Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przejściowa ekspresja białek przez hydrodynamiczne dostarczanie genów u myszy

28.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51481

⸱

5 maja 2014

 , 
1Department of Biological Sciences, Hunter College, CUNY

W tym artykule

Podsumowanie

Transfekcja in vivo nagiego DNA poprzez hydrodynamiczne dostarczanie genów wprowadza geny do tkanki zwierzęcia z minimalną reakcją zapalną. Generowane są wystarczające ilości produktu genowego, aby można było analizować funkcję i regulację genów, a także strukturę i funkcję białek.

Streszczenie

Efektywna ekspresja transgenów in vivo ma kluczowe znaczenie w badaniu funkcji genów i opracowywaniu metod leczenia chorób. W ciągu ostatnich lat hydrodynamiczne dostarczanie genów (HGD) stało się prostą, szybką, bezpieczną i skuteczną metodą dostarczania transgenów gryzoniom. Technika ta opiera się na sile generowanej przez szybkie wstrzyknięcie dużej objętości roztworu fizjologicznego w celu zwiększenia przepuszczalności błon komórkowych perfundowanych narządów, a tym samym dostarczania DNA do komórek. Jedną z głównych zalet HGD jest możliwość wprowadzania transgenów do komórek ssaków za pomocą nagiego plazmidowego DNA (pDNA). Wprowadzenie egzogennego genu za pomocą plazmidu jest minimalnie pracochłonne, wysoce wydajne i, w przeciwieństwie do nośników wirusa, niezwykle bezpieczne. HGD był początkowo używany do dostarczania genów myszom, obecnie jest używany do dostarczania szerokiej gamy substancji, w tym oligonukleotydów, sztucznych chromosomów, RNA, białek i małych cząsteczek do myszy, szczurów i, w ograniczonym stopniu, innych zwierząt. Protokół ten opisuje HGD u myszy i koncentruje się na trzech kluczowych aspektach metody, które mają kluczowe znaczenie dla pomyślnego przeprowadzenia zabiegu: prawidłowe wprowadzenie igły do żyły, objętość wstrzyknięcia i szybkość podawania. Podano przykłady w celu pokazania zastosowania tej metody do przejściowej ekspresji dwóch genów, które kodują wydzielane, specyficzne dla naczelnych białka, apolipoproteinę L-I (APOL-I) i białko związane z haptoglobiną (HPR).

Wprowadzenie

Od czasu pierwszego opisu przez Liu et al. i Zhang et al., hydrodynamiczne dostarczanie genów (HGD) stało się nieocenionym narzędziem do badania funkcji genów w modelach gryzoni 1,2. Technika polega na szybkim wstrzyknięciu (5-7 sekund) dużej objętości (8-12% masy ciała) roztworu do żyły ogonowej myszy w celu ułatwienia wychwytu plazmidowego DNA przez komórki narządów docelowych 1,2. Stany te prowadzą do silnej ekspresji genów w wątrobie i mniejszej ekspresji genów w nerkach, śledzionie, płucach i sercu.

Wstrzyknięcie 10 μg plazmidu pCMV-LacZ może transfekować aż 40% hepatocytów, co czyni HGD najbardziej efektywną, niewirusową, metodą dostarczania genów in vivo do tej pory1. W przeciwieństwie do nosicieli wirusów, pDNA jest łatwe do przygotowania, nie wywołuje odpowiedzi immunologicznej u gospodarzagryzonia 3 i nie stanowi zagrożenia dla zdrowia poprzez rekombinację z endogennymi wirusami. Ponadto, ponieważ cząsteczki DNA dostarczane przez HGD nie wymagają pakowania, metoda ta nadaje się do dostarczania sztucznych chromosomów bakteryjnych (BAC) o wielkości nawet 150 kb4 . Inne rodzaje cząsteczek, które zostały dostarczone metodą hydrodynamiczną, to RNA5-10, morfoliny11, białka12,13 i inne małe cząsteczki12,14. Zalety i wady HGD w porównaniu z innymi metodami podawania zostały omówione w doskonałych recenzjach w literaturze15-20, a wielu autorów przedstawiło szczegółowy opis procedury21-23.

Wprowadzanie transgenów do myszy za pomocą HGD jest bezpieczne i skuteczne1-3,24 i metoda ta była stosowana u szczurów z porównywalnym sukcesem25. Z pewnymi modyfikacjami przeprowadzono eksperymenty potwierdzające słuszność koncepcji na kurczętach26, królikach27 i świniach28, chociaż zastosowanie tej techniki in vivo u większych zwierząt pozostaje wyzwaniem. W przypadku stosowania tej metody, innym powszechnym ograniczeniem jest to, że wielu dostępnym wektorom ekspresji ssaków brakuje składników do osiągnięcia trwałego, wysokiego poziomu ekspresji genów. Przy użyciu plazmidu pCMV-Luc ekspresja genów w narządach docelowych jest widoczna już po dziesięciu minutach od HGD, jednak początkowy, wysoki poziom ekspresji gwałtownie spada w pierwszym tygodniu po wstrzyknięciu1. Długotrwała ekspresja transgenu jest możliwa w zależności od promotora i intronu zastosowanego w konstrukcji plazmidu 3,24, jednak utrzymanie wysokiego poziomu ekspresji genów często wymaga wielokrotnych wstrzyknięć. Z tego powodu HGD może być mniej odpowiedni do badania chorób przewlekłych, które są wynikiem długotrwałego narażenia na szkodliwe białka lub produkty białkowe. Ze względu na te ograniczenia, HGD jest wyjątkowo potężnym narzędziem do badania potencjalnej roli genu i wpływu jego mutantów in vivo, a także efektów terapeutycznych i regulacji białek oraz do ustanawiania zwierzęcych modeli chorób (przegląd, patrz15). Na przykład HGD może być używany do przypisywania funkcji domenom i aminokwasom białek poprzez indywidualne wprowadzanie różnych konstruktów genów do myszy, które mają znokautowane odpowiednie geny. Co więcej, technika ta może być stosowana w każdym szczepie myszy.

Ten protokół opisuje HGD u myszy, koncentrując się na technicznych aspektach niezbędnych do osiągnięcia udanej transfekcji: prawidłowe wprowadzenie igły do żyły, objętość wstrzyknięcia i szybkość dostarczania. Zastosowanie tej metody wykazano na mysim modelu trypanosomatozy afrykańskiej, śmiertelnej choroby ludzi i zwierząt gospodarskich29,30. Podczas gdy kilka gatunków trypanosomów powoduje choroby u zwierząt gospodarskich, większość z nich nie może powodować chorób u ludzi ze względu na wrodzone kompleksy immunologiczne we krwi zwane czynnikami litycznymi trypanosomów (TLF)29,31,32. Te tworzące pory lipoproteiny o dużej gęstości (HDL) zawierają dwa unikalne, specyficzne dla naczelnych białka: HPR, ligand, który ułatwia wychwyt TLF do trypanosomów, oraz APOL-I, składnik lityczny 31,33-38. Trypanosoma brucei rhodesiense jest zdolny do zakażania ludzi ze względu na ekspresję białka związanego z opornością surowicy (), które wiąże się i neutralizuje ludzki APOL-I 34,39. Pawian TLF nie jest neutralizowany przez ze względu na rozbieżne białko APOL-I40. Jak donoszono wcześniej, przy użyciu wektora ekspresyjnego ssaków (pRG977), transgeniczna ekspresja składników TLF pawiana u myszy zapewnia ochronę przed trypanosomami infekcyjnymi dla ludzi40. Przedstawione tutaj reprezentatywne dane pokazują, w jaki sposób hydrodynamiczne dostarczanie genów może być stosowane do badania efektów terapeutycznych białka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj eksperymenty zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Hunter College, City University of New York.

1. Przygotowanie plazmidowego DNA wolnego od endotoksyn

  1. Wybierz pojedynczą kolonię bakterii zawierającą gen będący przedmiotem zainteresowania w wektorze ekspresji ssaków ze świeżo pokrytej selektywnej płytki z prążkami.
  2. Postępuj zgodnie z zaleceniami zawartymi w podręczniku dostępnego na rynku zestawu do oczyszczania plazmidu bez endotoksyn do hodowli i zbierania bakterii.
  3. Oczyść DNA plazmidu wolnego od endotoksyn z komórek bakteryjnych, postępując zgodnie z protokołem dostępnego na rynku zestawu do oczyszczania plazmidu bez endotoksyn
    4. .
  4. Używaj plastikowych naczyń wolnych od endotoksyn i obchodź się z DNA ostrożnie, aby upewnić się, że endotoksyna nie zostanie ponownie wprowadzona do próbki DNA po etapie usuwania.
  5. Zmierzyć stężenie plazmidowego DNA wolnego od endotoksyn, oznaczając jego absorbancję przy 260 nm za pomocą mikroobjętościowego spektrofotometru UV, jak opisano poniżej, lub standardowego spektrofotometru kuwetowego.
    1. Oczyść dolną i górną powierzchnię optyczną systemu zatrzymywania próbek mikrospektrofotometru w następujący sposób. Odpipetować 1 μl czystej wody dejonizowanej na dolny układ optyczny. Zamknij ramię dźwigni i postukaj w nie kilka razy, aby wykąpać górny układ optyczny, a następnie otwórz dźwignię i wytrzyj do czysta chusteczką.
    2. Otwórz oprogramowanie mikrospektrofotometru i wybierz moduł kwasów nukleinowych.
    3. Umieść 1 μl czystej wody dejonizowanej na dolnym układzie optycznym, opuść ramię dźwigni i wybierz "Zainicjuj" z oprogramowania programu. Po zakończeniu inicjalizacji wyczyść obie powierzchnie optyczne chusteczką.
    4. Wykonaj ślepy pomiar, ładując 1 μl wolnego od endotoksyn buforu TE (10 mM Tris-Cl, pH 8,0; 1 mM EDTA) i wybierając "ślepa" z oprogramowania programu. Po wykonaniu ślepego pomiaru wyczyść obie powierzchnie optyczne chusteczką.
    5. Wykonaj pomiar próbki, ładując 1 μl próbki DNA wolnej od endotoksyn i wybierając "pomiar" z oprogramowania programu. Zapisz stężenie DNA. Oceń czystość DNA, rejestrując współczynnik absorbancji 260/280 nm, który pojawia się na ekranie. Ponieważ stosowanie czystego DNA (stosunek 260/280 1,8) do HGD jest wysoce pożądane, należy unikać używania próbki DNA o stosunku 260/280 poniżej 1,7. Po wykonaniu pomiaru oczyść obie powierzchnie optyczne chusteczką.

2. Ważenie myszy

  1. Oznacz myszy w sposób odpowiedni dla szczepu. Uwaga: znakowanie ogona nie jest zalecane w tej procedurze.
    1. Oznacz czarnym markerem gatunki myszy, które mają białe futro (np. szwajcarski Webster) na grzbiecie. W razie potrzeby ponownie zastosuj znaczniki w miarę upływu czasu.
    2. Oznacz gatunki myszy, które mają czarne futro (np. C57BL/6) poprzez przekłuwanie uszu z kilkudniowym wyprzedzeniem.
  2. Waż myszy pojedynczo, delikatnie umieszczając je na szalce lub wiadrze umieszczonym na cyfrowej wadze laboratoryjnej. Zapisz wagę każdej myszy użytej w eksperymencie w dniu eksperymentu.

3. Przygotowanie strzykawek

  1. Przygotowanie mieszanki iniekcyjnej
    1. Oblicz ilość DNA potrzebną do wstrzyknięcia każdej myszy, zakładając 5 - 50 μg plazmidowego DNA wolnego od endotoksyn.
      1. Określ eksperymentalnie optymalną ilość plazmidowego DNA.
      2. Określając wymaganą ilość DNA, załóżmy wstrzyknięcie jednej dodatkowej myszy na grupę, ponieważ prawidłowe załadowanie strzykawek będzie wymagało dodatkowej mieszanki do wstrzykiwań. Aby ułatwić obliczenia, rozważmy następujący przykład: wstrzyknij 4 myszy eksperymentalne i 4 myszy kontrolne, każda o wadze 25 g, po 50 μg plazmidowego DNA na mysz. Aby określić ilość DNA potrzebną w tym przypadku, oblicz z 5 myszami na grupę: 5 x 50 μg = 250 μg DNA potrzebne dla każdej grupy.
    2. Określić ilość soli fizjologicznej (0,9% chlorku sodu) potrzebną, przyjmując 10% masy ciała do wstrzyknięcia każdej myszy.
      1. Zgodnie z powyższym przykładem, wstrzyknij każdej myszy o wadze 25 g 50 μg plazmidowego DNA w 2,5 ml soli fizjologicznej (2,5 g płynu).
      2. Określając ilość soli fizjologicznej wymaganą dla całej grupy myszy, należy założyć wstrzyknięcie dodatkowej myszy na grupę, aby umożliwić prawidłowe załadowanie strzykawek. Biorąc pod uwagę podane doświadczenie, oblicz ilość soli fizjologicznej potrzebną dla 5 myszy w każdej grupie: 5 x 2,5 ml = 12,5 ml soli fizjologicznej dla każdej grupy (lub łącznie 25 ml). Uwaga: Jeśli myszy z tej samej grupy nie mają tej samej masy ciała (więcej niż 10% różnicy w masie ciała), należy przygotować mieszanki do wstrzykiwań oddzielnie.
    3. Używaj bezkonserwantów i endotoksyn, sterylnego roztworu soli fizjologicznej, który został zatwierdzony do stosowania u ludzi, w 10 ml fiolkach wielokrotnego użytku.
    4. Za pomocą igły o rozmiarze 20 (0,9 mm x 25 mm) przymocowanej do końcówki typu luer-lock strzykawki o pojemności 20 ml, pobrać płyn z fiolek z solą fizjologiczną i opróżnić strzykawki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Aby pomóc w dokładnym pipetowaniu soli fizjologicznej podczas przygotowywania mieszanin do wstrzykiwań DNA i soli fizjologicznej, należy zebrać więcej soli fizjologicznej niż jest to potrzebne do wstrzyknięcia wszystkim myszom w eksperymencie. W powyższym eksperymencie należy pobrać sól fizjologiczną z 3 fiolek o pojemności 10 ml (łącznie około 30 ml), nawet jeśli obliczona ilość soli fizjologicznej potrzebna do przeprowadzenia eksperymentu wynosi tylko 25 ml.
    5. Odpipetować obliczoną ilość DNA do innej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Należy uważać, aby nie dotknąć korpusu pipety bokiem probówki, aby uniknąć wprowadzenia endotoksyny. Zgodnie z przykładem, odpipetować 250 μg kontroli i 250 μg eksperymentalnego plazmidowego DNA do oddzielnych stożkowych probówek.
    6. Dodaj wymaganą ilość soli fizjologicznej do DNA za pomocą pipety serologicznej. Biorąc pod uwagę doświadczenie z próbką, odpipetować 12,5 ml soli fizjologicznej do każdej z mieszanek wzorcowych (eksperymentalnej i kontrolnej).
    7. Przed wstrzyknięciem należy odczekać, aż wszystkie roztwory osiągną temperaturę pokojową.
  2. Przygotowanie strzykawek
    1. Dla każdej myszy napełnij sterylną, 3 ml strzykawkę typu luer-lock mieszanką DNA i soli fizjologicznej za pomocą sterylnej igły o rozmiarze 20 (0,9 mm x 25 mm). Uważaj, aby uniknąć pęcherzyków powietrza. Należy unikać używania strzykawek o większej objętości, ponieważ szybkość wtrysku nie może być bardzo dobrze kontrolowana i trudno jest manipulować większymi strzykawkami w jednej ręce. Wyrzuć nadmiar mieszanki DNA i soli fizjologicznej z powrotem do stożkowej probówki, ponieważ może ona zostać ponownie użyta.
    2. Zmienić igłę na sterylną igłę o rozmiarze 27. Całkowicie napełnić igłę płynem, nie wprowadzając pęcherzyków powietrza. Dostosuj objętość mieszanki DNA i soli fizjologicznej obliczoną na podstawie wagi myszy.
    3. Nie dopuścić do tego, aby nieosłonięta igła dotykała jakiejkolwiek niesterylnej powierzchni. W razie potrzeby igły można ponownie nakręcić techniką jednoręczną: umieść nasadkę na płaskiej powierzchni, włóż igłę bez trzymania nasadki drugą ręką i dociśnij nakrętkę igłą do twardego przedmiotu, aby przymocować nasadkę do igły. Strzykawki są teraz gotowe do wstrzykiwań do żyły ogonowej.

4. Hydrodynamiczne dostarczanie DNA

  1. Należy pamiętać, że znieczulenie myszy może zmniejszyć żywotność. Unikaj wykonywania HGD w pomieszczeniu, które jest zbyt zimne, ponieważ zmniejszy to również żywotność. Jeśli w pomieszczeniu panuje temperatura otoczenia 20 °C lub jeśli stosuje się znieczulenie, po zabiegu umieść myszy na poduszce grzewczej ustawionej na 37 °C, aby uniknąć utraty zwierząt. Jeśli używasz znieczulenia, upewnij się, że usta i pysk myszy są drożne podczas korzystania z poduszki grzewczej i obserwuj mysz, aż w pełni wyzdrowieje. Nie odmawiaj myszom jedzenia ani wody przed HGD.
  2. Ogrzej myszy, aby rozszerzyły naczynia krwionośne.
    1. Umieść klatkę na mysz (z dołączoną pościelą) na poduszce grzewczej na 5 minut, tak aby temperatura ściółki wynosiła około 38-39 °C. Temperatura powinna być na tyle niska, aby myszy trzymały się na poduszce grzewczej przez dłuższy czas.
    2. Alternatywnie, umieść mysz w ograniczniku dostępu grzbietowego z minimalnym ograniczeniem. Ogrzewaj ogon myszy przez 1 minutę, delikatnie przytrzymując go kawałkiem gazy zwilżonej ciepłą wodą. W razie potrzeby zezwól myszy na zmianę położenia. Wytrzyj ogon chusteczką do wyschnięcia.
    3. Alternatywnie ogrzej mysz, umieszczając klatkę pod lampą grzewczą na nie dłużej niż 2 minuty. Jeśli używasz lampy grzewczej, zachowaj ostrożność, aby uniknąć przegrzania myszy.
  3. Iniekcja żyły ogonowej o dużej objętości
    1. Unieruchomić ogranicznik dostępu grzbietowego na płaskiej powierzchni za pomocą taśmy laboratoryjnej.
    2. Trzymając za ogon, delikatnie umieść mysz w ograniczniku i włóż wtyczkę. Używaj tak mało ograniczeń, jak to konieczne, aby utrzymać ogon unieruchomiony. Upewnij się, że mysz oddycha swobodnie.
    3. Jeśli mysz znajduje się w poważnym niebezpieczeństwie w dowolnym momencie zabiegu, natychmiast wyjmij mysz z ogranicznika i pozwól jej odpocząć.
    4. Ustaw mysz tak, aby widoczna była jedna z bocznych żył ogonowych. Zlokalizuj boczne żyły ogonowe, patrząc prosto w dół na tył myszy: czerwona linia biegnąca pośrodku ogona to tętnica, podczas gdy niebieskie linie po obu stronach ogona to boczne żyły ogonowe.
    5. Dokładnie wytrzyj ogon myszy wacikiem nasączonym alkoholem.
    6. Używając ręki nieiniekcyjnej, trzymaj mocno ogon między palcem wskazującym i środkowym, tak aby ogon przechodził pod palcem wskazującym, nad środkowym i trzecim palcem oraz pod małym palcem. Pozwól, aby kciuk pozostał swobodny i mógł się poruszać. (Rysunek 1A)
    7. Drugą ręką przetrzyj ponownie obszar wstrzyknięty wacikiem nasączonym alkoholem. Pozostaw obszar do wyschnięcia.
    8. Podnieść załadowaną strzykawkę ręką do wstrzykiwania i trzymać ją za cylinder między kciukiem a pozostałymi czterema palcami. Nie trzymać za tłok.
    9. Ustawić strzykawkę równolegle do ogona, z igłą skierowaną w stronę ciała myszy i skosem (skośną krawędzią) igły skierowaną do góry.
    10. Wbić igłę do żyły ogonowej. Wstrzyknięcie należy wykonać tylko wtedy, gdy żyła jest prawidłowo zlokalizowana, co jest widoczne po wsunięciu igły bez oporu. Należy pamiętać, że głębokość wkłucia igły jest kwestią osobistych preferencji, jednak pełne wprowadzenie nie jest zalecane ze względu na zwiększone ryzyko ścinania żyły. Unikać przesuwania igły.
    11. Używając kciuka ręki trzymającej ogon, zamknij piastę igły i dociśnij piastę do ogona, aby utrzymać igłę na miejscu. Nie należy wywierać nadmiernego nacisku i nie chwytać się trzonu igły, ponieważ utrudni to przepływ płynu do żyły. W tym miejscu luźno trzymać ogon palcem wskazującym, aby nie utrudniać wstrzyknięcia (Rysunek 1A).
    12. Ponownie ustawić rękę trzymającą strzykawkę tak, aby palec wskazujący i środkowy trzymały się kołnierza, a kciuk znajdował się na końcu tłoka (Rysunek 1A).
    13. Docisnąć tłok jednym, ciągłym ruchem i wstrzyknąć pełną objętość płynu w ciągu 6-8 sekund.
    14. Usuń igłę z żyły i zatamuj krwawienie, delikatnie uciskając ogon chusteczką.
    15. Wyjmij mysz z ogranicznika i umieść ją w klatce regeneracyjnej umieszczonej na poduszce grzewczej (ściółka powinna mieć temperaturę 37-38 °C). Jeśli pomieszczenie iniekcyjne jest zimne, ten krok ma kluczowe znaczenie dla przeżycia myszy. Przytrzymaj ogon myszy, aż krwawienie całkowicie ustaje.
    16. Obserwuj mysz przez 1 godzinę po hydrodynamicznym podaniu DNA. Początkowy okres dyszenia i bezruchu jest normalny z powodu tymczasowej arytmii spowodowanej przez HGD, ale upewnij się, że mysz wykazuje oznaki powrotu do zdrowia w ciągu około 5 minut. Jeśli oddech myszy stanie się nadmiernie płytki, delikatnie masuj brzuch myszy, aby ułatwić oddychanie. Należy pamiętać, że na tempo regeneracji może mieć niewielki wpływ zastosowany szczep myszy.
    17. Umieść mysz z powrotem w klatce i upewnij się, że mysz ma obfity zapas jedzenia i wody.
  4. Iniekcja do żyły ogonowej o dużej objętości przy użyciu alternatywnej pozycji dłoni
    1. Umieścić mysz w unieruchomieniu i przygotować się do wstrzyknięcia, wykonując czynności opisane w punktach od 4.3.1 do 4.3.5, jak opisano powyżej.
    2. Oprzyj dłoń, której nie wykonuje się iniekcji, na płaskiej powierzchni z czterema palcami zgiętymi pod kątem dziewięćdziesięciu stopni. Palce (wszystkie z wyjątkiem kciuka) powinny spoczywać jeden na drugim, tworząc platformę. Przytrzymaj ogon myszy między kciukiem a palcem wskazującym (Rysunek 1B).
    3. Drugą ręką przetrzyj ponownie obszar wstrzyknięty wacikiem nasączonym alkoholem. Pozostaw obszar do wyschnięcia.
    4. Chwycić strzykawkę ręką do wstrzykiwania i przytrzymać ją za kołnierz i koniec tłoka, aby była gotowa do wstrzyknięcia.
    5. Zakończ procedurę, postępując zgodnie z tym protokołem od kroku 4.3.9 do kroku 4.3.17, jak opisano wcześniej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Prawidłowe umieszczenie igły w żyle ogonowej myszy (jak pokazano na Rysunku 1) jest warunkiem niezbędnym do skutecznego wprowadzenia transgenu za pomocą transfekcji hydrodynamicznej. Często jednak najtrudniejszym elementem tej techniki jest utrzymanie igły w żyle ogonowej bez przemieszczania się, tak aby cała objętość wstrzykiwanego roztworu mogła zostać podana w czasie od 6 do 8 s. Nawet niewielkie błędy podczas procesu iniekcji mogą prowadzić do znacznego obniżenia wydajności transfekcji i ekspresji bi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przy prawidłowym wykonaniu, HGD jest niezwykle bezpiecznym i skutecznym sposobem dostarczania transgenów. Kluczowymi krokami do udanego HGD są: 1) dostarczenie odpowiedniej ilości DNA w dużej objętości nośnika soli fizjologicznej 2) do żyły ogonowej myszy 3) w czasie krótszym niż 8 sekund.

Chociaż sam proces wstrzykiwania niezaprzeczalnie wymaga pewnej zręczności manualnej, sukces tej sześciosekundowej procedury często leży w starannym przygotowaniu eksperymentu. Ilość pDNA niezbędna do osiągn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy Xia Liu (Regeneron Pharmaceuticals) za początkowe nauczenie nas techniki HGD oraz Dr. Russellowi Thomsonowi (Albert Einstein College of Medicine) za jego ciągłe wskazówki w różnych aspektach technologii. Ta praca została sfinansowana przez Hunter College, fundusze startowe CUNY i nagrodę NSF Bread IOS-1249166. Dziękujemy NYULMC Histopathology Core NYUCI Center Support Grant, NIH/NCI 5 P30CA16087-31 za histologię wątroby myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do przygotowania chusteczek nasączonych alkoholemWebcol6818
AST, probówka stożkowa Amplite ColorimetricAAT Bioquest13801
, 50 mlBD Falcon352070
EndoFree Plasmid Maxi KitQiagen12362
KimWipesKIMTECH34120
Oświetlacz ogona myszyBraintree ScientificMTI RSTLub równoważna
igła, 20 Gx 1 (0,9 mm x 25 mm)Igła 305175
, 27 Gx 1/2 (0,9 mm x 25 mm)BD305109
pRG977 (wektor ekspresji ssaków)umowa o transferze materiałuRegeneron Pharmaceuticals
Chlorek sodu, 0,9% INJ USP 10 ml, Hospira NC9054335
, 3 ml, końcówka Luer-Lok BD309657Luer Lock niezbędna do wytrzymania nacisku HGD
BD Wymagana Strzykawka Fisher

Bibliografia

  1. Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).
  2. Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther. 10, 1735-1737 (1999).
  3. Miao, C. H., Thompson, A. R., Loeb, K., Ye, X. Long-term and therapeutic-level hepatic gene expression of human factor IX after naked plasmid transfer in vivo. Mol Ther. 3, 947-957 (2001).
  4. Magin-Lachmann, C., et al. In vitro and in vivo delivery of intact BAC DNA -- comparison of different methods. J Gene Med. 6, 195-209 (2004).
  5. Chang, J., Sigal, L. J., Lerro, A., Taylor, J. Replication of the human hepatitis delta virus genome Is initiated in mouse hepatocytes following intravenous injection of naked DNA or RNA sequences. J Virol. 75, 3469-3473 (2001).
  6. Giladi, H., et al. Small interfering RNA inhibits hepatitis B virus replication in mice. Mol Ther. 8, 769-776 (2003).
  7. Kobayashi, N., et al. Vector-based in vivo RNA interference: dose- and time-dependent suppression of transgene expression. J Pharmacol Exp Ther. 308, 688-693 (2004).
  8. Layzer, J. M., et al. In vivo activity of nuclease-resistant siRNAs. Rna. 10, 766-771 (2004).
  9. McCaffrey, A. P., et al. RNA interference in adult mice. Nature. 418, 38-39 (2002).
  10. McCaffrey, A. P., et al. Determinants of hepatitis C translational initiation in vitro, in cultured cells and mice. Mol Ther. 5, 676-684 (2002).
  11. McCaffrey, A. P., Meuse, L., Karimi, M., Contag, C. H., Kay, M. A. A potent and specific morpholino antisense inhibitor of hepatitis C translation in mice. Hepatology. 38, 503-508 (2003).
  12. Zhang, G., et al. Hydroporation as the mechanism of hydrodynamic delivery. Gene Ther. 11, 675-682 (2004).
  13. Kobayashi, N., Kuramoto, T., Yamaoka, K., Hashida, M., Takakura, Y. Hepatic uptake and gene expression mechanisms following intravenous administration of plasmid DNA by conventional and hydrodynamics-based procedures. J Pharmacol Exp Ther. 297, 853-860 (2001).
  14. Kobayashi, N., Nishikawa, M., Hirata, K., Takakura, Y. Hydrodynamics-based procedure involves transient hyperpermeability in the hepatic cellular membrane: implication of a nonspecific process in efficient intracellular gene delivery. J Gene Med. 6, 584-592 (2004).
  15. Bonamassa, B., Hai, L., Liu, D. Hydrodynamic gene delivery and its applications in pharmaceutical research. Pharm Res. 28, 694-701 (2011).
  16. Al-Dosari, M. S., Gao, X. Nonviral gene delivery: principle, limitations, and recent progress. Aaps J. 11, 671-681 (2009).
  17. Gao, X., Kim, K. S., Liu, D. Nonviral gene delivery: what we know and what is next. Aaps J. 9, (2007).
  18. Herweijer, H., Wolff, J. A. Gene therapy progress and prospects: hydrodynamic gene delivery. Gene Ther. 14, 99-107 (2007).
  19. Kobayashi, N., Nishikawa, M., Takakura, Y. The hydrodynamics-based procedure for controlling the pharmacokinetics of gene medicines at whole body, organ and cellular levels. Adv Drug Deliv Rev. 57, 713-731 (2005).
  20. Al-Dosari, M. S., Knapp, J. E., Liu, D. Hydrodynamic delivery. Adv Genet. 54, 65-82 (2005).
  21. Bell, J. B., et al. Preferential delivery of the Sleeping Beauty transposon system to livers of mice by hydrodynamic injection. Nat Protoc. 2, 3153-3165 (2007).
  22. Osorio, F. G., de la Rosa, J., Freije, J. M. Luminescence-based in vivo monitoring of NF-kappaB activity through a gene delivery approach. Cell Commun Signal. 11, (2013).
  23. Knapp, J. E., Liu, D. Hydrodynamic delivery of DNA. Methods Mol Biol. 245, 245-250 (2004).
  24. Yang, J., Chen, S., Huang, L., Michalopoulos, G. K., Liu, Y. Sustained expression of naked plasmid DNA encoding hepatocyte growth factor in mice promotes liver and overall body growth. Hepatology. 33, 848-859 (2001).
  25. Maruyama, H., et al. High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection. J Gene Med. 4, 333-341 (2002).
  26. Hen, G., et al. Expression of foreign genes in chicks by hydrodynamics-based naked plasmid transfer in vivo. Domestic animal endocrinology. 30, 135-143 (2006).
  27. Eastman, S. J., et al. Development of catheter-based procedures for transducing the isolated rabbit liver with plasmid DNA. Hum Gene Ther. 13, 2065-2077 (2002).
  28. Yoshino, H., Hashizume, K., Kobayashi, E. Naked plasmid DNA transfer to the porcine liver using rapid injection with large volume. Gene Ther. 13, 1696-1702 (2006).
  29. Vanden Bossche, P. Some general aspects of the distribution and epidemiology of bovine trypanosomosis in southern Africa. Int J Parasitol. 31, 592-598 (2001).
  30. Fevre, E. M., Picozzi, K., Jannin, J., Welburn, S. C., Maudlin, I. Human African trypanosomiasis: Epidemiology and control. Adv Parasitol. 61, 167-221 (2006).
  31. Lugli, E. B., Pouliot, M., Portela Mdel, P., Loomis, M. R., Raper, J. Characterization of primate trypanosome lytic factors. Mol Biochem Parasitol. 138, 9-20 (2004).
  32. Pays, E., et al. The trypanolytic factor of human serum. Nat Rev Microbiol. 4, 477-486 (2006).
  33. Raper, J., Fung, R., Ghiso, J., Nussenzweig, V., Tomlinson, S. Characterization of a novel trypanosome lytic factor from human serum. Infect Immun. 67, 1910-1916 (1999).
  34. Vanhamme, L., et al. Apolipoprotein L-I is the trypanosome lytic factor of human serum. Nature. 422, 83-87 (2003).
  35. Nielsen, M. J., et al. Haptoglobin-related protein is a high-affinity hemoglobin-binding plasma protein. Blood. 108, 2846-2849 (2006).
  36. Molina-Portela Mdel, P., Lugli, P., Recio-Pinto, E., Raper, J. Trypanosome lytic factor, a subclass of high-density lipoprotein, forms cation-selective pores in membranes. Mol Biochem Parasitol. 144, 218-226 (2005).
  37. Perez-Morga, D., et al. Apolipoprotein L-I promotes trypanosome lysis by forming pores in lysosomal membranes. Science. 309, 469-472 (2005).
  38. Molina-Portela, M. P., Samanovic, M., Raper, J. Distinct roles of apolipoprotein components within the trypanosome lytic factor complex revealed in a novel transgenic mouse model. J Exp Med. 205, 1721-1728 (2008).
  39. Oli, M. W., Cotlin, L. F., Shiflett, A. M., Hajduk, S. L. Serum resistance-associated protein blocks lysosomal targeting of trypanosome lytic factor in Trypanosoma brucei. Eukaryot Cell. 5, 132-139 (2006).
  40. Thomson, R., Molina-Portela, P., Mott, H., Carrington, M., Raper, J. Hydrodynamic gene delivery of baboon trypanosome lytic factor eliminates both animal and human-infective African trypanosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 19509-19514 (2009).
  41. Genovese, G., et al. Association of trypanolytic ApoL1 variants with kidney disease in African Americans. Science. 329, 841-845 (2010).
  42. Tzur, S., et al. Missense mutations in the APOL1 gene are highly associated with end stage kidney disease risk previously attributed to the MYH9 gene. Hum Genet. 128, 345-350 (2010).
  43. Suda, T., Gao, X., Stolz, D. B., Liu, D. Structural impact of hydrodynamic injection on mouse liver. Gene Ther. 14, 129-137 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przejściowa ekspresja białkanagie DNA plazmidoweiniekcja do żyły ogonowejanaliza Western blotpobieranie krwi myszyprzygotowanie DNA plazmidowegotechnika napełniania strzykawkiutrzymanie pozycji igłydetekcja APOL-I HPR
Przejściowa ekspresja białek przez hydrodynamiczne dostarczanie genów u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.