Artykuł metodologiczny

Wizualizacja dynamiki endosomów w żywych zakończeniach nerwowych za pomocą czterowymiarowego obrazowania fluorescencyjnego

DOI:

10.3791/51477

⸱

16 kwietnia 2014

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Physiology, Washington University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czterowymiarowe (4D) obrazowanie jest wykorzystywane do badania zachowania i interakcji między dwoma typami endosomów w zakończonych nerwach żywych kręgowców. Ruch tych małych struktur jest scharakteryzowany w trzech wymiarach, co pozwala na potwierdzenie zdarzeń takich jak fuzja endosomów i egzocytoza.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czterowymiarowe (4D) obrazowanie światłem zostało użyte do badania zachowania małych struktur w obrębie zakończeń nerwów ruchowych cienkiego mięśnia poprzecznego brzucha węża do pończoch. Surowe dane składają się z poklatkowych sekwencji stosów 3D Z. Każdy stos zawiera od 4 do 20 obrazów uzyskanych za pomocą optyki epifluorescencyjnej w płaszczyznach ogniskowych oddalonych od siebie o 400-1500 nm. Etapy pozyskiwania stosów obrazów, takie jak regulacja ostrości, przełączanie długości fal wzbudzenia i obsługa aparatu cyfrowego, są w jak największym stopniu zautomatyzowane, aby zmaksymalizować szybkość obrazu i zminimalizować uszkodzenia tkanek spowodowane ekspozycją na światło. Po akwizycji zestaw stosów obrazów jest dekonwolucjonowany w celu poprawy rozdzielczości przestrzennej, konwertowany do pożądanego formatu 3D i wykorzystywany do stworzenia "filmu" 4D, który nadaje się do różnych analiz komputerowych, w zależności od poszukiwanych danych eksperymentalnych. Jednym z zastosowań jest badanie dynamicznego zachowania dwóch klas endosomów znajdujących się w zakończeniach nerwowych - makroendosomów (ME) i endosomów kwaśnych (AE) - których rozmiary (200-800 nm dla obu typów) są na granicy dyfrakcji lub w jej pobliżu. Dostęp do informacji 3D w każdym punkcie czasowym ma kilka zalet w porównaniu z konwencjonalnym obrazowaniem poklatkowym. W szczególności wielkość i prędkość ruchu struktur można określić ilościowo w czasie bez utraty ostrości. Przykłady danych z obrazowania 4D pokazują, że ME zbliżają się do błony plazmatycznej i znikają, co sugeruje, że są egzocytozowane, a nie po prostu poruszają się pionowo od jednej płaszczyzny ostrości. Ujawniono również przypuszczalną fuzję ME i AE poprzez wizualizację nakładania się na siebie dwóch struktur zawierających barwnik, jak to widać w każdych trzech ortogonalnych rzutach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie poklatkowe żywej tkanki zapewnia wizualny dostęp do dynamicznych relacji struktura-funkcja, które nie mogą być docenione w stałych lub żywych preparatach zobrazowanych w jednym punkcie czasu. Często jednak kompromisem w dostępie do informacji czasowych jest zmniejszenie rozdzielczości optycznej. Obiektywy zanurzeniowe z olejkiem o dużej aperturze numerycznej są niepraktyczne w żywej tkance ze względu na ich wąski zakres ostrości, pozostawiając jako jedyną alternatywę obiektywy zanurzone w wodzie lub suche. Co więcej, zwiększona rozdzielczość zapewniana przez optykę konfokalną nie może być wykorzystana w niektórych żywych preparatach ze względu na fototoksyczność wynikającą ze stosunkowo wysokich wymaganych poziomów oświetlenia1,2. Wreszcie, chociaż dostępnych jest kilka technik optycznych w czasie rzeczywistym lub poklatkowych, które oferują zwiększoną rozdzielczość, ich zastosowanie jest ograniczone do preparatów, w których interesujące struktury można umieścić w odległości kilkuset nanometrów od obiektywu1. Opisana metoda wykorzystuje stosunkowo tani sprzęt, jest wszechstronna, a jednocześnie oferuje lepszą rozdzielczość w porównaniu z częściej stosowanymi technikami poklatkowymi. Przeznaczony jest do stosowania w indywidualnych laboratoriach, a także w zakładach obrazowania.

Metoda wykorzystuje konwencjonalną mikroskopię epifluorescencyjną, połączoną z czułą kamerą cyfrową i sprzętem zaprojektowanym do szybkiego pozyskiwania zestawów obrazów w nieco różnych płaszczyznach ogniskowych (z-stacks). Każdy stos z jest cyfrowo zdekonwolucjonowany w celu zwiększenia rozdzielczości. Jedną z cech obrazowania poklatkowego 3D (4D) jest precyzyjne śledzenie poruszających się organelli lub innych struktur. Po prawidłowym ustawieniu obrazowane struktury nie tracą ostrości, a ruch we wszystkich trzech kierunkach można obserwować i określać ilościowo. W związku z tym niemożliwe jest, aby poplamiona struktura zniknęła w jednej lub kilku klatkach poklatkowych, po prostu dryfując powyżej lub poniżej wąskiej płaszczyzny ogniskowej. Metoda ta służy również jako czułe narzędzie do oceny interakcji i możliwego łączenia małych struktur. Konwencjonalne obrazy epifluorescencyjne lub konfokalne struktur w pobliżu granicy dyfrakcji (kilkaset nm) nie potwierdzają fuzji, nawet jeśli połączone obrazy wykazują nakładanie się ich odpowiednich etykiet3. Sugeruje się fuzję, ale możliwe jest, że obiekty są oddzielone poziomo lub pionowo odległością poniżej granicy dyfrakcji. Z kolei obrazowanie trój- lub czterowymiarowe pozwala na oglądanie obiektów w każdym z trzech kierunków ortogonalnych. Pojawienie się fuzji we wszystkich trzech widokach zwiększa poziom pewności. A w niektórych żywych preparatach ukierunkowany lub Brownowski ruch przypuszczalnie zrośniętych obiektów dostarcza dalszych dowodów, gdy obie etykiety poruszają się razem w czasie. Oczywiście, gdy znajduje się w pobliżu granicy dyfrakcyjnej, poziom pewności w odróżnianiu struktur od tła lub wykazywaniu, że zawierają one dwa barwniki (fuzja), nie jest absolutny. W stosownych przypadkach bardziej odpowiednie są specjalistyczne techniki, takie jak transfer energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET)4.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Barwienie preparatu barwnikami Supravital

  1. Aby zapoznać się z protokołem sekcji węża do pończoch, patrz Stewart i wsp.5 oraz Teng i wsp.6 Tkanka gadzia pozostaje fizjologiczna przez dłuższy czas i z mniejszym zanieczyszczeniem bakteryjnym, gdy jest przechowywana w niskich temperaturach (patrz poniżej). Tkanka ssaków jest zwykle utrzymywana w temperaturze pokojowej lub wyższej.
  2. W celu barwienia lizosomalnym barwnikiem witalnym rozpuść barwnik w zimnym roztworze Ringera w stosunku 1:5 000 (0,2 μM). Inkubować w temperaturze 4 °C przez 15 minut. Umyj kilka razy zimnymi dzwonkami. Obraz tak szybko, jak to możliwe.
  3. W przypadku barwienia FM1-43 przy użyciu stymulacji KCl należy rozcieńczyć barwnik w Ringerach o wysokiej zawartości KCl 1:500 (7 μM). Inkubować w temperaturze 4 °C maksymalnie 30-60 sekund. Umyj szybko trzy razy zimnymi Ringerami, ~1 min/płukanie. Obraz tak szybko, jak to możliwe.
  4. W przypadku barwienia FM1-43 przy użyciu stymulacji hipertonicznej (sacharozy) należy rozcieńczyć barwnik w 0,5 M sacharozy Ringera, jak powyżej. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 2-5 minut. Umyć jak w kroku 1.3 powyżej zimnymi dzwonkami. Obraz tak szybko, jak to możliwe.
  5. W przypadku barwienia FM1-43 za pomocą stymulacji elektrycznej, patrz Teng i wsp.6 Krótko mówiąc, preparat umieszcza się w naczyniu zawierającym fizjologiczny roztwór soli fizjologicznej i barwnik. Nerw jest stymulowany zaprogramowanym ciągiem impulsów prostokątnych o długości 200 μs (~7 V, 30 Hz, 18 μs). Umyć jak w kroku 1.3 powyżej zimnymi dzwonkami. Obraz tak szybko, jak to możliwe.

2. Konfiguracja przygotowania do obrazowania

  1. Ustaw preparat tak, aby interesujące nas struktury znajdowały się jak najbliżej obiektywu mikroskopu.
  2. Jeśli używany jest mikroskop odwrócony, należy użyć komory, której dno zawiera cienkie okrągłe szkiełko nakrywkowe. Zazwyczaj komora obrazowania powinna mieć cienkie dno ze stali nierdzewnej ze szklaną szkiełkiem nakrywkowym o średnicy 25 mm o grubości #1 pośrodku. W przypadku użycia mikroskopu pionowego dolne szkiełko nakrywkowe nie jest wymagane, ale jest przydatne, aby umożliwić obrazowanie w świetle przechodzącym (np. kontrast interferencyjny różnicowy, DIC) w celu zorientowania próbki i zlokalizowania interesujących obiektów.
  3. Wybierz odpowiedni obiektyw, aby uzyskać najwyższą możliwą rozdzielczość 3D. Istnieją kompromisy między przysłoną numeryczną (nie dotyczy), odległością roboczą, powiększeniem i rodzajem obiektywu (suchy, zanurzony w wodzie i oleju). W przypadku cienkich preparatów, takich jak kultury tkankowe, najlepsze są obiektywy olejowe. Za pomocą mikroskopu pionowego nałóż szkiełko nakrywkowe na kąpiel wodną i użyj olejku immersyjnego między górną częścią szkiełka nakrywkowego a obiektywem.
  4. Jeśli używane jest oprogramowanie do dekonwolucji, dostawca może zapewnić z góry określone funkcje rozrzutu punktowego (PSF) dla określonych celów. W przypadku braku takich informacji lub w przypadku wybrania obiektywu bez podparcia, należy określić poliestrowe włókna odcinkowe poprzez obrazowanie mikrokropek fluorescencyjnych lub podobnych obiektów o ograniczonej dyfrakcji7,8.

3. Ustal żądaną głębię ostrości i liczbę żądanych obrazów na klatkę poklatkową

  1. Wybierz całkowitą głębię ostrości, tak aby poruszające się lub oddziałujące ze sobą struktury zainteresowania nie znikały ani nie traciły ostrości podczas poruszania się w kierunku z. Pole z powinno nieznacznie przekraczać pionowy wymiar obrazowanej komórki lub procesu komórkowego. W przypadku końcówek silnikowych kręgowców typowo przyjmuje się 15-20 μm.
  2. Oblicz krok osi Z wymagany dla każdego przyrostu ostrości. Rozdzielczość wzdłuż osi z różni się w zależności od właściwości obiektywu; Jest to około jednej czwartej rozdzielczości płaszczyzny X-Y. Jeśli używane jest oprogramowanie do obrazowania konfokalnego lub dekonwolucji, rozdzielczość osi z ulega poprawie. Poprawiono rozdzielczość końcową poprzez celowe nadpróbkowanie w kierunku z 5, ale zobacz także krok 3.3 poniżej. Typowy odstęp między krokami mieści się w zakresie 400-1 500 nm dla obiektywów 40-100X. Światło powinno być wyłączone między każdym obrazem z krokiem z.
  3. Wybierz liczbę obrazów na stos z, czyli żądaną głębię ostrości podzieloną przez interwał kroku. Czas na wykonanie typowego z-stacka to 1-10 sekund. Szybko poruszające się obiekty (100 nm/s) mogą wydawać się rozmyte w stosie obrazów 3D, ponieważ każda płaszczyzna obrazu odpowiada nieco innemu punktowi czasowemu. Ponadto, każde dodatkowe zdjęcie przyczynia się do fotowybielania i możliwej fototoksyczności (patrz Dyskusja). Jeśli którakolwiek z tych sytuacji ma zastosowanie, wybierz większy krok z, aby zebrać mniej obrazów na stos. Kompensacja nastąpiła później za pomocą oprogramowania do interpolacji obrazu (krok 6.3 poniżej).

4. Wybierz liczbę klatek na sekundę poklatkową

Wybierz poprzez eksperymentowanie szybkość, która jest wystarczająca do płynnego rozwiązywania zmian w czasie, takich jak ruch, interakcje lub zdarzenia fuzji9. Niedostateczne próbkowanie może powodować artefakty ruchu (błędy próbkowania), podczas gdy nadpróbkowanie niepotrzebnie zwiększa ekspozycję na światło. Zebrać albo pojedynczą długą sekwencję, albo kilka powtarzających się sekwencji z tego samego preparatu, z których każda ma stosunkowo mały całkowity odstęp czasu (np. 10 punktów czasowych x 30 sekund przerwy = 5 minut). Jeśli to możliwe, view preparat z ciągłym oświetleniem epifluorescencyjnym, aby z grubsza oszacować prędkości ruchu, w tym dryf całego preparatu, jeśli jest obecny.

5. Wykonaj wszystkie obrazowania na żywo dla konkretnego przygotowania

Reptiliańskie preparaty zazwyczaj pozostają mocne przez ~1-2 godziny, dłużej, jeśli są schłodzone.

6. Analizuj dane zgodnie z pożądanym zastosowaniem

  1. Zachowaj wszystkie nieprzetworzone pliki danych. Podczas gdy cyfrowa pamięć masowa zwykle nie stanowi problemu, czas przetwarzania jest znaczący nawet w przypadku szybkich komputerów osobistych lub stacji roboczych. Z tego powodu przytnij obrazy do obszaru zainteresowania [ROI]. Upewnij się, że cały obszar zainteresowania znajduje się w przyciętym oknie przez cały przebieg czasu.
  2. Dekonwoluuj stosy obrazów za pomocą odpowiedniego oprogramowania i odpowiedniej funkcji rozrzutu punktowego. Upewnij się, że rozdzielczość została poprawiona i że algorytm dekonwolucji nie wygenerował żadnego artefaktu. Rysunek 3 przedstawia przykładowe obrazy.
  3. Użyj algorytmu interpolacji, aby rozszerzyć rozdzielczość pozorną osi z. Sugeruje się 6-krotne rozszerzenie z rzeczywistej separacji płaszczyzny obrazu 1,5 μm do pozornej separacji 0,25 μm. Alternatywnie można użyć kombinacji nadpróbkowania (krok 3.2) i interpolacji.
  4. W razie potrzeby wykonaj regulacje kontrastu, jasności, filtrowania szumów, fotowybielania i innych typowych korekt przetwarzania obrazu. Standardy manipulacji obrazami nakazują, aby w przypadku większości prac naukowych odpowiednie było stosowanie tych samych poprawek do wszystkich obrazów, zarówno w stosie, jak i w różnych punktach czasowych. Konsekwencje konkretnej korekty powinny być oceniane spośród wszystkich obrazów 9.
  5. Wybierz określony tryb wyświetlania dla eksportu danych. Najprostszym sposobem wyświetlania jest wideo stereo przy użyciu czerwono-zielonych lub czerwono-niebieskich anaglifów (przykłady na rysunku 3), par stereo lub naprzemiennych oprawek lewego/prawego oka z okularami migawkowymi. Anaglify są ograniczone do jednokolorowych. W razie potrzeby zwiększ pozorną głębię obrazu, aby poprawić rozdzielczość wizualną osi z.
  6. Eksperymentuj z różnymi technikami filtrowania i ulepszania obrazu. Na przykład filtrowanie Laplace'a jest przydatne do zwiększania kontrastu małych struktur nad tłem. Jasność pikseli w środku uruchomionego okna jest zwiększana, podczas gdy jasność otaczających obszarów jest zmniejszana. Należy pamiętać, że niektóre metody filtrowania nie działają dobrze w połączeniu.
  7. Zastosować korektę dryftu, jeśli w czasie występuje znaczny ruch preparatu. Taki ruch jest powszechny w żywych mięśniach, nawet z dodanymi lekami w celu tłumienia potencjałów czynnościowych i potencjałów synaptycznych. Algorytm rejestracji pikseli (np. IMARIS, Adobe AfterEffects, wtyczka TurboReg do ImageJ) wyrównuje obrazy poklatkowe i może zredukować, ale zwykle nie całkowicie wyeliminować taki ruch.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pokazane dane pochodzą z końcówek nerwowo-mięśniowych węża (zobacz widoki w małym i dużym powiększeniu na rysunku 3; wychwyt barwnika endocytarnego (FM1-43) tworzy mgłę, która wypełnia każdy bulton), a w szczególności makroendosomy (MEs) i endosomy kwasowe (AE) w tych końcach5. ME są tworzone przez endocytozę masową podczas aktywności neuronalnej10, a ich liczba spada wykładniczo z czasem po ustaniu aktywności6. Wykorzystanie obrazowania na żywo 4D miało na celu określeni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Najbardziej krytycznym aspektem obrazowania 4D jest zarządzanie czasem trwania i intensywnością ekspozycji na światło. Fotowybielanie zmniejsza stosunek sygnału do szumu obrazu i może być problematyczne lub nie, w zależności od różnych czynników, w tym wyboru fluoroforów. Niespecyficzne uszkodzenia żywej tkanki (fototoksyczność) są związane z fotowybielaniem i czasami można je zidentyfikować za pomocą sond fluorescencyjnych zaprojektowanych do tego celu2,12 lub poprzez badanie morfologii za pomocą odpowiedniej...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez U.S. National Institutes of Health Grant NS-024572 (dla R.S.W.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Equipment
SGC5Biotium, Hayward, CA70057Stężenie końcowe: 10 mM
FM1-43FXInvitrogen, Karlowe Wary, CAF35335Stężenie końcowe: 7
mM LysoTracker RedInvitrogen, Carlsbad, CAL7528Stężenie końcowe: 0,2 mM
Reptilian Ringers pH 7,2
NaCl145 mM
KCl2,5 mM
CaCl23,6
mM MgSO41,8 mM
KH2PO4 (Dibasic)1,0 mM
HEPES5,0 mM
High KCl Reptilian Dzwonki pH 7,2
NaCl86 mM
KCl60 mM
CaCl23,6 mM
MgSO41,8 mM
KH2PO4 (Dibasic)1,0 mM
HEPES5,0 mM
Wysokie Dzwonki sacharozy pH 7,2
NaCl145 mM
KCl2,5 mM
CaCl23,6 mM
MgSO41,8 mM
KH2PO4 (dwupodstawowy)1,0 mM
HEPES5,0 mM
Sacharoza0,5 M (17,1 g/50 ml)
Mikroskop odwrócony Axioplan 200Carl Zeiss, Thornwood, NYa href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com
Obiektyw wodny N-Achroplan 63X; n.d.=0,9; Odległość robocza=2,4 mm Carl Zeiss, Thornwood, NYa href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com
DG4 kombinowany przełącznik źródła światła/filtra wzbudzeniaSutter Instruments, Novato, CALampa ksenonowa 175Wwww.sutter.com
Lambda 10-2  przełącznik koła filtrów emisjiSutter Instruments, Novato, CAwww.sutter.com
Kamera CCD SensicamCooke Instruments, Tonawanda, NYa href="http://www.cookecorp.com/">www.cookecorp.com
Cascade 512 CCDcamera Photometrics, Tucson, AZa href="http://www.photometrics.com/">www.photometrics.com
Naczynia obrazowe - wykonane we własnym zakresie - średnica 11 cm; Szkiełko nakrywkowe o średnicy 25 mm #1 osadzone; kołki
Software
Slidebook 5.0Innowacje w zakresie inteligentnego obrazowania, Denver, CODekonwolucja; Korekcja dryfu; Prezentacja danych 3D i 4Dwww.intelligent-imaging.com
IMARIS 7.5.2Bitplane, South Windsor, CTKorekcja dryfu; Prezentacja danych 3D i 4Dwww.bitplane.com
AfterEffects CS6Adobe, San Jose, CAKorektadryfuwww.adobe.com
ImageJ 1.46National Institutes of Health, Bethesda, MDDostępnych jest wiele wtyczek; Budowa par stereohttp://rsbweb.nih.gov/ij
Zeiss LSMCarl Zeiss, Thornwood, NYBudowa par stereowww.zeiss.com
<< arc<< magnetyczne

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy-tips and tools. J. Cell Sci. 122 (6), 753-767 (2009).
  2. Tinevez, J. -Y., et al. A quantitative method for measuring phototoxicity of a live cell imaging microscope. Meth. Enzymol. 506, 291-309 (2012).
  3. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, (2011).
  4. Snapp, E. L., Hegde, R. S. Rational design and evaluation of FRETexperiments to measure proteinproximities in cells. Curr. Protoc. Cell Biol. 17, (2006).
  5. Stewart, R. S., Teng, H., Wilkinson, R. S. Late" macroendosomes and acidic endosomes in vertebrate motor nerve terminals. J. Comp. Neurol. 520, 4275-4293 (2012).
  6. Teng, H., Lin, M. Y., Wilkinson, R. S. Macroendocytosis and endosome processing in snake motor boutons. J. Physiol. 582, 243-262 (2007).
  7. McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods. 19, 373-385 (1999).
  8. Swedlow, J. R., Platani, M. Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution. Cell Struct. Funct. 27, 335-341 (2002).
  9. Cromey, D. W. Digital images are data: and should be treated as such. Methods Mol. Biol. Taatjes, D. J., Roth, J. 931, 1-27 (2013).
  10. Teng, H., Wilkinson, R. S. Clathrin-mediated endocytosis near active zones in snake motor terminals. J. Neurosci. 20 (21), 7986-7993 (2000).
  11. Teng, H., Cole, J. C., Roberts, R. L., Wilkinson, R. S. Endocytic active zones: hot spots for endocytosis in vertebrate nerve terminals. J. Neurosci. 19 (12), 4855-4866 (1999).
  12. Tan, T. T. T., Khaw, C., Ng, M. M. L. Challenges and recent advances in live cell bioimaging. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. Mendez-Vilas, A., Diaz, J. , 1495-1505 (2010).
  13. Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. Imaging C. elegans embryos using an epifluorescent microscope and open source software. J. Vis. Exp. (49), (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Makroendosomyendosomy kwasowebarwienie FM 1 43akwizycja stosu Zdekonwolucja obrazutr jwymiarowe widoki obj to cioweprojekcje ortogonalne

Powiązane artykuły