Wysokoprzepustowe ilościowe badania przesiewowe i oczyszczanie stosowane do rekombinowanych, bogatych w dwusiarczki białek jadowych wytwarzanych w E. coli

Motywowany postępem genomiki i przyspieszonym tempem odkrywania nowych białek, opracowano wysokoprzepustowe rurociągi, aby zrównoleglić tradycyjne podejścia do badań przesiewowych i identyfikacji optymalnych strategii produkcji białek. Potencjalne zmienne, które należy zoptymalizować, obejmują między innymi różne szczepy^{ekspresji 1,2}, temperaturę^3,4, pożywkę^2,3, warianty docelowe⁵, partnerów fuzyjnych^6-13, koekspresję z białkami opiekuńczymi^14,15, ekspresję cytoplazmatyczną lub peryplazmatyczną^16-18 oraz składniki buforu oczyszczającego³. Dzięki wdrożeniu podejść o wysokiej przepustowości można równolegle testować wiele zmiennych lub wiele celów z wysokim poziomem wydajności, przy jednoczesnym ograniczeniu zmienności między partiami. Z naszego doświadczenia wynika, że strategia zapewnia również dobrą odtwarzalność po zwiększeniu skali przy użyciu tych samych kultur (temperatura, pożywka, napowietrzanie itp.) i warunków oczyszczania (ta sama żywica, itp.). W ciągu ostatniej dekady wykorzystano kilka wysokoprzepustowych platform do identyfikacji warunków ekspresji rozpuszczalnych białek, a mianowicie poprzez różne parametry, takie jak partnerzy fuzyjny, szczepy ekspresji lub temperatura^19-23.

Ostatnio użyliśmy naszego wysokoprzepustowego podejścia do badania przesiewowego do ekspresji rozpuszczalnych białek bogatych w dwusiarczki¹¹. Wybrane białka pochodziły nie tylko ze źródeł jadowitych, ale zawierały również bogate w dwusiarczki inhibitory enzymów z szerokiej gamy gatunków, w tym roślin, świń, krów i ludzi. W eksperymencie porównano wpływ 12 różnych partnerów fuzyjnych i trzech różnych szczepów ekspresyjnych na rozpuszczalność i fałdowanie 28 białek siatkowanych dwusiarczkiem. Wykazaliśmy, że użycie DsbC jako partnera fuzyjnego do produkcji w szczepie BL21 (DE3) pLysS znacznie przewyższało (zarówno pod względem wydajności, jak i liczby uzyskanych rozpuszczalnych białek) jakąkolwiek inną kombinację szczepu i fuzji¹¹. Wyniki tego eksperymentu stanowiły podstawę do adaptacji naszego pierwotnego ogólnego potoku o wysokiej przepustowości (który został wykorzystany do badania przesiewowego ekspresji szerokiego zakresu białek)^22,24 do bardziej odpowiedniego do ekspresji celów bogatych w dwusiarczki. Szczególnie interesujące są białka bogate w dwusiarczki pochodzące z jadów zwierzęcych. Jady są złożoną mieszaniną bioaktywnych peptydów i białek, o potencjalnej wartości farmakologicznej i terapeutycznej. Jednak ekspresja białek zawierających wiązania dwusiarczkowe nie jest trywialna. Białka te na ogół zawierają od jednego do siedmiu wiązań dwusiarczkowych i muszą być utlenione z odpowiednimi wzorcami wiązań dwusiarczkowych, aby były aktywne. Obecnie platforma jest wykorzystywana do badań przesiewowych ekspresji dużej liczby bogatych w dwusiarczki białek jadu zwierzęcego w ramach europejskiego projektu VENOMICS (www.venomics.eu) 7PR oraz do analizy porównawczej nowych protokołów dla wysokowydajnej ekspresji tysięcy celów. W tym przypadku zapewniono zautomatyzowaną metodę wysokoprzepustowego badania przesiewowego i oczyszczania ekspresji na małą skalę (patrz rysunek 1) stosowanej do bogatych w dwusiarczki białek jadu zwierzęcego. Strategia dla peptydów i białek bogatych w dwusiarczki wykorzystuje znacznik HIS do oczyszczania i aktywnego partnera fuzyjnego redoks, DsbC, tworząc rozszczepialne fuzje HIS-DsbC z białkami docelowymi (patrz rysunek 2).

Chociaż głównym celem tych protokołów jest automatyzacja za pomocą robota do obsługi cieczy i elektroforezy HTP, metody te są również odpowiednie dla wysokoprzepustowego podejścia ręcznego, co oznacza, że nawet laboratoria z podstawową konfiguracją mogą korzystać z protokołów bez żadnych warunków wstępnych dla drogiego sprzętu. Ręczne protokoły transformacji do oczyszczania i analizy (niespecyficzne dla białek bogatych w dwusiarczki) zostały opublikowane w innym miejscu²⁴ i nie będą tutaj powtarzane. Przepustowość procedury ręcznej (od klonu ekspresji, wytworzonego przez klonowanie rekombinacyjne²⁵, do analizy poziomów rozpuszczalnych białek) wynosi 96 (przy użyciu detekcji SDS-PAGE) lub 384 (przy użyciu 4 x 96; przy użyciu dot blot i SDS-PAGE²⁶) kultur tygodniowo (patrz ryc. 1). Wartość tę można zwiększyć, jeśli jest wykonywana w sposób półautomatyczny (przy użyciu robota do obsługi cieczy i elektroforezy punktowej²⁶ lub elektroforezy HTP, np. za pomocą systemu Caliper GXII LabChip²² do analizy wyników) do 1 152 (12 x 96) kultur równolegle przez jeden tydzień, jak opisano w niniejszym dokumencie. Hodowlę przeprowadza się w formacie Deep Well 24 (DW24), dzięki czemu można stosować regularne inkubatory z wytrząsaniem w przeciwieństwie do kultur hodowanych w formacie Deep Well 96 (DW96), które wymagają stosowania krótkich orbitalnych inkubatorów z szybkim wytrząsaniem w celu wystarczającego napowietrzenia (wytrząsanie przy 800 obr./min). Zastosowanie nośników z automatyczną indukcją²⁷ upraszcza również odciąganie pokarmu, eliminując etap indukcji ręcznej. Nawet tam, gdzie laboratoria już stosują predefiniowane warunki odciągania i oczyszczania, można je przenieść bezpośrednio do tego systemu HTP po prostu w celu poprawy wydajności. Szczegółowy schemat wysokoprzepustowego procesu przesiewowego białek bogatych w dwusiarczki przedstawiono na rysunku 3. Parametry w pipeline zostały dobrane na podstawie obszernych eksperymentów przesiewowych ^11,22, które pozwoliły nam wybrać najbardziej przydatne warunki do produkcji białka.

Charakterystyka może być przeprowadzona na oznakowanych białkach oczyszczonych bezpośrednio z ekspresji na małą skalę w badaniach pilotażowych, gdzie wystarczają dziesiątki mikrogramów próbki, lub dla czułych testów funkcjonalnych i testów wiązania (na przykład, systemy zacisków krosowych HTP o małej objętości²⁸). To samo można wykonać nawet na nieoznakowanych celach po rozszczepieniu, pod warunkiem, że znacznik i proteaza zostaną usunięte (na przykład za pomocą HPLC z odwróconą fazą). Kontrolę jakości można również przeprowadzić za pomocą spektrometrii mas (w celu potwierdzenia oczekiwanej wielkości i stopnia utlenienia) lub metod chromatograficznych (w celu potwierdzenia czystości lub niejednorodności)²⁹. Czasami rozszczepienie znaczników jest niepotrzebne lub nawet niepożądane (szczególnie w przypadku słabo rozpuszczalnych białek^30,31), więc w tym protokole rozszczepienie jest opcjonalne. Niezależnie od tego, we wszystkich konstruktach znajduje się miejsce cięcia proteazy TEV (ENLYFQ/[G]³²) bezpośrednio poprzedzające gen docelowy w celu wytworzenia natywnego białka po rozszczepieniu (patrz Ryc. 2 i Dyskusja). Jeśli pożądane jest rozszczepienie znacznika fuzyjnego, rozszczepienie można przetestować (na frakcji elucyjnej lub "na kolumnie") w małej skali w celu analizy wydajności, optymalizacji warunków w razie potrzeby i uzyskania wiarygodnych szacunków wydajności dla kolejnych eksperymentów na dużą skalę.

Są dwie opcje dotyczące ilości koralików używanych podczas oczyszczania powinowactwa, w zależności od celów i oczekiwań eksperymentu. Aby móc wychwycić jak największą ilość białka (w celu oczyszczenia do testów pilotażowych lub MS lub w celu ekstrapolacji w celu zwiększenia wydajności), należy użyć końcowej objętości 200 μl żywicy, umożliwiającej wykrycie rozpuszczalnego białka w zakresie 1-100 mg/l kultury przed nasyceniem systemu (patrz protokół (A) w sekcji 8.1). Jeżeli jednak celem doświadczenia jest wykrycie niewielkich ilości rozpuszczalnych białek, wówczas odpowiednia jest końcowa objętość 50 μl żywicy, pozwalająca na wykrycie rozpuszczalnego białka w zakresie 0,1-25 mg/l kultury (patrz protokół (B) w sekcji 8.2).

Produkcja może być zwiększana, jeśli jest to wymagane, aby uzyskać miligramowe ilości oczyszczonych celów do dalszych badań strukturalnych i funkcjonalnych przy użyciu warunków określonych dla rozpuszczalnego wyrażenia. Szczegóły dotyczące protokołów scale-up stosowanych w AFMB zostały omówione w innym miejscu^22,24.

Dalsze szczegóły dotyczące konfiguracji eksperymentalnej, krytycznych kroków w protokole, modyfikacji i rozwiązywania problemów oraz ograniczeń techniki znajdują się w dyskusji. Prosimy o zapoznanie się z dyskusją przed rozpoczęciem eksperymentów.

We wszystkich protokołach oczekujemy wskaźnika sukcesu na poziomie 90% na każdym kroku (na przykład, co najmniej 90% kultur musi rosnąć na danym etapie). Jeśli wskaźnik powodzenia któregokolwiek kroku w eksperymencie spadnie poniżej 90%, próbki są odrzucane, a eksperyment jest powtarzany dla pełnej kolekcji konstruktów. Jednak ten wskaźnik sukcesu nie ma zastosowania do liczby konstruktów, które wyrażają się jako rozpuszczalne białka, ani do proporcji konstruktów, które rozszczepiają się ze 100% wydajnością, ponieważ będzie to w dużym stopniu zależało od badanych białek.

Szczegółowe informacje dotyczące konfiguracji stołu roboczego robota są podane dla każdego protokołu (zobacz również Rysunek 4), jednak mogą być dostosowane do alternatywnych ustawień stołu roboczego. Osprzęt robota (Tecan) składa się z 96-kanałowego ramienia (MCA96), manipulatora robota (RoMa) i 8-kanałowej głowicy do obsługi cieczy (LiHa). Wszystkie czynności przy użyciu MCA96 można również wykonać za pomocą LiHa, jeśli MCA96 nie jest dostępny, jednak zajmie to więcej czasu, ponieważ LiHa będzie musiał być myty między krokami. Chociaż z technicznego punktu widzenia robot nie jest sterylnym środowiskiem, włączenie antybiotyków generalnie zapewnia, że nie ma problemów z zanieczyszczeniem lub sterylnością.

Część A: Transformacja i wyrażenie testowe

Ręczne procedury klonowania²² i transformacji do oczyszczenia są omówione gdzie^{indziej 24}. Protokół transformacji można w pełni wykonać na robocie²⁶, ale zwykle bardziej efektywne czasowo jest wykonanie tego ręcznie. W związku z tym protokoły w niniejszym dokumencie rozpoczynają się od zaszczepienia ekspresji prekultur i posiewu przemiany z mieszanek transformacyjnych z szokiem cieplnym, wykonanych ręcznie. Więcej informacji na temat procedur ręcznego klonowania i przekształcania można znaleźć w odpowiednich pozycjach^{bibliograficznych 22,24}.

1. Hodowle wstępne i poszycie

1. Przygotuj stół roboczy robota (patrz rysunek 4 dla pozycji):
   1. Umieść koryto o pojemności 300 ml zawierające 150 ml sterylnego bulionu LB (uzupełnionego ampicyliną (100 μg/ml)/chloramfenikolem (34 μg/ml) lub innym odpowiednim antybiotykiem) w pozycji 8.
   2. Umieść sterylny DW96 w pozycji 11. Umieścić 4x wstępnie przygotowane 24-dołkowe płytki do hodowli tkankowych z agarem LB (Amp/Cam) (zawierające 2 ml agaru w każdej studzience) z pokrywkami w pozycjach od 14 do 17.
   3. Umieścić płytkę transformacyjną (zawierającą 96 mieszanek transformacyjnych po szoku cieplnym) w pozycji 13. Zostanie to wykorzystane do zaszczepienia płynnych kultur wstępnych i płytek agarowych LB. Umieść pudełko ze sterylnymi końcówkami do pipet o pojemności 200 μl w pozycji 18.
2. Za pomocą 96-kanałowego ramienia (MCA96) i końcówek o pojemności 200 μl zassać 200 μl bulionu LB (pozycja 8) i dozować do DW96 w pozycji 11. Powtarzaj, aż w każdej studzience DW96 znajdzie się końcowa objętość 1 ml bulionu LB. Stanie się to płynną prekulturą.
3. Za pomocą manipulatora robota (RoMa) zdejmij pokrywę pierwszej 24-dołkowej płytki agarowej LB i umieść ją w innym miejscu (na przykład w transporterze hotelowym), aż zostanie zakończone powlekanie tej płytki.
4. Za pomocą 8-kanałowej głowicy do obsługi cieczy (LiHa) wymieszać, a następnie zassać 50 μl pierwszej kolumny mieszanki transformacyjnej w pozycji 13. Ta objętość mieszanki transformacyjnej jest wystarczająca, aby dobrze pokryć LB-Agar.
5. Za pomocą pierwszych 4 kanałów dozować na pierwszą kolumnę pierwszej 24-dołkowej płytki agarowej LB w pozycji 14 (jak pokazano na rysunku 5).
6. Za pomocą ostatnich 4 kanałów dozować na drugą kolumnę pierwszej 24-dołkowej płytki agarowej LB.
7. Po dozowaniu dokładnie umyj wszystkie końcówki.
8. Kontynuuj ten proces, aż wszystkie przemiany zostaną posiane na pierwszej płytce w pozycji 14, przenosząc z dołka 96 do 24 przy użyciu schematu przedstawionego na rysunku 5.
9. Po zakończeniu pracy z pierwszą płytką użyj RoMa, aby założyć pokrywkę i zdejmij pokrywkę z następnej płytki w pozycji 15. Kontynuuj stosowanie schematu poszycia dla następnych 3 płytek.
10. Po zakończeniu powlekania ustaw Te-Shake na 1,200 obr./min i potrząsaj wszystkimi płytkami przez 1 minutę, aby uzyskać jednorodny rozkład mieszanki transformacyjnej.
11. Używając MCA96 i oryginalnych końcówek pipet, wymieszaj, a następnie odessaj 60 μl pozostałej mieszanki transformacyjnej (pozycja 13) i dozuj do DW96 zawierającego bulion LB w pozycji 11.
12. Uszczelnij prekultury DW96 oddychającą folią samoprzylepną, aby umożliwić napowietrzenie hodowli.
13. Umieścić w inkubatorze wytrząsającym o temperaturze 37 °C z maksymalną prędkością O/N (200/800 obr./min w zależności od orbitalu wytrząsarki).
14. Płytki agarowe LB należy umieścić w kapturze ze zdjętymi pokrywkami do wyschnięcia (10 min). Następnie umieszcza się je odwrócone w inkubatorze płytkowym o temperaturze 37 °C do następnego ranka.
15. Następnego dnia prekultura jest używana do inokulacji ekspresji testowej w pożywce autoindukcyjnej i do przygotowania zapasów glicerolu. Umieść płytki agarowe w lodówce, jako kopię zapasową. W razie konieczności, zaczynając od płytek agarowych lub zapasów gliceryny, ekspresję testową można powtórzyć poprzez bezpośrednie zaszczepienie świeżej prekultury LB.

2. Przygotowanie płyt DW24 ZYP-5052

UWAGA: Ta procedura zajmuje około 5 minut dla każdego zestawu 4x płyt DW24.

1. Uzupełnić 500 ml pożywki autoindukcyjnej ZYP-5052 dla każdej kontrpróby 96 kultur (464 ml pożywki ZY, 250 μl 2 M_MgSO4, 10 ml 50x 5052, 25 ml 20x NPS, w tej kolejności – przepisy dla każdego składnika podano w Tabeli 1) uzupełnionych odpowiednimi antybiotykami.
2. Przygotuj stół roboczy robota:
   1. Umieść dwie korytka o pojemności 300 ml, każda zawierająca ~250 ml pożywki w pozycji 5 i 6. Umieść cztery sterylne płytki DW24 w pozycjach od 14 do 17. Umieść końcówki o pojemności 200 μl w pozycji 18.
3. Za pomocą końcówek MCA96 i 200 μl odessać 200 μl ZYP-5052 z pozycji 5 i dozować do pierwszej płytki DW24 w pozycji 14. Zrób to w sumie 5 razy (4 końcówki zostaną jednorazowo dozowane do jednej studzienki, co daje w sumie 4 ml). Powtórz dla pozostałych 3 płytek DW24 w pozycjach od 15 do 17, przełączając się na ZYP-5052 w pozycji 6 dla dwóch ostatnich płytek DW24.

3. Inokulacja i wzrost kultur ekspresji testowej

UWAGA: Inokulacja trwa około 10 minut dla każdego zestawu 4x płytek DW24, a wzrost trwa O/N.

1. Przygotuj stół roboczy robota:
   1. Umieść tabliczkę DW96 zawierającą prekultury (z kroku 1.15) w pozycji 11. Umieść cztery płytki DW24 zawierające pożywkę ZYP-5052 (od kroku 2.3) w pozycjach od 14 do 17.
2. Używając LiHa odessać 100 μl kultury wstępnej z pozycji 11 w celu zaszczepienia kultur ekspresji testowej (rozcieńczenie 1/40) przy użyciu schematu przedstawionego na rysunku 5. Dokładnie umyj głowę LiHa w stacji mycia między każdą kolumną 96-dołkowych kultur wstępnych.
3. Uszczelnić płytki DW24 oddychającą folią i inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (200/400 obr./min) przez 4 godziny. Jest to czas fazy wzrostu, podczas której glukoza z pożywki zostanie preferencyjnie zubożona²⁷.
4. Obniżyć temperaturę do 17 °C. Po 4 godzinach i wyczerpaniu glukozy laktoza zacznie być metabolizowana, co doprowadzi do indukcji ekspresji, zapewniając optymalne warunki wzrostu dla BL21 (DE3) pLysS lub Rosetta 2 (DE3) pLysS, w tej pracy²². Pozostaw komórki do ekspresji O/N. Użyj pozostałej kultury wstępnej do wytworzenia zapasów glicerolu.

4. Przygotowanie zapasów glicerolu

UWAGA: Zapasy glicerolu powinny być sporządzane w trzech egzemplarzach, aby można je było przechowywać w różnych miejscach na wypadek awarii zamrażarki.

1. Przygotuj stół roboczy robota:
   1. Umieść płytki do mikromiareczkowania w pozycjach od 5 do 7, aby pomieścić zapasy glicerolu. Umieść koryto o pojemności 300 ml wypełnione 50 ml 100% glicerolu w pozycji 8. Umieścić DW96 zawierający 800 μl kultury wstępnej (po kroku 3.2) w każdym dołku w pozycji 11. Umieść końcówki o pojemności 200 μl w pozycji 18.
2. Korzystając z powolnej prędkości zasysania i dozowania, użyj końcówek MCA96 i 200 μl, aby dodać glicerol do DW96 zawierającego prekultury.
   1. Odessać 200 μl glicerolu (z pozycji 8).
   2. Najpierw dozuj 150 μl (w pozycji 11), a następnie zatrzymaj się na 20 sekund, aby pozostały glicerol dotarł do dolnej części końcówki. Dozować pozostałe 50 μl.
3. Używając tych samych końcówek, wymieszaj kulturę i glicerol w DW96 w pozycji 11, aż dokładnie się wymieszają. Końcowe stężenie glicerolu wynosi 20%. Odessać 140 μl z DW96 i dozować do pierwszej płytki do mikromiareczkowania w pozycji 5.
4. Powtórzyć krok 4.3 dla każdej pozostałej płytki do mikromiareczkowania (pozycje 6 i 7).
5. Uszczelnić każdą płytkę do mikromiareczkowania plastikową taśmą klejącą i przechowywać w temperaturze -80 °C. Pozostałą kulturę należy wyrzucić do DW96, odkażając ją środkiem przeciwdrobnoustrojowym przed usunięciem.

5. Ocena rozwoju kultur

UWAGA: Zazwyczaj nie jest konieczne ocenianie końcowego tempa wzrostu, ponieważ końcowa wartość OD₆₀₀ jest zwykle taka sama dla większości kultur (około 12 w tych warunkach), jednak wszelkie kultury, które nie rosną, powinny być odnotowane.

1. Pobrać 50 μl każdej kultury (z kroku 3.4) i rozlać na płaskodenną, przezroczystą płytkę do mikromiareczkowania zawierającą 150 μl pożywki.
2. Zmierzyć OD₆₀₀, biorąc pod uwagę 4-krotne rozcieńczenie. Jeśli są takie, które nie rosły zbyt dobrze, zanotuj to w końcowej analizie.

6. Zbieranie komórek

UWAGA: Ta procedura trwa około 45 minut.

1. Odwirować 4 płytki DW24 (od kroku 3.4) przy 3 000 x g przez 10 minut, a następnie wyrzucić supernatant do pojemnika na odpady zawierającego środek przeciwdrobnoustrojowy. Postukaj talerzami do góry nogami o chłonny papier, aby usunąć nadmiar podłoża.
2. W międzyczasie należy przygotować 100 ml buforu do lizy (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol pH 8 lub inny preferowany bufor) zawierającego lizozym (stężenie końcowe 0,25 mg/ml).
3. Przygotuj stół roboczy robota:
   1. Umieścić bufor do lizy w korycie o pojemności 300 ml w pozycji 5. Umieść czysty DW96 w pozycji 11. Umieść 4 x DW24 płytki zawierające granulki komórek (z kroku 6.1) w pozycjach 14-17. Umieść końcówki o pojemności 200 μl w pozycji 18.
4. Za pomocą końcówek MCA96 i 200 μl odessać 125 μl buforu do lizy z pozycji 5 i dozować do każdej płytki DW24 (pozycje 14-17). Powtórzyć. UWAGA: 4 końcówki zostaną jednorazowo dozowane do jednego dołka, aby uzyskać końcową objętość 1 ml w każdym dołku płytek DW24.
5. Potrząsaj płytkami w pozycjach 14-17 za pomocą Te-Shake (1,000 obr./min) przez 15 minut, aby ponownie zawiesić granulki.
6. Po ponownym zawieszeniu granulek należy użyć pierwszych 4 kanałów LiHa do zassania 550 μl z próbek od 1 do 4 (pierwsza kolumna pierwszego DW24, w pozycji 14), a następnie za pomocą ostatnich 4 kanałów LiHa zasysać 550 μl próbek od 5 do 8 (druga kolumna pierwszego DW24). Dozować do pierwszego rzędu DW96 w pozycji 11.
7. Powtórz krok 6.6, aby cała zawiesina komórek została przeniesiona do DW96.
8. Po każdym zestawie próbek umyć końcówki LiHa w stacji myjącej.
9. Powtórz kroki od 6.6 do 6.8 dla każdej kolumny w każdej płycie DW24 (pozycje 15-17), korzystając ze schematu przedstawionego na rysunku 5. Uszczelnij folią z tworzywa sztucznego.
10. W celu oczyszczenia tego samego dnia lub krótkotrwałego zamrożenia przechowywać w temperaturze -80 °C przez co najmniej 1 godzinę, w przeciwnym razie przechowywać w temperaturze -20 °C.

Część B: Oczyszczanie i analiza

7. Liza komórek

UWAGA: Ta procedura trwa około 60 minut.

1. Rozmrażać zamrożone zawiesiny komórek (od etapu 6.10) w łaźni wodnej (w temperaturze pokojowej lub 37 °C) przez około 15 minut i ponownie zawiesić w inkubatorze do wytrząsania na dodatkowe 10 minut. Kultury powinny stać się lepkie.
2. Weź 500 μl bulionu DNazy i wymieszaj go z 1 ml bulionu MgSO₄. Ręcznie za pomocą pipety 8-kanałowej lub za pomocą robota LiHa dozować 15 μl do każdej studzienki DW96, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μg/ml DNazy i 20 mM_MgSO4.
3. Ponownie zamknij płytkę plastikową taśmą i potrząsaj przez kolejne 15 minut. W tym momencie kultury powinny być nielepkie. Sprawdź dokładnie (poprzez oględziny), czy wszystkie kultury nie są już lepkie. UWAGA: Ma to kluczowe znaczenie, jeśli niektóre kultury są nadal lepkie (na przykład, jeśli DNaza została przypadkowo zapomniana lub nie została odpowiednio dozowana w niektórych studzienkach), filtr zatka się, generując nierównomierne ciśnienie na próbkach i może dojść do przepełnienia lub całkowitego zatkania płytki filtracyjnej podczas oczyszczania.
4. W przypadku próbek SDS-PAGE lizatu całego komórkowego należy odessać 10 μl lizatu i dozować do 96-dołkowej płytki PCR zawierającej 10 μl 4x buforu próbki SDS-PAGE i 20 μl wody. Denaturację przez 3 minuty w temperaturze 95 °C i zamrażać do czasu analizy (frakcja całkowita). Jeśli dostępny jest system elektroforezy HTP, próbki można na nim analizować, zamiast tego postępować zgodnie z zalecanym przez producenta protokołem przygotowania próbki. Więcej informacji na temat analizy próbek znajduje się w sekcji 10.

8. Oczyszczanie powinowactwa Ni

UWAGA: Do pipetowania wszystkich zawiesin żywicy należy używać niskiej prędkości zasysania, ponieważ zawiesiny są dość gęste. Nadmierne wysuszenie żywicy spowoduje zmniejszenie zdolności wiązania. Do oczyszczania określone stężenia imidazolu mają zastosowanie do żywicy o powinowactwie do niklu. W przypadku stosowania jonów alternatywnych (np. kobaltu) należy odpowiednio dostosować stężenia.

1. A - oczyszczanie powinowactwa do Ni do wykrywania w zakresie 1-100 mg/L (końcowa objętość żywicy = 200 μl)
   UWAGA: Ta procedura oczyszczania trwa około 1,5 godziny, co oznacza, że w ciągu jednego dnia można wykonać do 4 zabiegów.
   1. Przygotuj stół roboczy robota:
      1. Umieścić 300 ml koryt zawierających bufor wiążący (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol pH 8), bufor do przemywania (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazol pH 8) i bufor elucyjny (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol pH 8) odpowiednio w pozycjach od 6 do 8.
      2. Pozostawić puste koryto o pojemności 300 ml w pozycji 5 na zawiesinę żywicy. Na pozycjach 9 i 10 umieść uchwyty na talerze. W pozycji 10 umieść DW96 z blokiem SPE i płytką filtrująco-odbiorczą (20 μm) na górze.
      3. Umieść DW96 zawierający lizat (od kroku 7.3) w pozycji 14. Na pozycjach 18 i 19 umieść odpowiednio końcówki o szerokim otworze 200 μl i końcówki o średnicy 200 μl. Umieść dwie zapasowe płytki DW96 do mycia i elucji w hotelu. UWAGA: Można je również umieścić w alternatywnym miejscu na stole roboczym, jeśli hotel jest niedostępny.
   2. Przygotować 105 ml zbilansowanej 33% zawiesiny żywicy (35 ml żywicy + 70 ml buforu wiążącego). Dodać zawiesinę żywicy do koryta w pozycji 5 bezpośrednio przed rozpoczęciem zabiegu.
   3. Używając MCA96 i końcówek o szerokim otworze 200 μl (pozycja 18), dokładnie wymieszaj zawiesinę żywicy w pozycji 5 przed zasysaniem i dozowaniem 200 μl zawiesiny żywicy do DW96 zawierającej lizat w pozycji 14. Powtórz dwukrotnie, aby do lizatu dodano 600 μl zawiesiny żywicy, mieszając zawiesinę żywicy przed każdym zasysaniem.
   4. Wykonaj 10-minutowy etap mieszania za pomocą MCA96 w pozycji 14, aby umożliwić wiązanie i zapobiec granulowaniu żywicy.
   5. Zassać z pozycji 14 i dozować 800 μl (w partiach po 200 μl) na płytkę filtracyjną w pozycji 9, mieszając przed każdym zasysaniem, w przeciwnym razie żywica zostanie zatrzymana na dnie DW96.
   6. Włącz próżnię w pozycji 10 na około 90 sekund, aby przefiltrować lizat przez płytkę do DW96 w celu zebrania przepływu, uważając, aby nie wysuszyć żywicy. Wyłącz odkurzacz.
   7. Powtórz kroki 8.1.5 i 8.1.6, aby cała żywica znalazła się w płycie filtracyjnej.
   8. Za pomocą ramienia RoMa przesunąć blok SPE przytrzymujący płytę filtracyjną z pozycji 10 do pozycji 9 tak, aby następny etap mycia trafił bezpośrednio do odpadu i przenieść DW96 zawierający przepływ w pozycji 10 w inne miejsce (np. do nośnika hotelowego) do końca procedury.
   9. Za pomocą nowego zestawu końcówek o pojemności 200 μl (w pozycji 19) przemyć żywicę (w pozycji 9) łącznie 800 μl buforu wiążącego (z pozycji 6) i zastosować próżnię w pozycji 9, aż bufor przejdzie przez nią. Powtórz jeszcze raz.
   10. Użyj ramienia RoMa, aby umieścić świeży DW96 w pozycji 10, aby zebrać 50 mM płukania imidazolem i przesunąć blok SPE i płytkę filtracyjną z powrotem na górę (pozycja 10).
   11. Dodać 800 μl buforu do płukania z pozycji 7 do pozycji 10, włączyć próżnię, aż bufor przejdzie przez nią. Wyłącz odkurzacz.
   12. Za pomocą ROMA wyjmij blok SPE i płytę filtracyjną do pozycji 9, a DW96 zawierającą próbkę mycia do hotelu i odłóż je na bok do końca procedury.
   13. Przemyć żywicę kolejnym 800 μl buforu do przemywania (od pozycji 7 do pozycji 9), zastosować próżnię, aż bufor przejdzie przez nią. Powtórz jeszcze raz.
   14. Użyj RoMa, aby umieścić świeży DW96 w pozycji 10 i umieść blok SPE i płytkę filtracyjną z powrotem na górze, aby zebrać elucję.
   15. Dodać łącznie 500 μl buforu elucyjnego (z pozycji 8 do pozycji 9) i inkubować in situ przez 3 minuty. Włączyć próżnię, aż cały bufor przejdzie przez nią.
   16. Opcjonalnie: W przypadku białek o wysokiej ekspresji można przeprowadzić drugą elucję do świeżego DW96, jak w krokach 8.1.14 i 8.1.15.
   17. Pobrać próbki przepływu, przemywania i elucji do elektroforezy SDS-PAGE lub HTP.
       1. W przypadku próbek przepływowych SDS-PAGE należy dozować 10 μl do 96-dołkowej płytki PCR zawierającej 10 μl buforu do próbek 4X SDS-PAGE i 20 μl wody. W przypadku próbek SDS-PAGE z płukania i elucji/s należy dozować 30 μl do płytek PCR zawierających 10 μl 4x buforu próbek SDS-PAGE. Denaturację przez 3 minuty w temperaturze 95 °C i zamrażać do czasu analizy.
       2. W przypadku próbek elektroforezy HTP postępuj zgodnie z instrukcjami producenta. Więcej informacji na temat analizy próbek znajduje się w sekcji 10.
2. B - Oczyszczanie powinowactwa do Ni do wykrywania w zakresie 0,1-25 mg/L (końcowa objętość żywicy = 50 μl)
   UWAGA: Ta procedura oczyszczania trwa około 30 minut, co oznacza, że w ciągu jednego dnia można wykonać do 12 zabiegów.
   1. Przygotuj stół roboczy robota:
      1. Umieścić 300 ml koryt zawierających bufor wiążący (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol pH 8), bufor do przemywania (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazol pH 8) i bufor elucyjny (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol pH 8) odpowiednio w pozycjach od 6 do 8.
      2. Pozostawić puste koryto o pojemności 300 ml w pozycji 5 na zawiesinę żywicy. Na pozycjach 9 i 10 umieść uchwyty na talerze. W pozycji 10 umieść DW96 z blokiem SPE i płytką filtrująco-odbiorczą (20 μm) na górze.
      3. Umieść DW96 zawierający lizat (od kroku 7.3) w pozycji 14. Na pozycji 18 i 19 umieść odpowiednio końcówki o szerokim otworze 200 μl i końcówki o pojemności 200 μl. Umieść zapasową 96-dołkową płytkę do mikromiareczkowania do elucji w hotelu. UWAGA: Można go również umieścić w alternatywnym miejscu na stole roboczym, jeśli hotel jest niedostępny.
   2. Przygotować 50 ml zbilansowanej 25% zawiesiny żywicy (12,5 ml żywicy + 37,5 ml buforu wiążącego). Dodać zawiesinę żywicy do koryta w pozycji 5 bezpośrednio przed rozpoczęciem zabiegu.
   3. Używając MCA96 i końcówek o szerokim otworze 200 μl (pozycja 18), dokładnie wymieszaj zawiesinę żywicy w pozycji 5 przed zasysaniem i dozowaniem 200 μl zawiesiny żywicy do DW96 zawierającej lizat w pozycji 14.
   4. Inkubować w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem za pomocą Te-Shake przy 1400 obr./min przez 10 minut, aby umożliwić wiązanie.
   5. Zassać z pozycji 14 i dozować pełne 1 200 μl (w partiach 200 μl) za pomocą końcówek o szerokim otworze (pozycja 18) na płytkę filtracyjną w pozycji 10. Wymieszaj przed każdym zasysaniem, w przeciwnym razie żywica zostanie zatrzymana na dnie DW96.
   6. Włącz próżnię w pozycji 10 na około 30 sekund, aby przefiltrować lizat przez płytkę do DW96 w celu zebrania przepływu, uważając, aby nie wysuszyć żywicy. Wyłącz odkurzacz.
   7. Za pomocą ramienia RoMa przesunąć blok SPE przytrzymujący płytę filtracyjną z pozycji 10 do pozycji 9 tak, aby następny etap mycia trafił bezpośrednio do odpadu i przenieść DW96 zawierający przepływ w pozycji 10 w inne miejsce (np. do nośnika hotelowego) do końca procedury.
   8. Za pomocą końcówek o objętości 200 μl (w pozycji 19) przemyć żywicę (w pozycji 9) łącznie 800 μl buforu wiążącego (z pozycji 6) i zastosować próżnię w pozycji 9, aż bufor przejdzie przez nią. Powtórzyć.
   9. Za pomocą ramienia RoMa umieść świeży DW96 w pozycji 10, aby zebrać 50 mM płynu do płukania imidazolem i przesuń blok SPE i płytkę filtracyjną z powrotem na górę (pozycja 10).
   10. Dodać 150 μl buforu do płukania z pozycji 7 do pozycji 10, włączyć próżnię, aż bufor przejdzie przez nią. Wyłącz odkurzacz.
   11. Za pomocą ROMA wyjmij blok SPE i płytę filtracyjną do pozycji 9, a DW96 zawierającą próbkę mycia do hotelu i odłóż ją na bok do końca procedury.
   12. Przemyć żywicę kolejnym 800 μl buforu do przemywania (od pozycji 7 do pozycji 9), zastosować próżnię, aż bufor przejdzie przez nią. Powtórzyć.
   13. Użyj RoMa, aby umieścić mikropłytkę w pozycji 9 i umieść blok SPE i płytkę filtracyjną z powrotem na górze, aby zebrać elucję.
   14. Dodać 190 μl buforu elucyjnego (z pozycji 8 do pozycji 9) i inkubować in situ przez 3 minuty. Stosować próżnię, aż cały bufor przejdzie przez nią.
   15. Pobrać próbki przepływu, przemywania i elucji do elektroforezy SDS-PAGE lub HTP.
       1. W przypadku próbek przepływowych SDS-PAGE należy dozować 10 μl do 96-dołkowej płytki PCR zawierającej 10 μl buforu do próbek 4X SDS-PAGE i 20 μl wody. W przypadku próbek SDS-PAGE z płukania i elucji/s należy dozować 30 μl do płytek PCR zawierających 10 μl 4x buforu próbek SDS-PAGE. Denaturację przez 3 minuty w temperaturze 95 °C i zamrażać do czasu analizy.
       2. W przypadku próbek elektroforezy HTP postępuj zgodnie z instrukcjami producenta. Więcej informacji na temat analizy próbek znajduje się w sekcji 10.

9. Znacznik Dekolt (Opcjonalnie)

1. Dodać proteazę TEV (2 mg/ml) do eluowanego białka (z kroku 8.1.15 (i 8.1.16) lub kroku 8.2.14) w stosunku 1/10 (v/v).
2. Inkubować w temperaturze pokojowej (lub 4 °C w przypadku białek wrażliwych na temperaturę) O/N, delikatnie wstrząsając.
3. Pod koniec rozszczepienia dozować 30 μl do płytki PCR zawierającej 10 μl 4x buforu próbki SDS-PAGE lub postępować zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi próbek do elektroforezy HTP.
4. Przefiltrować pozostałą mieszaninę rozszczepienia (z kroku 9.2) przez 96-dołkową płytkę filtracyjną 0,22 μm i zebrać rozpuszczalny przepływ w DW96, stosując próżnię. Można to zrobić w jednym z miejsc podciśnienia (np. w pozycji 10) na robocie do obsługi cieczy, tak jak w przypadku etapów elucji w sekcjach 8.1 i 8.2. Powoduje to usunięcie wszelkich białek, które wytrąciły się podczas rozszczepienia.
5. Po filtracji dozować 30 μl do płytki PCR zawierającej 10 μl 4x buforu próbki SDS-PAGE lub przygotować jako próbki do elektroforezy HTP. Pozwala to na porównanie białka przed rozszczepieniem, mieszaniny po rozszczepieniu i rozpuszczalnego białka pozostałego po rozszczepieniu oraz daje dobre wskazówki co do oczekiwanych wyników w kolejnych eksperymentach na dużą skalę. Więcej informacji na temat analizy próbek znajduje się w sekcji 10.

10. Analiza wyników

1. Zidentyfikuj konstrukty wyrażające rozpuszczalne białko, analizując próbki oczyszczające za pomocą SDS-PAGE, dot blot lub systemu elektroforezy HTP, takiego jak Caliper LabChip.
   1. Najpierw przeanalizuj próbki elucji, aby zidentyfikować konstrukty wytwarzające rozpuszczalne białko. W większości przypadków analizowane są tylko próbki elucji, jeśli zidentyfikowane zostaną rozpuszczalne konstrukty, aby zminimalizować czas poświęcony na analizę.
   2. Jeśli białko nie znajduje się w elucji, uruchom próbki do płukania i przepływu, aby sprawdzić, czy uległo ekspresji i nie wiąże się prawidłowo z żywicą.
   3. W przypadku konstruktów, w których nie można wykryć rozpuszczalnego białka, uruchom lizat całej komórki, aby sprawdzić, czy białko uległo ekspresji.
      UWAGA: Jednym z ograniczeń jest to, że jeśli białko będące przedmiotem zainteresowania nie jest obecne powyżej poziomów ekspresji tła, może nie być możliwe zobaczenie białka i może to prowadzić do fałszywie ujemnego wyniku. Należy zauważyć, że zawsze możliwe jest, aby białka przywierały i wytrącały się na żywicy powinowactwa, co może prowadzić do fałszywie ujemnego lub niedoszacowania plonu przy użyciu zalecanego protokołu (rzadkie zdarzenie w tej pracy). W przypadku, gdy białko wytrąca się podczas elucji (biała osadka jest widoczna kilka minut/godzin po elucji), zaleca się zmianę składu buforu (na przykład stężenia soli) i/lub wykonanie różnicowego testu fluorymetrii skaningowej w celu optymalizacji. Niewielka próbka żywicy może być również ponownie zawieszona w buforze próbek SDS-PAGE i gotowana w celu wykrycia, czy białko jest zatrzymywane na żywicy.
   4. Jeśli białko nie uległo ekspresji, ale komórki rosły, zastosuj nową strategię ekspresji lub, jeśli OD₆₀₀ nie było wystarczająco wysokie, odhoduj i ponownie przeanalizuj kulturę.
   5. Jeśli próbki rozszczepienia mają być analizowane, powinny być analizowane w sposób równoległy, tak aby każdy konstrukt mógł być pokazany przed rozszczepieniem i po rozszczepieniu na sąsiednich pasach, aby uprościć analizę.
2. O ile nie stosuje się metody, która daje bezpośrednie określenie ilościowe stężenia elucji, oznaczanie ilościowe należy przeprowadzić dla próbek dodatnich, mierząc absorbancję przy 280 nm (A280).
   1. Zmierzyć A280, biorąc pod uwagę współczynnik ekstynkcji białka i wykorzystując bufor elucyjny jako ślepą próbę, aby zapewnić oszacowanie wydajności białka w celu zidentyfikowania rozpuszczalnych konstruktów o najwyższej ekspresji.
   2. W celu uzyskania najbardziej wiarygodnego porównania plonów rozpuszczalnych zaleca się normalizację plonów przez gęstość kultury (przy użyciu pomiaru OD₆₀₀), który został wykonany w sekcji 5. Jeśli wszystkie kultury osiągnęły w przybliżeniu tę samą gęstość, normalizacja nie jest wymagana.

11. Kontrola jakości

1. Próbki mogą być analizowane bezpośrednio z próbki elucyjnej lub rozszczepialnej za pomocą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC/MS).
2. Alternatywnie, najpierw odsolić (w celu usunięcia imidazolu i wszelkich soli buforowych, które mogą być obecne) za pomocą końcówek do pipet ZipTip lub metod chromatografii cieczowej, a następnie przeanalizować za pomocą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-TOF) lub spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylania (ESI).
3. Można przeprowadzić badania funkcjonalne na małą skalę, aby sprawdzić, czy funkcja białka jest zgodna z oczekiwaniami. Jeśli do działania wymagane są większe ilości, można wykonać hodowlę na dużą skalę i przetestować funkcję na podstawie większej hodowli po potwierdzeniu wielkości i stopnia utlenienia w małej skali.

Reprezentatywne wyniki są pokazane na rysunku 6 dla badania przesiewowego ekspresji 96 białek bogatych w dwusiarczki z rurociągu VENOMICS. Białka są ułożone poprzez zwiększenie liczby wiązań dwusiarczkowych, a następnie zwiększenie liczby reszt. Peptydy ulegały ekspresji w cytoplazmie za pomocą znacznika HIS i partnera fuzji DsbC. Przy stosowaniu zalecanych warunków hodowli zwykle osiąga się OD600 równe 12. Peptydy oczyszczono przy użyciu protokołu 8.2-B z końcową objętością 50 μl żywicy o powinowactwie do niklu, dzięki czemu w tym eksperymencie można było wykryć maksymalnie ~25 mg/L białka fuzyjnego.

Rysunek 6A pokazuje wynik elektroforezy z systemu Caliper LabChip (pokazujący fuzję przed rozszczepieniem) oraz system punktacji oparty na ekstrapolacji do uzyskania w mg/L kultury białka fuzyjnego (na poziomach od 0,1 do 2 mg/L, 2 do 10 mg/L, 10 do 25 mg/L i nie wykryte.) Należy zauważyć, że rozszczepiony znacznik DsbC zwykle działa z prędkością około 32 kDa, a nie 27 kDa, jak oczekiwano. Podobnie, fuzje DsbC również przebiegają o około 5 kDa wyżej niż oczekiwano. W przypadku wielu celów widzimy nie tylko nienaruszoną fuzję (górne pasmo), ale także samego partnera fuzji (dolne pasmo). W przypadku niektórych z tych celów optymalizacja warunków hodowli może poprawić stosunek nienaruszonej fuzji (górne pasmo) w porównaniu z samym DsbC, co pozwala na zwiększenie końcowej wydajności. Punktacja opiera się tylko na poziomie nienaruszonej fuzji. Tylko 16 z 96 białek nie mogło zostać wykrytych na poziomie fuzji. Odpowiada to ogólnemu poziomowi sukcesu wynoszącemu 83%. Spośród 80 białek, które udało się wykryć, 45 z nich wykryto na poziomie większym niż 2 mg/L hodowli (56%). W zależności od celu i fuzji, wydajność białka mieści się zwykle w zakresie 2-100 mg/L hodowli (chociaż w tym przykładzie przy użyciu protokołu 8.2 B można wykryć maksymalnie ~25 mg/L białka fuzyjnego).

Analiza sukcesu według liczby obecnych wiązań dwusiarczkowych (pokazana na rysunku 6B) pokazuje rozsądny sukces dla wszystkich testowanych wiązań dwusiarczkowych (od 1 do 7), przy czym najniższy poziom sukcesu wynosi 66% dla celów zawierających 6 wiązań dwusiarczkowych. Analiza rozkładu sukcesu ekspresji w oparciu o punkt izoelektryczny i liczbę reszt (pokazanych na rysunku 6C) nie wykazuje szczególnego odchylenia dla tej techniki, przy czym zarówno pomyślnie wyrażone cele, jak i cele, które nie zostały wykryte, są rozproszone na całym wykresie.

Rysunek 6D pokazuje przykład wyników spektrometrii mas uzyskanych metodą spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylania (ESI-MS) dla pojedynczego celu, przed i po redukcji próbki za pomocą DTT. Normalnie taka wyczerpująca analiza spektrometrii mas nie musiałaby być wykonywana (zredukowana próbka nie musiałaby być analizowana), jednak w celu dokładnej demonstracji pokazaliśmy oba wyniki. Pokazany cel to białko jadu bogate w dwusiarczek o masie 5,7 kDa z 4 wiązaniami dwusiarczkowymi. Widmo po lewej stronie pokazuje wyniki dla białka przed redukcją za pomocą DTT, tak jak to było po rozszczepieniu i odsoleniu bez dalszej interwencji. Widmo po prawej stronie pokazuje białko po redukcji za pomocą DTT, a następnie odsoleniu w celu usunięcia nadmiaru DTT. Jony odpowiadające masom doświadczalnym są oznaczone strzałkami na widmie, a oznaczenie każdego jonu jest pokazane na zielono. Eksperymentalne masy macierzyste obliczone dla tych jonów (dla białka przed redukcją (-DTT) i po redukcji (+DTT)) przedstawiono w tabeli. Masy (5709,6 Da dla próbki przed redukcją i 5717,6 Da dla próbki zredukowanej) wykazują różnicę mas wynoszącą 8 Da. Różnica mas 2 Da odpowiada obecności 1 utlenionego wiązania dwusiarczkowego, dlatego różnica mas 8 Da wskazuje na obecność 4 wiązań dwusiarczkowych (zgodnie z oczekiwaniami) w próbce niezredukowanej.

Rysunek 1. Schematyczne przedstawienie protokołu przesiewowego wyrażeń o wysokiej przepustowości. Korzystając z tego protokołu, jedna osoba może przetestować od 96 do 384 warunków w ciągu jednego tygodnia przy użyciu metod ręcznych lub do 1 152 warunków za pomocą opisanego sprzętu półautomatycznego. Plazmidy ekspresyjne są konstruowane przy użyciu technologii klonowania rekombinacyjnego, dzięki czemu wiele celów może być podklonowanych w tym samym czasie. Po zidentyfikowaniu rozpuszczalnych warunków ekspresji i przeprowadzeniu rozszczepienia, w razie potrzeby, białko może przejść do kontroli jakości w celu sprawdzenia utleniania i czystości, mikrotestów i/lub produkcji na dużą skalę.

Rysunek 2. Schemat uniwersalnego klonowania rekombinacyjnego i projektowania konstrukcji. Z docelowych klonów wejściowych wiele wektorów ekspresji można sklonować w jednym eksperymencie w sposób o wysokiej przepustowości (do 6 x 96 klonów wejściowych w ciągu tygodnia). Wyrażone białko koduje znacznik HIS do oczyszczania powinowactwa do niklu. Partner fuzyjny DsbC (brak peryplazmatycznej sekwencji sygnałowej dla ekspresji cytoplazmatycznej) jest stosowany w celu zwiększenia rozpuszczalności i/lub wspomagania fałdowania i prawidłowego utleniania białka docelowego. Należy pamiętać, że docelowa sekwencja kodująca powinna zawierać N-końcowe miejsce proteazy TEV (ENLYFQ), JEŚLI POŻĄDANE JEST ROZSZCZEPIENIE ZNACZNIKA. Wstawka w lewym górnym rogu pokazuje produkcję klonów wejściowych przy użyciu wektora dawcy i sekwencji docelowych, które można uzyskać za pomocą PCR lub syntezy genów. Klony wejściowe można również uzyskać z komercyjnych kolekcji klonów wejściowych. Dostępnych jest wiele systemów klonowania rekombinacyjnego, jednak korzystamy z systemu Gateway, jak pokazano na schemacie.

Rysunek 3. Rurociąg przesiewowy o wysokiej przepustowości dla wielu celów bogatych w dwusiarczek. Cele są początkowo wyrażane jako fuzje HIS-DsbC w cytoplazmie BL21 (DE3) pLysS E. coli w temperaturze 37/17 °C przy użyciu pożywki autoindukcyjnej (ZYP-5052). Oczyszczanie przeprowadza się na żywicy niklowej, a następnie wykrywa się rozpuszczalne konstrukty za pomocą elektroforezy HTP (lub za pomocą dot blot / SDS-PAGE). Jeśli pierwsza runda badania przesiewowego ekspresji nie powiedzie się, próbuje się alternatywnych warunków hodowli. Jeśli konstrukty wytwarzają rozpuszczalne białka z wystarczająco wysoką wydajnością, można przeprowadzić mikrotesty i kontrolę jakości, a w razie potrzeby można kontynuować produkcję na dużą skalę. W przypadku celów, w których rozpuszczalne plony nie są wystarczająco wysokie, badanie przesiewowe ekspresji można kontynuować przy użyciu alternatywnych szczepów i temperatur, a następnie innych partnerów fuzyjnych i ekspresji peryplazmatycznej. Kroki opcjonalne są oznaczone przerywanymi polami.

Rysunek 4. Konfiguracja stołu roboczego robota dla platformy HTP. Pokazano układ stołu roboczego naszego robota do obsługi cieczy, chociaż można również zastosować alternatywne stoły robocze, pod warunkiem, że dostępne są równoważne miejsca. Zestaw składa się ze stacji mycia (WS) dla (8-kanałowej głowicy do obsługi cieczy (LiHa)), dwóch nośników mikropłytek z 4 pozycjami każdy (MP4, pozycje 1-4 i 5-8), stacji próżniowej z 2 pozycjami (Te-VacS, pozycje 9 i 10), nośnika mikropłytek z 3 pozycjami (MP3, pozycje 11-13), dwóch wytrząsarek do płytek po 2 pozycje każdy (Te-Shakers, pozycje 14-15 i 16-17) oraz nośnik na jednorazowe końcówki z 3 pozycjami (DiTi, pozycje 18-20). Ponadto istnieją dwa nośniki hotelowe dla płytek głębinowych i jeden dla mikropłytek (nie pokazane). Osprzęt zainstalowany w robocie do obsługi cieczy to 96-kanałowe ramię (MCA96) do użytku z jednorazowymi końcówkami, 8-kanałowa głowica do obsługi cieczy (LiHa) ze stałymi końcówkami oraz manipulator robotyczny (RoMa), który przesuwa płyty/sprzęt na stole roboczym. Numeracja pozycji jest wymieniona w całym protokole.

Rysunek 5. Schemat przenoszenia z pojedynczej płytki 96-dołkowej na cztery płytki 24-dołkowe.

Rycina 6. Przedstawiono reprezentatywne wyniki dla badania przesiewowego ekspresji 96 białek jadu bogatych w dwusiarczki. Białka wyrażono jako fuzje HIS-DsbC w cytoplazmie i oczyszczono przy użyciu 50 μl żywicy niklowej (Protokół 8.2-B). A) Wyniki badań przesiewowych ekspresji, pokazujące wirtualny żel i punktację dla wydajności ekspresji. Kontrast w wirtualnym żelu został dostosowany między pasami, aby skompensować bardzo słabe lub intensywne pasma. Należy zauważyć, że dla niektórych celów można zaobserwować dwa prążki, z których górne odpowiada nienaruszonemu białku fuzyjnemu, a dolne pasmo odpowiada samemu znacznikowi fuzyjnemu. B) Proporcja białek wyrażanych na każdym poziomie ekspresji w porównaniu z liczbą wiązań dwusiarczkowych w białku. Rzeczywista liczba białek w każdej grupie jest nałożona na wykres. C) Rozkład poziomów ekspresji w oparciu o punkt izoelektryczny (pI) i liczbę reszt. D) Przykład wyników spektrometrii mas dla białka jadu bogatego w dwusiarczek o masie 5,7 kDa z 4 wiązaniami dwusiarczkowymi. Widmo po lewej stronie pokazuje białko przed redukcją za pomocą DTT, a widmo po prawej stronie pokazuje białko zredukowane za pomocą DTT, a następnie odsolone. Jony odpowiadające masom doświadczalnym są oznaczone strzałkami, a ich przyporządkowanie jest pokazane na zielono. Masy doświadczalne białka przed redukcją i po redukcji są przedstawione w tabeli i wykazują różnicę mas wynoszącą 8 Da, odpowiadającą obecności utlenionego białka przed dodaniem czynnika redukującego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1. Receptura na składniki pożywki ZYP-5052.

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.