub produkcji na dużą skalę.

Schemat procesu klonowania genów z wykorzystaniem wektorów HIS-DsbC do ekspresji białek.
Rycina 2. Schemat uniwersalnego klonowania rekombinacyjnego i projektowania konstruktów.Z klonów wejściowych (entry clones) można w ramach jednego eksperymentu podklonować wiele wektorów ekspresyjnych w sposób wysokoprzepustowy (do 6 x 96 klonów wejściowych w ciągu tygodnia). Ekspresowane białko zawiera znacznik HIS do oczyszczania powinowactwem do niklu. Partner fuzyjny DsbC (pozbawiony periplazmatycznej sekwencji sygnałowej w celu ekspresji cytoplazmatycznej) jest stosowany w celu zwiększenia rozpuszczalności i/lub wspomagania fałdowania oraz prawidłowego utleniania białka docelowego. Należy pamiętać, że sekwencja kodująca białko docelowe powinna zawierać N-końcową sekwencję rozpoznawania proteazy TEV (ENLYFQ), jeśli wymagane jest odcięcie znacznika. Wstawka w lewym górnym rogu przedstawia otrzymywanie klonów wejściowych przy użyciu wektora donora i sekwencji docelowych, które mogą być uzyskane metodą PCR lub syntezy genów. Klony wejściowe można również pozyskać z komercyjnych kolekcji klonów wejściowych. Dostępnych jest wiele systemów klonowania rekombinacyjnego, jednak w przedstawionym schemacie wykorzystano system Gateway.

Schemat ekspresji białka HIS-DsbC; synteza genów, oczyszczanie na niklu, analiza LC/MS.
Rysunek 3. Potok wysokoprzepustowego screeningu dla wielu celów bogatych w mostki disiarczkowe. Cele są początkowo ekspresjonowane jako fuzje HIS-DsbC w cytoplazmie E. coli BL21 (DE3) pLysS w temperaturze 37/17 °C z użyciem pożywki do autoindukcji (ZYP-5052). Oczyszczanie przeprowadza się na żywicy niklowej, a następnie wykrywa rozpuszczalne konstrukty za pomocą elektroforezy HTP (lub metodą dot blot/SDS-PAGE). Jeśli pierwsza runda screeningu ekspresji nie przyniesie rezultatów, próbuje się alternatywnych warunków hodowli. Jeśli konstrukty dają rozpuszczalne białka w wystarczająco wysokich wydajnościach, można przeprowadzić mikroanalizy i kontrolę jakości, a w razie potrzeby przejść do produkcji na dużą skalę. W przypadku celów, w których wydajność białek rozpuszczalnych jest zbyt niska, screening ekspresji można kontynuować przy użyciu alternatywnych szczepów i temperatur, a następnie innych partnerów fuzyjnych i ekspresji periplazmatycznej. Kroki opcjonalne są zaznaczone przerywanymi ramkami.

Schemat zautomatyzowanego ustawienia laboratorium zawierający sloty MP4 i MP3 do przetwarzania i analizy próbek.
Rysunek 4. Konfiguracja stołu roboczego robota dla platformy HTP. Przedstawiono układ stołu roboczego naszego robota do przenoszenia cieczy, choć można stosować alternatywne stoły robocze, pod warunkiem dostępności równoważnych stanowisk. Konfiguracja składa się ze stacji myjącej (WS) dla (8-kanałowej głowicy do przenoszenia cieczy (LiHa)), dwóch nośników mikropłytek z 4 pozycjami każdy (MP4, pozycje 1-4 i 5-8), stacji próżniowej z 2 pozycjami (Te-VacS, pozycje 9 i 10), nośnika mikropłytek z 3 pozycjami (MP3, pozycje 11-13), dwóch wstrząsarek do płytek z 2 pozycjami każda (Te-Shakers, pozycje 14-15 i 16-17) oraz nośnika na jednorazowe końcówki z 3 pozycjami (DiTi, pozycje 18-20). Dodatkowo znajdują się dwa nośniki typu „hotel” dla płytek głębokich oraz jeden dla mikropłytek (nie pokazano). Sprzętem zainstalowanym na robocie do przenoszenia cieczy jest 96-kanałowe ramię wielokanałowe (MCA96) do użytku z jednorazowymi końcówkami, 8-kanałowa głowica do przenoszenia cieczy (LiHa) ze stałymi końcówkami oraz manipulator robotyczny (RoMa), który przemieszcza płytki/sprzęt na stole roboczym. Numeracja pozycji jest przywoływana w całym protokole.

Podział płytki PCR96 na cztery płytki TC24; schemat rozmieszczenia studni dla dystrybucji próbek.
Rycina 5. Schemat przenoszenia z jednej płytki 96-dołkowej do czterech płytek 24-dołkowych.

Analiza ekspresji białek; wirtualny żel, mostki dwusiarczkowe, punkty izoelektryczne; wyniki w formie wykresów słupkowych, punktowych i ESI-MS.
Rysunek 6. Przedstawiono reprezentatywne wyniki screeningu ekspresji 96 białek jadu bogatych w mostki dwusiarczkowe. Białka wyeksponowano jako fuzje HIS-DsbC w cytoplazmie i oczyszczono przy użyciu 50 µl żywicy niklowej (Protokół 8.2-B). A) Wyniki screeningu ekspresji, przedstawiające wirtualny żel oraz punktację wydajności ekspresji. Kontrast w wirtualnym żelu został dostosowany dla poszczególnych ścieżek, aby skompensować bardzo słabe lub intensywne prążki. Należy zauważyć, że dla niektórych celów widoczne są dwa prążki: górny odpowiada nienaruszonemu białku fuzyjnemu, a dolny samemu znacznikowi fuzyjnemu. B) Proporcja białek wyeksponowanych na każdym poziomie ekspresji w porównaniu do liczby mostków dwusiarczkowych w białku. Rzeczywista liczba białek w każdej grupie jest naniesiona na wykres. C) Rozkład poziomów ekspresji w zależności od punktu izoelektrycznego (pI) i liczby reszt. D) Przykład wyników spektrometrii mas dla białka jadu bogatego w mostki dwusiarczkowe o masie 5,7 kDa z 4 mostkami dwusiarczkowymi. Spektrum po lewej stronie przedstawia białko przed redukcją przy użyciu DTT, a spektrum po prawej stronie białko zredukowane DTT i następnie odsolone. Jony odpowiadające masom eksperymentalnym są zaznaczone strzałkami, a ich przypisania pokazano na zielono. Eksperymentalne masy białka przed i po redukcji przedstawiono w tabeli; wykazują one różnicę masy wynoszącą 8 Da, co odpowiada obecności utlenionego białka przed dodaniem reduktora. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

KomponentRecepturaKomentarz
ZY~928 ml
10 g tryptonu
5 g ekstraktu drożdżowego
925 ml wody		Wymieszać, a następnie wysterylizować w autoklawie.
2 M MgSO₄4100 ml
49,3 g MgSO44·7H2O
ok. 60 ml wody		Mieszać do czasu rozpuszczenia, a następnie wysterylizować w autoklawie.
50x 50521 L
250 g glicerolu
730 ml wody
25 g glukozy
100 g α-laktozy		Dodawać kolejno, mieszać podgrzewając do całkowitego rozpuszczenia, a następnie wysterylizować w autoklawie.
20x NPS1 L
900 ml wody
66 g (NH4)2SO4
136 g KH2PO4
142 g Na2HPO4		Dodawać sekwencyjnie i mieszać do całkowitego rozpuszczenia, a następnie wysterylizować w autoklawie.

Tabela 1. Skład komponentów pożywki ZYP-5052.

Dyskusja

Nie ma jednego uniwersalnego protokołu ekspresji rozpuszczalnych, pofałdowanych, funkcjonalnych białek. Aby być efektywnym kosztowo i czasowo, większość laboratoriów lub ośrodków zajmujących się rdzeniami białkowymi pracującymi z wieloma celami korzysta z wysokoprzepustowych badań przesiewowych ekspresji białek w celu znalezienia najlepszej "ogólnej" kombinacji zmiennych w celu uzyskania rozpuszczalnego białka aktywnego dla większości celów. Zidentyfikowaliśmy DsbC jako ogólnie stosowanego partnera fuzyjnego do rozpuszczalnej ekspresji peptydów i białek bogatych w dwusiarczki11. Korzystając z fuzji DsbC i metod wysokoprzepustowych, w ciągu tygodnia można zaobserwować rozpuszczalną ekspresję wielu celów11 , a następnie dodatkowe zmienne, takie jak te omówione we wprowadzeniu, mogą być badane w kolejnych rundach na tych celach, które wymagają dalszej optymalizacji. Opisane w niniejszym dokumencie protokoły mają na celu ekspresję białek i peptydów bogatych w dwusiarczki. Jednak dla użytkowników, którzy chcą eksprymować białka niesiatkowane w sposób wysokoprzepustowy, odpowiednie protokoły zostały opublikowane wcześniej i można je znaleźć gdzie indziej22,24.

Konfiguracja o wysokiej przepustowości jest idealna do wielu zastosowań, w tym do badań przesiewowych dużej liczby różnych białek pod kątem rozpuszczalnej ekspresji lub do badań przesiewowych dużej liczby konstruktów ekspresyjnych (w tym różnych znaczników fuzyjnych) dla kilku genów docelowych w tym samym czasie (lub wielu konstruktów ekspresji dla jednego celu) w celu poprawy wskaźników sukcesu. Platforma może być również wykorzystywana do analizy porównawczej i walidacji nowych protokołów dla dużej liczby celów. Inne zastosowania obejmują badania przesiewowe wariantów dla jednego trudnego celu, np. wszystkich ortologów lub członków tej samej rodziny, lub do testowania sukcesu produkcji panelu mutantów jednego celu w jednym eksperymencie. Protokół ten został również wykorzystany w połączeniu z wektorami koekspresji (tylko z jednym znakowanym białkiem), aby umożliwić ściągnięcie i wstępną charakterystykę kompleksów białko-białko, a następnie dokładniejszą analizę biofizyczną w celu potwierdzenia prawidłowego tworzenia kompleksów i stechiometrii33. Ilość oczyszczonego białka jest czasami odpowiednia do mikrotestów (testy funkcjonalne, testy interakcji białko-DNA34 lub białko-białko). Strategia wysokoprzepustowych badań przesiewowych ekspresji ma kilka zalet: (i) możliwość testowania dużej liczby celów lub dużej liczby zmiennych w jednym eksperymencie, (ii) ograniczona zmienność między partiami, (iii) prostota i łatwość pracy na mniejszą skalę przy użyciu studni głębinowych, (iv) skalowalność i odtwarzalność na większą skalę, (v) potencjał automatyzacji, oraz (vi) prostota śledzenia i obsługi (brak etykietowania pojedynczych probówek, mniej błędów popełnianych przy stosowaniu formatu płytek niż przy obchodzeniu się z pojedynczymi probówkami podczas mieszania lub wymiany klonów).

Chociaż nie zostało to omówione w sekcji dotyczącej protokołu, istnieje kilka ważnych kwestii związanych z przygotowaniem eksperymentu, które zostaną pokrótce omówione poniżej. Bardziej szczegółowe omówienie tej kwestii można znaleźć w naszej poprzedniej publikacji24. Aby uzyskać maksymalną wydajność, korzystne jest posiadanie odpowiedniego systemu do klonowania o wysokiej przepustowości, aby uprościć podklonowanie dużej liczby celów. W początkowej fazie projektu VENOMICS wykorzystujemy wszechstronny system rekombinacji Gateway25 , który umożliwia subklonowanie w dowolnym wektorze docelowym w tempie setek klonów tygodniowo. Protokoły klonowania rekombinacji bramki można znaleźć na stronie internetowej Invitrogen. Inne alternatywy dla klonowania wysokoprzepustowego obejmują klonowanie niezależne od ligacji (LIC)35,36 i klonowanie bez ograniczeń (RF)37. Istnieje wiele sposobów pozyskiwania genów docelowych do ekspresji, w tym metodą PCR z matrycowego DNA, z wejściowych kolekcji klonów lub w postaci genów syntetycznych, co jest strategią wybraną w ramach projektu VENOMICS. Geny syntetyczne można uporządkować z miejscami rekombinacji na każdym końcu genu, a synteza genów umożliwia łatwą optymalizację kodonów docelowej sekwencji genów (w celu wykluczenia rzadkich kodonów E. coli ). Jest to zalecane, ale nie jest konieczne. W przypadku celów bez optymalizacji kodonów, które zawierają dużą liczbę rzadkich kodonów, Rosetta 2 (DE3) pLysS (który przenosi tRNA dla rzadkich kodonów, które nie są wysoko eksprymowane w E. coli) może być lepiej dopasowany niż BL21 (DE3) pLysS. Chociaż dostępne są szczepy, które ograniczają redukcję wiązań dwusiarczkowych w normalnie redukującym środowisku cytoplazmy, w naszych rękach nie odniosły one takiego sukcesu, jak zwykłe szczepy E. coli 11.

Oczyszczanie powinowactwa w skali analitycznej z kultur ekspresji testowej przeprowadza się w celu odzyskania rozpuszczalnych białek fuzyjnych i ilościowego określenia wydajności. Można uzyskać dane ilościowe dotyczące wydajności rozpuszczalnych białek fuzyjnych wyrażonych w zakresie 0,1 – 100 mg/L hodowli. Jeśli wzorzec nie jest rozpuszczalny, można przetestować alternatywne temperatury, szczepy lub pożywki przed poszukiwaniem różnych partnerów do fuzji. W przypadku rozpuszczalnej ekspresji białek bogatych w dwusiarczki wcześniej uszeregowaliśmy wpływ partnerów fuzyjnych jako DsbC > DsbA > GST > MBP > TRX > znacznikiem HIS dla ekspresji cytoplazmatycznej11. Ekspresja peryplazmatyczna to kolejna możliwość, która może pomóc w pomyślnym fałdowaniu celów bogatych w dwusiarczek. Peryplazma jest mniej redukującym środowiskiem niż cytoplazma i zawiera przydatne białka opiekuńcze redoks, które wspomagają wiązanie dwusiarczków. Białka DsbC, DsbA i MBP są zwykle zlokalizowane w peryplazmie przez ich peryplazmatyczne sekwencje sygnałowe. Daje to możliwość wykorzystania tych znaczników do skierowania celów bogatych w dwusiarczki do przestrzeni peryplazmatycznej, aby wspomóc fałdowanie. W przypadku celów trudnych do opanowania, następnym krokiem byłoby oczyszczenie nierozpuszczalnego celu oznaczonego przez HIS z ciał inkluzyjnych, rozpuszczenie i ponowne złożenie (wykracza to poza zakres tego protokołu i nie będzie tutaj omawiane39). Może to być dość proste w przypadku celów z tylko jednym lub dwoma wiązaniami dwusiarczkowymi, ale staje się coraz trudniejsze wraz ze wzrostem liczby wiązań dwusiarczkowych. Alternatywnie, szczególnie w przypadku białek i peptydów z czterema lub więcej wiązaniami dwusiarczkowymi, korzystne może być wypróbowanie bardziej złożonych systemów produkcji, takich jak ekspresja drożdży, owadów lub ssaków.

Dzięki postępom w miniaturyzacji i automatyzacji, technologie HTP Electrophysiology lab-on-a-chip28 bez wątpienia staną się przyszłością dla analiz funkcjonalnych. Przewidujemy, że w większości celów (być może z wyjątkiem badań strukturalnych) zaneguje to potrzebę kultur na dużą skalę. Hodowle na małą skalę będą nie tylko przydatne do badań przesiewowych warunków ekspresji, ale także będą w stanie zapewnić wystarczającą ilość próbki do tych zminiaturyzowanych testów funkcjonalnych. Zdolność do równoległego wytwarzania wielu celów w ilościach wystarczających do charakterystyki funkcjonalnej obniży koszty hodowli, a przy użyciu tego rodzaju platform, ekspresja i charakterystyka rekombinowanych białek stanie się bardziej opłacalna i czasodajna.

Protokoły zawarte w niniejszym dokumencie zostały zastosowane do ekspresji peptydów i białek bogatych w dwusiarczki w początkowej fazie europejskiego projektu VENOMICS realizowanego w ramach 7PR. Jady są doskonałym źródłem bioaktywnych peptydów, które często mają ciekawy potencjał farmakologiczny. Jednak ich produkcja jest trudna ze względu na złożone wzorce wiązań dwusiarczkowych i niewielkie rozmiary. Korzystając z wysokoprzepustowych platform, takich jak opisana w niniejszym dokumencie, projekt VENOMICS ma na celu stworzenie biblioteki 10 000 nowych peptydów jadowych, aby odtworzyć różnorodność obserwowaną w przyrodzie. Biblioteka ta zostanie wykorzystana do scharakteryzowania peptydów bogatych w dwusiarczki o potencjalnych zastosowaniach farmakologicznych lub terapeutycznych w celu opracowania nowych leków. Platforma jest obecnie wykorzystywana do analizy porównawczej i walidacji nowych protokołów do wykorzystania w projekcie VENOMICS.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez projekt VENOMICS, europejski grant nr 278346 w ramach Siódmego Programu Ramowego (FP7 ZDROWIE 2011-2015). Projekt VENOMICS jest wynikiem współpracy między kilkoma instytucjami badawczymi i firmami z Europy:

AFMB, Aix-Marseille Université (Francja), CEA Saclay (Francja), NZYTech (Portugalia), SistemasGenomicos (Hiszpania), University de Liège (Belgia), VenomeTech (Francja), Vitamib (Francja), Zealand Pharma (Dania)

Ta praca była wspierana przez Francuską Infrastrukturę dla Zintegrowanej Biologii Strukturalnej (FRISBI) ANR-10-INSB-05-01.

Autorzy chcieliby również podziękować Panu Jeremy'emu Turchetto za pomoc w przygotowaniach do kręcenia filmu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Robot do obsługi cieczy Tecan Freedom EVO 200Tecan Group Sp. z o.o.Protokoły można dostosować do dowolnego robota do obsługi cieczy z kolektorem próżniowym do płytek.
http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2694&ID=5270&Menu=1&Item=21.1.8
96-dołkowe płytki do PCR (PCR96)Greiner Bio-One652270http://us.gbo.com/bioscience/detail/2504/
LB podłożeAutoklawowane dla sterylności.
ZapasyKanamycyna (50 mg/ml), ampicylina (100 mg/ml), chloramfenikol (34 mg/ml w etanolu), zapasy magazynowe o temperaturze − 20 °C. Użyj rozcieńczenia 1:1,000.
Płytka Deep-well 96 (DW96) o pojemności 2,42 mlGreiner Bio-One780270Autoklawizowana do sterylności.
http://us.gbo.com/bioscience/detail/2462/
WektoryDo ekspresji konstruktów docelowych. Przechowywać w − 20 stopni Celsjusza.
BL21 (DE3) kompetentne komórkiLub alternatywny szczep ekspresji E. coli według wyboru użytkownika. Przechowywać w − 80 stopni Celsjusza.
Oddychająca folia samoprzylepna BreathsealMaszyna do PCR Greiner Bio-One676050
z 96-dołkowym blokiemDo transformacji, szoku cieplnego i wrzenia próbek SDS-PAGE/Caliper.
24-dołkowe sterylne płytki do hodowli tkanekGreiner Bio-One662165http://us.gbo.com/bioscience/detail/2220/
LB-agarAutoklawizowane w celu zapewnienia sterylności.
200 μ l sterylne jednorazowe końcówkiTecan Group Ltd.30 038 617http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2
Inkubator z wytrząsaniem Multitron, o skoku 3 mmInforsAJ103Nie jest to konieczne, można również użyć zwykłego inkubatora z wytrząsaniem.
http://www.infors-ht.com/index.php/en/
Inkubator płytkowy Płytka
do mikromiareczkowaniaDla zapasów glicerolu i elucji przy użyciu protokołu oczyszczania B.
GlicerolDo przygotowania zapasów glicerolu.
200 μ l jednorazowe końcówkiTecan Group Ltd.30 038 616http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2
Podkładki z taśmą klejącą Qiagen19570http://www.qiagen.com/Products/Catalog/Lab-Essentials-and-Accessories/Tape-Pads
BactinylOrapi GroupLub równoważny mikrobiologiczny środek dezynfekujący.
ZYP-5052 mediumPatrz Tabela 1 dla receptur składników.
Studnia głębinowa 24 (DW24) płytki, pojemność 10 mlWhatman7701-5102Autoklawowany do sterylności.
http://www.whatman.com/UNIPLATECollectionandAnalysisMicroplates.aspx#7701-5102
Płaskodenna, przezroczysta płytka do mikromiareczkowaniaGreiner Bio-One655101Do odczytów absorbancji.
http://us.gbo.com/bioscience/detail/2029/
Spektrofotometrdo odczytu płytekFakultatywny. Do pomiaru OD600 kultur.
Wirówka z wirnikiem do płytek głębinowych Nadaje się do 3 800 x g.
Lizozym50 mg/ml w wodzie. Przechowywać w − 20 stopni Celsjusza.
Imidazol klasy ACS MerckIX0005-1Należy stosować wysokiej jakości imidazol wysokiej jakości, aby nie zakłócał odczytów A280 do obliczania wydajności białka.
Bufor50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol pH 8 zawierający 0,25 mg/ml lizozymu (lub preferowany bufor). Za każdym razem dodawaj lizozym z zapasów i nie przechowuj przez dłuższy czas.
wodna
Sonikator płytowy (Procesor ultradźwiękowy XL, przystosowany do płyt głębinowych)Misonix Inc.Nieistotnie. Sam lizozym jest zwykle wystarczający do prawie całkowitej lizy.
DNaza 2 mg/ml bulionu w wodzie, wysterylizowany filtrem. Przechowuj podwielokrotności w − 20 stopni Celsjusza.
Siarczan magnezu (MgSO4)2 M zapas w wodzie, w autoklawie.
SDS-PAGE lub bufor próbki suwmiarki 
Bufor50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol pH 8 (lub preferowany bufor). Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Bufor50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazol pH 8 (lub preferowany bufor). Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Bufor50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol pH 8 (lub preferowany bufor). Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
96-dołkowy odbiornik/płyta filtracyjna 20 µ m, pojemność 1,8 mlMacherey-Nagel740686.4http://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/Accessories/tabid/10909/language/en-US/Default.aspx
200 μ l jednorazowe końcówki o szerokim otworzeTecan Group Ltd.30 050 348http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2
Ni Sepharose 6 Żywica Fast FlowGE Healthcare17-5318-02Do oczyszczania docelowych białek fuzyjnych. Przechowywać w temperaturze 4 stopni C. Przed użyciem umyć i zrównoważyć.
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences/17531802
wirusa wytrawiania tytoniu (TEV)Opcjonalnie, do rozszczepienia. 2 mg/ml, bez środków redukujących w buforze do przechowywania. Przechowywać w − 80 stopni Celsjusza.
96-dołkowy 0,22 &mikro; m płyta filtracyjnaMilliporeMSGV N22 10Opcjonalnie. Do filtrowania frakcji rozpuszczalnej po rozszczepieniu.
http://www.millipore.com/catalogue/item/msgvn2210
SDS-PAGE/sprzęt do punktowego blot lub sprzętAparatura do elektroforezy i wybór rodzaju żelu należy do użytkownika s uznania.
Spektrofotometr i kuwetyDo pomiaru absorbancji przy 280 nm (A280) w celu obliczenia wydajności rozpuszczalnych białek. Nie jest to wymagane, jeśli analiza jest wykonywana na suwmiarce.
Końcówki do pipet ZipTipMilliporeOpcjonalnie. Typ ZipTip zależy od uznania użytkownika. Żywica C4 powinna być stosowana do większych białek, natomiast do peptydów C18 może być lepsza. Alternatywne metody odsalania próbek mogą być również stosowane do oczyszczania próbek przed dalszą kontrolą jakości.
http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737#0
Materiały są wymienione w kolejności, w jakiej są wymagane, w sekcji Protokół. Odczynniki można przechowywać w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej. Numery piśmiennictwa dla autora" Zapewniony jest preferowany wybór materiałów, jednak odpowiednie mogą być również równoważne produkty. W przypadku odczynników, w przypadku których marka nie będzie miała wpływu na wynik eksperymentu, dane firmy zostały pominięte.
antybiotyków ekspresji pLysS płytek do lizy Kąpiel wiążący płuczący elucyjny Proteaza Caliper Labchip GXII

Bibliografia

  1. Berrow, N. S., et al. Recombinant protein expression and solubility screening in Escherichia coli: a comparative study. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 62, 1218-1226 (2006).
  2. Correa, A., Oppezzo, P. Tuning different expression parameters to achieve soluble recombinant proteins in E. coli: advantages of high-throughput screening. Biotechnol J. 6, 715-730 (2011).
  3. Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nat Methods. 5, 135-146 (2008).
  4. Vera, A., Gonzalez-Montalban, N., Aris, A., Villaverde, A. The conformational quality of insoluble recombinant proteins is enhanced at low growth temperatures. Biotechnol Bioeng. 96, 1101-1106 (2007).
  5. Graslund, S., et al. The use of systematic N- and C-terminal deletions to promote production and structural studies of recombinant proteins. Protein Expr Purif. 58, 210-221 (2008).
  6. Bird, L. E. High throughput construction and small scale expression screening of multi-tag vectors in Escherichia coli. Methods. 55, 29-37 (2011).
  7. Davis, G. D., Elisee, C., Newham, D. M., Harrison, R. G. New fusion protein systems designed to give soluble expression in Escherichia coli. Biotechnol Bioeng. 65, 382-388 (1999).
  8. Kapust, R. B., Waugh, D. S. Escherichia coli maltose-binding protein is uncommonly effective at promoting the solubility of polypeptides to which it is fused. Protein science: a publication of the Protein Society. 8, 1668-1674 (1999).
  9. LaVallie, E. R., Lu, Z., Diblasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., McCoy, J. M. Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli. Methods Enzymol. 326, 322-340 (2000).
  10. Marblestone, J. G., et al. Comparison of SUMO fusion technology with traditional gene fusion systems: enhanced expression and solubility with SUMO. Protein science: a publication of the Protein Society. 15, 182-189 (2006).
  11. Nozach, H., et al. High throughput screening identifies disulfide isomerase DsbC as a very efficient partner for recombinant expression of small disulfide-rich proteins in E. coli. Microb Cell Fact. 12, 37(2013).
  12. Sachdev, D., Chirgwin, J. M. Fusions to maltose-binding protein: control of folding and solubility in protein purification. Methods Enzymol. 326, 312-321 (2000).
  13. Smith, D. B. Generating fusions to glutathione S-transferase for protein studies. Methods Enzymol. 326, 254-270 (2000).
  14. de Marco, A., Deuerling, E., Mogk, A., Tomoyasu, T., Bukau, B. Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli. BMC Biotechnol. 7, 32(2007).
  15. Hatahet, F., Nguyen, V. D., Salo, K. E., Ruddock, L. W. Disruption of reducing pathways is not essential for efficient disulfide bond formation in the cytoplasm of E. coli. Microb Cell Fact. 9, 67(2010).
  16. de Marco, A. Recent contributions in the field of the recombinant expression of disulfide bonded proteins in bacteria. Microb Cell Fact. 11, 129(2012).
  17. Katzen, F., Beckwith, J. Disulfide bond formation in periplasm of Escherichia coli. Methods Enzymol. 348, 54-66 (2002).
  18. Klint, J. K., et al. Production of recombinant disulfide-rich venom peptides for structural and functional analysis via expression in the periplasm of E. coli. PloS One. 8, e63865(2013).
  19. Braud, S., et al. Dual expression system suitable for high-throughput fluorescence-based screening and production of soluble proteins. Journal of Proteome Research. 4, 2137-2147 (2005).
  20. Douzi, B. G. A., et al. A new system for expressing recombinant animal toxins in E. coli. (Collection Rencontres en Toxicologie, Publications de la SFET, Chatenay-Malabry). Advances and new technologies in toxinology. , 149-152 (2010).
  21. Groisillier, A., et al. MARINE-EXPRESS: taking advantage of high throughput cloning and expression strategies for the post-genomic analysis of marine organisms. Microb Cell Fact.. 9, 45(2010).
  22. Vincentelli, R., et al. High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli. Methods. 55, 65-72 Forthcoming.
  23. Xiao, R., et al. The high-throughput protein sample production platform of the Northeast Structural Genomics Consortium. Journal of Structural Biology. 172, 21-33 (2010).
  24. Saez, N. J., Vincentelli, R. Ch3 High-throughput expression screening and purification of recombinant proteins in E. coli. Structural Genomics: General Applications : Methods in Molecular Biology. Chen, Y. W. 1091, Humana Press. 33-53 (2014).
  25. Katzen, F. Gateway (R) recombinational cloning: a biological operating system. Expert. Opin. Drug Discov. 2, 571-589 (2007).
  26. Vincentelli, R., Canaan, S., Offant, J., Cambillau, C., Bignon, C. Automated expression and solubility screening of His-tagged proteins in 96-well format. Analytical Biochemistry. 346, 77-84 (2005).
  27. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr Purif. 41, 207-234 (2005).
  28. Spencer, C. I., et al. Ion channel pharmacology under flow: automation via well-plate microfluidics. Assay Drug Dev Technol. 10, 313-324 (2012).
  29. Sala, E., de Marco, A. Screening optimized protein purification protocols by coupling small-scale expression and mini-size exclusion chromatography. Protein Expr Purif. 74, 231-235 (2010).
  30. Moon, A. F., Mueller, G. A., Zhong, X., Pedersen, L. C. A synergistic approach to protein crystallization: combination of a fixed-arm carrier with surface entropy reduction. Protein science: a publication of the Protein Society. 19, 901-913 (2010).
  31. Zanier, K., et al. Structural basis for hijacking of cellular LxxLL motifs by papillomavirus E6 oncoproteins. 339, Science. New York, N.Y. 694-698 (2013).
  32. Kapust, R. B., Tozser, J., Copeland, T. D., Waugh, D. S. The P1' specificity of tobacco etch virus protease. Biochemical and Biophysical Research Communications. 294, 949-955 (2002).
  33. Vincentelli, R., Romier, C. Expression in Escherichia coli: becoming faster and more complex. Current Opinion in Structural Biology. 23, 326-334 (2013).
  34. Jolma, A., et al. DNA-binding specificities of human transcription factors. Cell. 152, 327-339 (2013).
  35. Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research. 18, 6069-6074 (1990).
  36. Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. Rapid, reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors. BioTechniques. 13, 515-518 (1992).
  37. van den Ent, F., Lowe, J. RF cloning: a restriction-free method for inserting target genes into plasmids. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 67, 67-74 (2006).
  38. Vincentelli, R., et al. High-throughput automated refolding screening of inclusion bodies. Protein science: a publication of the Protein Society. 13, 2782-2792 (2004).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wysokoprzepustowy screening ekspresjioczyszczanie bia ek rekombinowanychprodukcja bia ek w E colichromatografia powinowactwa do zimmobilizowanych metalizautomatyzowany robot do obs ugi cieczyilo ciowe oznaczanie bia ek rozpuszczalnychscreening ekspresji bia ekoczyszczanie bia ek fuzyjnychanaliza spektrometri mas
Wysokoprzepustowe ilościowe badania przesiewowe i oczyszczanie stosowane do rekombinowanych, bogatych w dwusiarczki białek jadowych wytwarzanych w E. coli
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.