Przekrój rdzenia kręgowego u larw danio pręgowanego

Podsumowanie

Po przecięciu kręgosłupa, dorosłe rybki pręgowane wracają do stanu funkcjonalnego w ciągu sześciu tygodni po urazie. Aby wykorzystać przezroczystość larw i szybszy powrót do zdrowia, przedstawiamy metodę transekcji rdzenia kręgowego larwy. Po przecięciu obserwujemy regenerację czuciową rozpoczynającą się po 2 dniach od urazu i ruch zgięcia C po 3 dniach od urazu.

Streszczenie

Ssaki nie są w stanie odzyskać czucia i motoryki po urazie rdzenia kręgowego z powodu braku odrostu aksonów poniżej poziomu urazu, jak również niemożności ponownego zainicjowania neurogenezy rdzeniowej. Jednak niektóre anamnioty, w tym danio pręgowany Danio rerio, wykazują zarówno czuciową, jak i funkcjonalną regenerację nawet po całkowitym przecięciu rdzenia kręgowego. Dorosły danio pręgowany jest uznanym organizmem modelowym do badania regeneracji po urazie rdzenia kręgowego, z regeneracją czuciową i motoryczną do 6 tygodni po urazie. Aby skorzystać z analizy in vivo procesu regeneracyjnego dostępnego u przezroczystych larw danio pręgowanego, a także narzędzi genetycznych niedostępnych u osoby dorosłej, wykorzystujemy larwy danio pręgowanego do badania regeneracji po przecięciu rdzenia kręgowego. Tutaj demonstrujemy metodę odtwarzalnej i weryfikowalnej transekcji rdzenia kręgowego larwy. Po przecięciu nasze dane pokazują regenerację czuciową rozpoczynającą się po 2 dniach od urazu (dpi), z ruchem zgięcia C wykrywalnym przez 3 dpi i wznowieniem swobodnego pływania przez 5 dpi. Dlatego proponujemy larwala danio pręgowanego jako narzędzie towarzyszące dorosłemu danio pręgowanemu do badania rekonwalescencji po urazie rdzenia kręgowego.

Wprowadzenie

Poważny uraz ludzkiego rdzenia kręgowego często powoduje trwały paraliż i utratę czucia poniżej poziomu urazu, z powodu niemożności odtworzenia aksonów lub ponownego zainicjowania neurogenezy^1,2. Jednak w przeciwieństwie do ssaków, anamnioty, w tym salamandry i danio pręgowany (Danio rerio), wykazują solidną regenerację nawet po całkowitym przecięciu rdzenia kręgowego^3,4.

Dorosły danio pręgowany jest dobrze znanym modelem do badania procesu powrotu do zdrowia po urazie rdzenia kręgowego^5-7. Po całkowitym przecięciu rdzenia kręgowego u dorosłego danio pręgowanego obserwuje się przywrócenie funkcji czuciowych i lokomocyjnych po 6 tygodniach od urazu⁸. Aby zbadać proces regeneracji in vivo, zwróciliśmy się do przezroczystych larw danio pręgowanego⁹.

Tutaj prezentujemy metodę transekcji rdzenia kręgowego larwy danio pręgowanego po 5 dniach od zapłodnienia (dpf) za pomocą skośnej pipety do mikroiniekcji jako skalpela, zmodyfikowanej przez Bhatta, et al.¹⁰ Ta metoda zapewnia wysoką przepustowość, niską śmiertelność i odtwarzalność. Przy odrobinie wprawy można przeciąć 300 larw/godz., a po ponad 6 miesiącach transsekcji, w tym na ponad 3600 zwierzętach, 98,75% ± 0,72% przeżyło do 7 dni po urazie (dpi). Nasze dane wskazują również na szybkie odzyskiwanie czucia i lokomocji: przy 1 dpi cały ruch zranionej ryby jest napędzany wyłącznie przez lokomocję płetwy piersiowej. Jednak larwy zaczynają reagować na dotyk igły wolframowej ogonowo na przecięcie o 2 dpi, przywracają ruch zgięcia C o 3 dpi i wykazują drapieżne pływanie o 5 dpi¹¹. Stosując barwienie przeciwciałami przeciwko acetylowanej tubulinie, potwierdziliśmy, że aksony są nieobecne w miejscu uszkodzenia przy 1 dpi, ale przekroczyły miejsce uszkodzenia o 5 dpi. Wierzymy, że ten protokół zapewni cenną technikę do badania odrastania aksonów i neurogenezy w rdzeniu kręgowym po urazie.

Protokół

Danio pręgowany był hodowany i hodowany zgodnie ze standardowymi procedurami; eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Utah.

1. Przygotowanie płyt chirurgicznych

1. Płytki chirurgiczne należy wykonać przy użyciu szalek Petriego o średnicy 60 mm i zestawu elastomeru silikonowego Sylgard 184, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Napełnij naczynia nie więcej niż do połowy i pozostaw do polimeryzacji. Przechowywać pod przykryciem w temperaturze pokojowej.

2. Przygotowanie mikropipet

1. Wytwarzanie mikropipet poprzez podgrzewanie i ciągnięcie cienkościennych rurek kapilarnych borokrzemianu w ściągaczu do mikropipet przy użyciu tych samych ustawień, co do produkcji igieł do mikroiniekcji.
2. Pod mikroskopem preparacyjnym odłamać końcówkę mikropipety o średnicy około 200 μm za pomocą kleszczy.
3. Skośną krawędź za pomocą mikroszlifierki początkowo do 35°, a następnie drugie ukosowanie pod kątem 25°. Upewnij się, że końcówka jest ostra i gładka. Gotową mikropipetę ze skosem przechowuj na szalce Petriego na niewielkiej ilości gliny.

3. Przygotowanie larw danio pręgowanego

1. Na 7 dni przed zabiegiem należy założyć zbiorniki godowe samców i samic danio pręgowanego.
2. Zbierz zarodki następnego ranka, 3 godziny po zapaleniu się świateł, aby zapewnić maksymalny plon. W przypadku stosowania transgenicznej linii reporterowej, takiej jak Tg(elevl3:eGFP)^knu3, należy sortować zapłodnione zarodki na płytce 100/100 mm w 25 ml E3 w temperaturze 28,5 °C. W przypadku stosowania typu dzikiego należy posortować zapłodnione zarodki na płytce 25/100 mm w 25 ml E3 w temperaturze 28,5 °C.
3. Jeśli używasz linii reporterowej, przebadaj zarodki pod kątem ekspresji fluorescencyjnej przy 48 hpf. Pozostawić zidentyfikowane zarodki do dojrzewania w gęstości 25/100 mm na płytce w 25 ml E3 w temperaturze 28,5 °C.
4. Gdy larwy osiągną 5 dpf, przygotuj płytkę chirurgiczną, pokrywając Sylgard E2 + 10 mg/L Siarczan Gentamycyny (GS) + Trikaina.
   1. Przygotować naczynie regeneracyjne, dodając 25 ml E2 + GS do szalki Petriego o średnicy 100 mm.
   2. Przygotuj skalpel, sklejając ze sobą trzy waciki. Utworzy to trójkątne narzędzie z trzema rowkami.
   3. Zamontuj przygotowaną mikropipetę na wacikach, wklejając ją taśmą w jeden z rowków.
5. W przypadku ponownego użycia mikropipet, przed zamontowaniem na wacikach przepłukać E2 + GS do czystej postaci strzykawką o pojemności 1 ml i igłą 27 G.

4. Chirurgia

1. Znieczulaj jednorazowo 1 płytkę larw (25 ryb) Trikainą. Ryby są wystarczająco znieczulone, gdy nie wykazują już reakcji na dotyk. Ważne jest, aby ryby były całkowicie znieczulone przed operacją, w przeciwnym razie będą drgać, gdy dotknie ich skalpel. Operacja wykonywana jest pod mikroskopem preparacyjnym.
2. Przenieś larwy na płytkę chirurgiczną.
   1. W maksymalnym powiększeniu obracaj jedną larwę na raz, tak aby leżała na boku plecami jak najbliżej ręki trzymającej skalpel.
   2. Ustaw kleszcze tak, aby spoczywały na Sylgardzie, pod kątem na szerokość larwy.
   3. Opierając szklany skalpel o jedno z ramion kleszczy, wciąć się w grzbietową boczną powierzchnię larwy na poziomie porów odbytu, uważając, aby nie ciąć poza brzuszną krawędź struny grzbietowej. Przekręć skalpel, aby przeciąć rdzeń kręgowy.
   4. Powtórz z pozostałymi larwami.
      Uwaga: jeśli larwa krwawi, nie wyzdrowieje po operacji. Natychmiast usuń larwę z płytki chirurgicznej i poddaj ją eutanazji przez przedawkowanie trikainy.
3. Po zakończeniu operacji na partii larw przenieś zranione zwierzęta na płytkę rekonwalescencji. Ma to na celu wsparcie w oczyszczaniu znieczulenia.
   1. Uwaga: zbierając zranione larwy do przenoszenia, upewnij się, że są one zbierane głową lub ogonem jako pierwsze: nie obciążaj miejsca urazu poprzez zginanie larw.
      Uwaga: Wszystkie urządzenia używane do zabiegów chirurgicznych mogą być ponownie użyte, w tym mikropipety.

5. Odzyskiwanie

1. Przenieść zranione larwy z płytki regeneracyjnej na płytki o średnicy 100 mm wypełnione 25 ml E2 + GS o gęstości 25 na płytkę. Pozostawić do rekonwalescencji w inkubatorze o temperaturze 28,5 °C.
2. Codziennie sprawdzaj talerze, usuwając chore i martwe zwierzęta. Nie zmieniaj pożywki, dopóki Coleps (pierwotniaki słodkowodne) nie będą widoczne w pożywce. Podczas zmiany podłoża nie przenoś ryby na nowy talerz; Zamiast tego usuń jak najwięcej nośnika i zalej tę samą płytę nowymi nośnikami. Powtórz w razie potrzeby, aby zmniejszyć populację Coleps.
3. Podawaj codziennie niewielką ilość sproszkowanego pokarmu dla narybku.
   Uwaga: Żywy pokarm (np. pantofelek lub wrotki) nie może być podawany zranionym larwom, dopóki nie odzyskają one zdolności poruszania się. W przeciwnym razie żywy pokarm skolonizuje miejsce urazu i zabije larwy.

Wyniki

Aby zmniejszyć stopień uszkodzenia tkanek wokół miejsca urazu, kluczowe jest prawidłowe ścięcie końcówki mikropipety. Na rysunku 1A przedstawiono prawidłowo ściętą końcówkę. Stosowanie końcówki zbyt szerokiej (rysunek 1B) prowadzi zazwyczaj do większej śmiertelności ze względu na zwiększone prawdopodobieństwo uszkodzenia aorty grzbietowej, natomiast końcówka zbyt wąska (rysunek 1C) ma tendencję do ześlizgiwania się z powierzchni skóry zamiast przecinania tkanki.

Dyskusja

Podczas początkowej nauki tej techniki zalecamy wykonanie nie więcej niż 50-100 transsekcji podczas jednej sesji. Po opanowaniu tej techniki jesteśmy w stanie dokonać transekcji do 300 zarodków na godzinę; Jednak ten poziom przepustowości wymaga kilku miesięcy cotygodniowej praktyki. Zalecamy również ćwiczenie z linią reporterową i sprawdzanie całkowitego przecięcia, dopóki częstość występowania niepełnego przecięcia rdzenia kręgowego nie zmniejszy się do mniej niż 1%.

Przecięcie rdzenia kręgo...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szalka Petriego 60 mm	VWR	82050-544
100 mm szalka Petriego	VWR	89038-968
PDMS, zestaw elastomerów silikonowych Sylgard 184	Fisher Scientific	NC9644388
rurka kapilarna borokrzemianowa: OD 1,00 mm, ID 0,78 mm	Warner Instruments Inc.	64-0778
Kleszcze	Fine Scientific Tools Inc.	11252-30
Mikroskop rozdzielczy	Nikon	SMZ6454
Mikroszlifierka	Narishige	EG-44
Siarczan gentamycyny	Amresco Inc.	0304-5G	rozpuścić w wodzie 10 mg/ml, przechowywać w temperaturze -20 ° C
Tricaine	Acros Organics	118000100
Aplikator z bawełnianą końcówką, drewniany, 6-calowy	Fisher Scientific	23-400-101
Strzykawka 1 ml	BD	309625
Igła 27 G	BD	305109
Smażenie żywności	Argent Labs	F-ARGE-PTL-CN	przechowywać w temperaturze -20 ° C
Ściągacz do mikropipet	Sutter Instrument Co.	Model P-97	Pudełko Filament FB330B
20x E2 (1 L); przechowywać w temperaturze RT
17,5 g NaCl	Fisher Scientific	S671-500
0,75 g KCl	Fisher Scientific	P217-500
2,90 g CaCl2· 2H2O	Sigma	C7902-500G
4,90 g MgSO4· 7H2O	Merck	MX0070-1
0.41 g KH2PO4	Fisher Scientific	P285-500
0.12 g Na2HPO4	Sigma	S0876-500G
500x NaCO3 (10 ml); zrobić świeże, wyrzuć dodatkowe
0,35 g NaCO3	Sigma	S5761
1x E2 (1 L); przechowywać w temperaturze RT
50 ml 20 x E2
2 ml świeży 500x NaCO3