Artykuł metodologiczny

Test pochłaniania: protokół oceny interakcji między fagocytami OUN a neuronami

DOI:

10.3791/51482

⸱

8 czerwca 2014

 ,  ,  , 
1Department of Neurology, F.M. Kirby Neurobiology Center, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroglej to komórki odpornościowe ośrodkowego układu nerwowego (OUN) o dużej zdolności do fagocytozy lub pochłaniania materiału w swoim środowisku zewnątrzkomórkowym. W tym miejscu opisano szeroko stosowany, wiarygodny i wysoce ilościowy test do wizualizacji i pomiaru pochłaniania składników synaptycznych za pośrednictwem mikrogleju.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fagocytoza to proces, w którym komórka pochłania materiał (całą komórkę, części komórki, szczątki, itp.) w otaczającym ją środowisku zewnątrzkomórkowym, a następnie trawi ten materiał, zwykle poprzez degradację lizosomalną. Mikroglej to rezydujące komórki odpornościowe ośrodkowego układu nerwowego (OUN), których funkcja fagocytarna została opisana w szerokim zakresie schorzeń, od chorób neurodegeneracyjnych (np. klirens beta-amyloidu w chorobie Alzheimera) po rozwój zdrowego mózgu (np. przycinanie synaptyczne)1-6. Poniższy protokół to test pochłaniania opracowany w celu wizualizacji i ilościowego określenia pochłaniania presynaptycznego danych wejściowych za pośrednictwem mikrogleju w rozwijającym się mysim układzie retinogenikulatu7. Chociaż test ten został wykorzystany do oceny funkcji mikrogleju w tym konkretnym kontekście, podobne podejście można zastosować do oceny innych fagocytów w całym mózgu (np. astrocytów) i reszty ciała (np. makrofagów obwodowych), a także w innych kontekstach, w których zachodzi przebudowa synaptyczna (np. uraz/choroba mózgu).

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obwody synaptyczne przemodelowują się przez całe życie zwierzęcia. W rozwijającym się mózgu synapsy tworzą się w nadmiarze i muszą przejść przycinanie synaptyczne, które polega na selektywnym usuwaniu podzbioru synaps oraz utrzymaniu i wzmacnianiu tych synaps, które pozostają8-10. Proces ten jest niezbędny do osiągnięcia precyzyjnej łączności charakterystycznej dla dorosłego układu nerwowego. U osoby dorosłej synapsy mogą być również plastyczne, szczególnie w kontekście uczenia się i pamięci. Uważa się, że strukturalne korelaty tej plastyczności obejmują dodawanie i/lub eliminację kolców dendrytycznych i butonów presynaptycznych11-13. Oprócz tych ról w zdrowym układzie nerwowym, przebudowa synaps jest również zaangażowana w choroby/urazy układu nerwowego12,14,15. Na przykład, po urazie rdzenia kręgowego, odcięte aksony muszą następnie przebudować się i utworzyć nowe synapsy, aby osiągnąć funkcjonalne odzyskanie16-19.

Ważnym aspektem plastyczności synaptycznej jest proces fagocytozy lub pochłaniania synaps przeznaczonych do usunięcia3,5,20. Niedawno pokazaliśmy to zjawisko w kontekście przycinania synaps w zdrowym, postnatalnym mózgu myszy7. W szczególności wykazano, że mikroglej, rezydentne komórki odpornościowe OUN i fagocyty, pochłaniają dane wejściowe presynaptyczne w okresie szczytu i w regionie rozwojowego przycinania synaptycznego, pourodzeniowym jądrze kolankowatym grzbietowym bocznym (dLGN) wzgórza. Genetyczna lub farmakologiczna blokada tego pochłonięcia spowodowała trwałe deficyty w łączności synaptycznej.

W tym protokole opisujemy wiarygodny i wysoce ilościowy test do pomiaru pochłaniania presynaptycznych danych wejściowych za pośrednictwem fagocytów. Na potrzeby tego artykułu test ten zostanie przedstawiony w kontekście rozwijającego się układu retinogenikulatu, który obejmuje komórki zwojowe siatkówki (RGC) znajdujące się w siatkówce, które rzutują presynaptyczne dane wejściowe do dLGN (Figura 1A). Na początek opisana zostanie odporna na degradację lizosomalną strategia znakowania następczego, która służy do wizualizacji specyficznych dla RGC wejść presynaptycznych w dLGN (Figura 1)7,21. Zgodnie z tym opisem przedstawiona zostanie szczegółowa metodologia obrazowania i ilościowego pomiaru objęcia za pomocą mikroskopii konfokalnej w połączeniu z trójwymiarowym (3D) renderowaniem objętości powierzchni. Metodologia ta opiera się na utrwalonym przygotowaniu tkanek, ale może być również dostosowana do stosowania w badaniach obrazowania na żywo. Co ważne, chociaż test został zwalidowany w kontekście zdrowego, poporodowego układu retinogenikulacyjnego, można zastosować te same techniki do oceny innych interakcji fagocytów-neuronów w mózgu i podczas choroby, a także funkcji fagocytów w innych układach narządów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Następcze znakowanie wejść presynaptycznych RGC

Uwaga: Wszystkie eksperymenty z wykorzystaniem zwierząt były przeglądane i nadzorowane przez instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami i ich użytkowania (IACUC) zgodnie ze wszystkimi wytycznymi NIH.

  1. Sterylizuj pole i instrumenty.
  2. Znieczulić mysz za pomocą 4% obj. izofluranu w komorze indukcyjnej z pleksiglasu (ten % obj. izofluranu działa na dorosłe noworodki). Uważnie obserwuj myszy, aby uniknąć nadmiernego znieczulenia. UWAGA: Unikać wdychania z próżniowym odprowadzaniem gazów odlotowych.
  3. Po 1-3 minutach (starsze myszy będą wymagały mniej czasu) upewnij się, że osiągnięto odpowiedni poziom znieczulenia, szczypiąc ogon (nie należy obserwować żadnej reakcji) i obserwując częstość oddechów (częstość powinna być powolna i stabilna).
  4. Umieść mysz pod mikroskopem stereoskopowym na boku i umieść stożek nosowy dostarczający 3-4% obj. izofluranu nad pyskiem (noworodki < 10. dobie pourodzeniowej ~4 obj.; >P10 ~3 obj.).
  5. Odsłoń twardówkę. Do wstrzykiwania noworodków przed otwarciem oczu należy użyć małych nożyczek sprężynowych, aby otworzyć powiekę i odciągnąć skórę, aby odsłonić twardówkę. W przypadku starszych myszy użyj palców, aby odciągnąć skórę otaczającą oko, aby odsłonić twardówkę. UWAGA: U noworodków czasami konieczne jest kolejne prostopadłe cięcie w kąciku oka. Zachowaj ostrożność podczas obcinania kącika powieki, ponieważ znajduje się tam naczynie krwionośne, które w przypadku przecięcia będzie nadmiernie krwawić.
  6. Użyj sterylnej igły 30,5 G, aby nakłuć mały otwór z boku oka w miejscu, w którym zaczyna się twardówka. Należy uważać, aby nie uszkodzić soczewki, wkładając igłę na tyle głęboko, aby skos wszedł do oka.
  7. Pozwól, aby ciało szkliste wypłynęło z otworu i użyj sterylnego aplikatora z bawełnianą końcówką, aby wchłonąć płyn.
  8. Gdy ciało szkliste przestanie wypływać z otworu, włóż do otworu tępo zakończoną igłę przymocowaną do strzykawki Hamiltona wstępnie załadowanej następczym barwnikiem śledzącym. UWAGA: Wbijaj igłę powoli, aby uniknąć przebicia drugiej strony oka lub uszkodzenia soczewki.
  9. Powoli wstrzyknij barwnik do oka. Zazwyczaj podjednostka β toksyny sprzężona z Alexa 594, 647 lub 488 (CTB-594, CTB-647 lub CTB-488, 5-6 μg/μl) jest używana do następczego śledzenia wejść RGC. Dla noworodków (≤P10) wystarczy 1-2 μl, a dla myszy >P10 ~3 μl. Uwaga: Barwniki Alexa są szczególnie odporne na degradację lizosomalną
  10. Pozostaw igłę w otworze na kilka sekund, a następnie powoli wyjmij.
  11. Użyj aplikatora z bawełnianą końcówką, aby wchłonąć nadmiar płynu i zapobiec wyciekaniu barwnika.
  12. Nałóż niewielką ilość maści z antybiotykiem na oko. Jeśli oko zostało otwarte chirurgicznie, delikatnie zbliż powieki do siebie.
  13. W przypadku wstrzyknięcia do obu oczu powtórzyć procedurę na drugim oku.
  14. Po wstrzyknięciu należy pozostawić mysz pod lampą grzewczą lub na poduszce grzewczej, aż zacznie dochodzić do siebie po znieczuleniu.
  15. Umieść mysz w czystej klatce domowej i monitoruj, aby upewnić się, że jest w pełni obudzona przed powrotem do kolonii.

2. Przygotowanie tkanki do obrazowania

Ten protokół przygotowania tkanek jest stosowany u myszy reporterowych, u których fagocyty są znakowane markerami fluorescencyjnymi (np. CX3CR1-EGFP dla mikrogleju). Jeśli linia reporterowa nie jest dostępna, badacz może immunobarwić skrawki tkanek (patrz Dyskusja).

  1. ~ 24 godziny po wstrzyknięciu poświęć mysz i przeprowadź sekcję mózgu.
  2. Wrzuć mózg do probówki Falcon wypełnionej 4% paraformaldehydem (PFA) na noc w temperaturze 4 °C. UWAGA: PFA jest toksyczny. Unikaj wdychania i narażenia skóry na działanie dygestoriów lub na stole zstępującym oraz nosząc środki ochrony osobistej. Uwagi: Fiksacja może być krótsza (≥4 godziny). Ponadto, zamiast utrwalania kropli, można zastosować 4% perfuzję PFA, a następnie utrwalenie kropli w ciągu 2-24 godzin. Jednak porównanie perfuzji do kropli w mózgach noworodków i dorosłych nie wykazało różnicy w jakości obrazu ani kwantyfikacji.
  3. Przepłucz mózg 3x w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
    1. Wlej mózg i PFA do pustej łodzi do ważenia.
    2. Użyj szpatułki, aby przenieść mózg do innej łodzi wypełnionej PBS.
    3. Umyj mózg jeszcze dwa razy w PBS (przenieś mózg do dwóch dodatkowych łodzi wypełnionych PBS).
  4. Przenieś mózg do probówki Falcona wypełnionej 30% roztworem sacharozy. Pozostawić mózg w sacharozie w temperaturze 4 °C, aż mózg opadnie na dno rurki (24-48 godzin).
  5. Gdy mózg opadnie, przygotuj go do sekcji. Kolejne kroki to przygotowanie pływających odcinków o wielkości 40 μm za pomocą przesuwnego mikrotomu ze stopniem zamrażania (można również użyć kriostatu).
    1. Użyj żyletki, aby usunąć części mózgu, które nie są potrzebne (w przypadku dLGN usuń rostralną i ogonową część mózgu).
    2. Zamroź mózg na folii aluminiowej na suchym lodzie. W tym czasie należy zamrozić etap mikrotomu i napełnić każdą studzienkę 24-dołkowej płytki 0,5 ml 0,1 M buforu fosforanowego (PB).
  6. Zamontuj zamrożony mózg (powinien wydawać się nieprzezroczysty) na etapie zamrażania.
    1. Nałóż niewielką ilość środka o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) na stolik.
    2. Gdy OCT zacznie zamarzać, połóż mózg w OCT. Koniec mózgu, który zostanie przecięty, powinien być skierowany do góry (np. w przypadku dLGN skierowany ogonowo do góry).
    3. Przykryj mózg i OCT bardzo drobno pokruszonym suchym lodem.
    4. Pozostaw suchy lód na mózgu/OCT na ~30 sekund.
    5. Użyj dużego pędzla, aby usunąć suchy lód. Mózg i OCT powinny być zamrożone do sceny.
  7. Rozpocznij sekcję przez tkankę, aż do osiągnięcia obszaru zainteresowania (ROI).
  8. Po osiągnięciu zwrotu z inwestycji użyj małego pędzla, aby usunąć sekcje z ostrza i przenieś je na 24-dołkową płytkę zawierającą 0,1 M PB (krok 2.5.2). Utrzymuj pędzel w stanie wilgotnym, zwilżając go w 0.1 m PB przed wyjęciem odcinków z ostrza. Uwaga: Sekcje można pozostawić na noc w 0,1 M PB w temperaturze 4 °C.
  9. Po zebraniu skrawków zwizualizuj etykietowanie następcze pod fluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym i wybierz sekcje, które zawierają ROI.
  10. Zamontuj sekcje na zjeżdżalni za pomocą małego pędzla.
    1. Nałóż małą pulę 0,1 M PB na naładowane szkiełko mikroskopowe.
    2. Przenieść wycinek tkanki do puli PB.
    3. Użyj PB i pędzla, aby zorientować i rozprowadzić chusteczkę.
    4. Użyj Kimwiste, aby usunąć nadmiar PB. Uważaj, aby nie odprowadzać wilgoci z sekcji.
    5. Pozostaw do całkowitego wyschnięcia na powietrzu.
    6. Nałóż niewielką kroplę podłoża montażowego na każdą sekcję i zamontuj szkiełko nakrywkowe na górze (22 x 50 mm, nr 1.5).
    7. Uszczelnij krawędzie szkiełka lakierem do paznokci i przechowuj w temperaturze -20 °C do czasu sesji obrazowania. Uwaga: Chociaż zaleca się obrazowanie w ciągu tygodnia od przygotowania, preparaty można utrzymywać w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni przed obrazowaniem.

3. Obrazowanie tkanki

Wszystkie obrazy są uzyskiwane na mikroskopie konfokalnym z wirującym dyskiem (mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem UltraView Vox wyposażony w lasery diodowe (405 nm, 445 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm i 640 nm)). Obrazy można również uzyskać za pomocą dowolnego mikroskopu z możliwością pozyskiwania stosów Z o wysokiej rozdzielczości (np. laserowy skaningowy mikroskop konfokalny, mikroskop epifluorescencyjny, a następnie dekonwolucja itp.). Rozmiar klatki to zwykle 1 000 x 1 000 pikseli.

  1. Znajdź zwrot z inwestycji przy 10-krotnym powiększeniu i uzyskaj obraz. W przypadku obrazowania mikrogleju w układzie retinogenikulacyjnym ROI to najbardziej przyśrodkowe odcinki dLGN.
  2. Przełącz się na większe powiększenie (zwykle używany jest obiektyw Plan Apo 60X, NA = 1,4).
  3. Uzyskaj pierwsze pole widzenia zawierające fagocyty za pomocą kroków z 0,2 μm.
  4. Zdobądź 15-19 dodatkowych pól zawierających fagocyty na zwierzę.

4. Przygotowanie obrazów do kwantyfikacji (ImageJ)

  1. Otwórz z-stack w ImageJ.
  2. Przejdź do menu Obraz, wybierz Kolor i Podziel kanały.
  3. Odejmij tło od kanału (kanałów) zawierającego pochłonięty materiał.
    1. Wybierz okno kanału zawierające pochłonięty materiał (np. wejścia presynaptyczne).
    2. Przejdź do menu Proces i wybierz opcję Odejmij tło. Użyj promienia toczącej się kuli wynoszącego 10 pikseli do następczego śledzenia presynaptycznych danych wejściowych w dLGN. Uwaga: Promień toczącej się kuli jest określany empirycznie. Jednak generalnie powinien być tak duży, jak promień największego obiektu na obrazie, który nie jest częścią tła.
  4. Wygładź kanał zawierający fagocyt.
    1. Wybierz okno kanału zawierające fagocyt (np. mikroglej).
    2. Przejdź do menu Proces i wybierz Filtry, Średnia. Użyj filtra średniej 1,5 (wygładza to obraz w celu renderowania powierzchni w późniejszych krokach).
  5. Odejmij tło od kanału zawierającego fagocyt.
    1. Wybierz okno kanału zawierające fagocyt (np. mikroglej).
    2. Przejdź do menu Proces, wybierz odejmij tło (ustawienia będą musiały zostać określone empirycznie). Użyj promienia toczącej się kuli wynoszącego 50 pikseli dla mikrogleju EGFP-dodatniego.
  6. Scal kanały, przechodząc do menu Obraz i wybierając Kolor, Scal kanały.
  7. Przytnij ROI zawierający fagocyty ze scalonego pliku (przyspiesza to renderowanie powierzchni, patrz krok 5).
    1. Narysuj ramkę wokół ROI za pomocą narzędzia do zaznaczania prostokątnego na pasku narzędzi.
    2. Przejdź do menu Obraz i wybierz Przytnij.
  8. Ponownie podziel kanały (patrz krok 4.2).
  9. Zapisz każdy kanał jako osobny plik TIFF.

5. Przygotuj obraz do kwantyfikacji w Imaris

  1. Otwórz Imaris i upewnij się, że ikona głośności jest wybrana w menu w lewym górnym rogu (Rysunek 2).
  2. Otwórz pierwszy kanał przyciętego obrazu (każdy z kanałów może być otwarty jako pierwszy, po prostu bądź konsekwentny).
  3. Dodaj pozostałe kanały. Przejdź do menu Edycja, wybierz Dodaj kanały i wybierz następny kanał w pliku. (Powtórz ten krok dla pozostałych kanałów). Uwaga: Aby zmienić kolor, przejdź do okna Display Adjustment (Regulacja wyświetlania) i kliknij nazwę kanału (Rysunek 3A). Spowoduje to wyświetlenie okna dialogowego, w którym można dostosować kolor. Jeśli okno Display Adjustment (Dopasowanie wyświetlania) nie jest widoczne, przejdź do menu Edit (Edycja) i wybierz opcję Display Adjustment (Regulacja wyświetlania).
  4. Dostosuj wartości pikseli. Przejdź do menu Edycja i wybierz Właściwości obrazu. W tym oknie dostosuj wartości pikseli x, y i z (wartości te zależą od mikroskopu, obiektywu, kamery i akwizycji kroku z i można je znaleźć w oprogramowaniu używanym do pozyskiwania obrazu).
  5. Krok 5.5 spowoduje powstanie bardzo małego obrazu. Aby zmienić rozmiar, kliknij ikonę Dopasuj w prawym dolnym rogu (Rysunek 2).
  6. W oknie Display Adjustment (Regulacja wyświetlania) dostosuj jasność i kontrast dla każdego kanału za pomocą lewego i środkowego trójkąta.

6. Trójwymiarowe (3D) renderowanie powierzchni fagocytu

  1. Upewnij się, że na górnym pasku narzędzi wybrano tryb Surpass (Rysunek 3C).
  2. W oknie Display Adjustment (Regulacja wyświetlania) odznacz wszystkie kanały z wyjątkiem kanału fagocytów. Spowoduje to usunięcie ich z pola widzenia.
  3. Kliknij ikonę Renderowanie powierzchni (Rysunek 2).
  4. W lewym dolnym rogu zostanie wyświetlone okno tworzenia (Rysunek 4A), upewnij się, że pole wyboru ROI segmentu nie jest zaznaczone w tym pierwszym oknie. Kliknij niebieski przycisk przesyłania dalej na dole.
  5. Dostosuj wygładzanie.
    1. W następnym oknie wybierz kanał fagocytów z menu rozwijanego (Rysunek 4B). Dostosowuje to ilość szczegółów, które zostaną wyeksponowane i powinny być określone empirycznie (wygładzanie 0,1 μm jest zwykle stosowane w przypadku mikrogleju).
    2. Wybierz opcję Bezwzględne określanie progów.
    3. Kliknij niebieski przycisk do przodu na dole.
  6. Próg obrazu.
    1. Kliknij histogram i przeciągnij, aż obraz zostanie odpowiednio wyeksponowany (Rysunek 4C). Jest to określane empirycznie poprzez obracanie obrazu, aby upewnić się, że szare powierzchnie nałożone na obraz fluorescencyjny są dokładnym odwzorowaniem powierzchni. Uwagi: Aby obrócić, wybierz opcję Nawiguj w menu Wskaźnik w prawym górnym rogu ekranu (Rysunek 3B), kliknij i przytrzymaj obraz, aby go obrócić. Aby przywrócić pierwotną orientację obrazu, wybierz opcję Początek w lewym dolnym rogu z menu Widok.
    2. Kliknij niebieski przycisk do przodu na dole.
  7. W następnym oknie dostępna jest opcja odfiltrowania dowolnych powierzchni według rozmiaru itp. O ile obraz nie jest bardzo zaszumiony, nie filtruj i nie usuwaj żadnych filtrów, które pojawiają się automatycznie. Kliknij zieloną strzałkę u dołu, aby zakończyć renderowanie powierzchni fagocytu. Pojawi się nowy zestaw kart (Rysunek 5)
  8. W razie potrzeby usuń wszystkie powierzchnie, które nie są częścią interesującego fagocytu.
    1. Upewnij się, że w menu Wskaźnik jest zaznaczona opcja Wybierz (Rysunek 3B).
    2. Kliknij dowolną powierzchnię, która ma zostać usunięta, aby zmieniła kolor na żółty. Aby usunąć wiele powierzchni, kliknij powierzchnie, przytrzymując wciśnięty przycisk sterowania.
    3. Kliknij przycisk Usuń na karcie Ołówek.
  9. Wybierz i połącz wszystkie powierzchnie fagocytu w jedną powierzchnię.
    1. Kliknij na Lejek (tj. zakładkę Filtr; Rysunek 5C).
    2. Kliknij przycisk Dodaj.
    3. Wybierz dowolny filtr, przeciągnij histogram maksymalnie w lewo (wszystkie powierzchnie powinny być żółte).
    4. Wróć do zakładki Ołówek i kliknij Ujednolicić.
  10. Przejdź do zakładki Wykres (Rysunek 5A) i kliknij Szczegóły i wybierz dowolne parametry do wyświetlenia. Wybierz wolumin (Rysunek 5D). Aby wyświetlić wiele parametrów, przejdź do ikony klucza w lewym dolnym rogu (Rysunek 2) i wybierz parametry do zarejestrowania.
  11. Zapisz objętość fagocytu i zapisz plik przed kontynuowaniem.

7. 3D Renderowanie powierzchni pochłoniętego materiału

  1. Utwórz nowy kanał dla materiału, który został pochłonięty przez fagocyt.
    1. Gdy powierzchnia fagocytów jest wybrana, kliknij zakładkę ołówka.
    2. Kliknij opcję Maskuj wszystko.
    3. W wyświetlonym oknie dialogowym wybierz kanał odpowiadający pochłoniętemu materiałowi (np. następcze śledzenie wejść presynaptycznych; Rysunek 5B).
    4. Sprawdź zduplikowany kanał przed nałożeniem maski i naciśnij OK.
    5. W oknie Display Adjustment pojawi się nowy kanał, który zawiera tylko materiał, który został pochłonięty i znajduje się wewnątrz fagocytu.
  2. Powierzchnia renderuje kanał zawierający całkowicie pochłonięty i niepochłonięty materiał.
    1. Odznacz wszystkie kanały w oknie Regulacja wyświetlania z wyjątkiem kanału, który ma być wyeksponowany, i odznacz powierzchnię utworzoną dla fagocytu.
    2. Kliknij ponownie ikonę renderowania powierzchni (patrz krok 6.3) i utwórz powierzchnię dla kanału, wykonując te same czynności, co dla fagocytu (kroki 6.4-6.11). Uwagi: Upewnij się, że wybrałeś właściwy kanał przed wygładzaniem i progowaniem (krok 6.5; Rysunek 4B). Zanotuj wartość progową (patrz krok 6.6; Rysunek 4C). Wartość tę można również uzyskać po zakończeniu renderowania powierzchni (zakładka Różdżka; Rysunek 5A).
  3. Zapisz objętość całkowitego pochłoniętego i niepochłoniętego materiału i zapisz plik przed kontynuowaniem.
  4. Powierzchnia otynkowania pochłoniętego materiału (materiał w fagocycie).
    1. Wizualizuj fluorescencję tylko nowego kanału pochłoniętej materii (patrz krok 7.2.1).
    2. Wykonaj te same czynności, co powyżej (kroki 7.2-7.3). Uwagi: Upewnij się, że wybrałeś właściwy kanał z menu rozwijanego przed wygładzaniem (wybierz nowy kanał utworzony w kroku 7.1). W oknie progu ręcznie wprowadź wartość progową, która została ustawiona dla renderowania całkowitego materiału pochłoniętego i niepochłoniętego (patrz krok 7.2.2).
  5. Zapisz objętość pochłoniętego materiału i zapisz plik przed kontynuowaniem.

8. Oblicz całkowitą objętość pola widzenia

  1. Utwórz nową powierzchnię dla dowolnego kanału.
  2. W oknie progowania (krok 6.6) przesuń histogram maksymalnie w lewo, tak aby całe pole znalazło się na powierzchni.
  3. Zakończ napawanie całego pola i zapisz objętość (kroki 6.7-6.11).
  4. Zapisz plik.

9. Oblicz ilość materiału poddanego fagocytozowaniu

  1. Oblicz gęstość całkowitego kanału materiału objętego i nieobjętego, korzystając z następującego algorytmu:
    Objętość całkowitego materiału pochłoniętego i niepochłoniętego (krok 7.3) / Objętość pola (krok 8).
  2. Obliczać % pochłonięcia na komórkę przy użyciu następującego algorytmu:
    (Objętość pochłoniętego materiału (krok 7.5) / Całkowita objętość fagocytu (krok 6.11)) x 100
    Uwagi: Aby uwzględnić różnice w wielkości komórki, dane są normalizowane do całkowitej objętości fagocytów. Jeśli liczby z kroku 9.1 są bardzo zmienne między polami, może być konieczne znormalizowanie danych z kroku 9.2 do obliczeń w kroku 9.1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatnio użyliśmy tego testu do wizualizacji i ilościowego określenia pochłaniania presynaptycznego przez mikroglej w rozwijającym się systemie retinogenikulacyjnym za pośrednictwem mikrogleju (Rysunek 1)7. RGC od heterozygotycznych myszy CX3CR1-EGFP śledzono następczo za pomocą CTB-594 i CTB-647 odpowiednio do lewego i prawego oka. W ślad za tym śledzeniem zobrazowano mikroglej EGFP-dodatni w obrębie dLGN. Obrazy te zostały następnie wyrenderowane powierzchniowo w celu pomiarów objętości.

...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby dokładnie zmierzyć fagocytozę, pochłonięty materiał musi być oznaczony w taki sposób, aby badacz mógł go zwizualizować po wystąpieniu degradacji lizosomalnej. Ponadto wymagane jest obrazowanie w wysokiej rozdzielczości, a następnie użycie oprogramowania, które umożliwi badaczowi wizualizację objętości całej komórki i ilościowe określenie jej zawartości. W tym protokole opisujemy wysoce wiarygodną i ilościową metodę pomiaru pochłaniania za pośrednictwem fagocytów przy użyciu CTB sprzężonego z barwnikami Alexa do znako...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca była wspierana przez granty z Fundacji Rodziny Smithów (B.S.), Fundacji Dana (B.S.), Programu Stypendialnego Johna Mercka (B.S.), NINDS (RO1-NS-07100801; B.S.), NRSA (F32-NS-066698; D.P.S.), Nancy Lurie Marks Foundation (D.P.S.), NIH (P30-HD-18655; Rdzeń obrazowania MRDDRC).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Poduszka grzewczaVet Equip, Inc.965500 
Źródło ciepłej wody do poduszki grzewczejKent ScientificTP-700
Mikroskop stereoskopowyDSC Optycznymikroskop chirurgiczny Zeiss Opmi -6
Przystawka
Mikroskop konfokalny z wirującym dyskiemPerkin ElmerUltraView Vox Wirujący dysk konfokalny
10 i mikro; l Gazoszczelne strzykawki HamiltonHamilton80030Użyj innej strzykawki dla każdego koloru barwnika / znacznika
Igły HamiltonHamilton7803-05, specyfikacje:, 1,5 "
Alexa-sprzężona toksyna i podjednostka beta (CTB)Invitrogen488: C22841Rozpuścić w sterylnej soli fizjologicznej, 80 i mikro; l (488), 100 i mikro; l (594), 20 i mikro; l (647)
594: C22842
647: C34778
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami ( PBS)SigmaP4417-50TAB
Neomycyna i siarczany polimyksyny B oraz bacytracyna Cynkowa maść okulistyczna USP (maść antybiotykowa)Bausch & Lomb24208-780-55
Igła 30,5 GBecton Dickinson305106
Nożyczki sprężynoweRobozRS-5630
Aplikator z bawełnianą końcówkąFisher23-400-125
Paraformaldeyde (PFA)Mikroskopia elektronowa Sciences15710Rozcieńczyć 16% do 4% w PBS. Paraformaldehye jest toksyczny, należy go używać w dygestoriach i nosić środki ochrony osobistej.
Narzędzia do preparowania – nożyczki, kleszcze, szpatułka Małenożyczki: Narzędzia do naukiMałe nożyczki: 14370-22
Duże nożyczki: RobozDuże nożyczki: RS-6820
#55 kleszcze: Narzędzia do nauki o dobrej55 Kleszcze: 11255-20
Szpatułka: Ted Pella, Inc.Szpatułka: 13504
SacharozaSigmaS8501-5KGWytwarza 30% sacharozy w PBS (waga/obj.)
Związek OCTVWR25608-930
Łódź do ważeniaUSA Scientific2347-1426
Płytki 24-dołkoweBD Biosciences353047
Fosforan sodu jednozasadowySigmaS6566-500GPrzygotować 0,2 M fosforanu sodu jednozasadowego (PB-A) w ddH2O i 0,2 M dwuzasadowego fosforanu sodu (PB-B) w ddH2O. Aby uzyskać 0,1 M PB, połącz 19 ml PB-A i 81 ml PB-B, napełnij do 200 ml ddH2O
Fosforan sodu dwuzasadowy SigmaS5136-500G
Szkiełka nakrywkowe, 22 X 50 mm, nr 1.5VWR48393 194
Naładowany szkiełko mikroskopoweVWR48311-703
VectasheildVector LaboratoriesH-1200
Przesuwny mikrotom ze stopniem zamrażania Leica SM2010 R Ostrze mikrotomu Leica 14021607100 Fluorescencyjny mikroskop preparacyjny Nikon SMZ800 z epi-fluorescencyjna nauce#

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
  2. Aguzzi, A., et al. Microglia: scapegoat, saboteur, or something else. Science. 339 (6116), 156-161 (2013).
  3. Tremblay, M. E., et al. The role of microglia in the healthy brain. J Neurosci. 31 (45), 16064-16069 (2011).
  4. Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat. Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
  5. Sierra, A., et al. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
  6. Dheen, S. T., et al. Microglial activation and its implications in the brain diseases. Curr Med Chem. 14 (11), 1189-1197 (2007).
  7. Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
  8. Katz, L., Shatz, C. Synaptic activity and the constuction of cortical circuits. Science. 274 (5290), 1133-1138 (1996).
  9. Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).
  10. Hua, J. Y., Smith, S. J. Neural activity and the dynamics of central nervous system development. Nat Neurosci. 7 (4), 327-332 (2004).
  11. Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nat Rev Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).
  12. Butz, M., et al. Activity-dependent structural plasticity. Brain Res Rev. 60 (2), 287-305 (2009).
  13. Bruel-Jungerman, E., et al. Brain plasticity mechanisms and memory: a party of four. Neuroscientist. 13 (5), 492-505 (2007).
  14. Schafer, D. P., Stevens, B. Synapse elimination during development and disease: immune molecules take centre stage. Biochem Soc Trans. 38 (2), 476-481 (2010).
  15. Alexander, A., et al. The complement system: an unexpected role in synaptic pruning during development and disease. Annu Rev Neurosci. 35, 369-389 (2012).
  16. Brown, A., Weaver, L. C. The dark side of neuroplasticity. Exp Neurol. 235 (1), 133-141 (2012).
  17. Navarro, X. Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration. Int Rev Neurobiol. 87, 483-505 (2009).
  18. Tan, A. M., Waxman, S. G. Spinal cord injury, dendritic spine remodeling, and spinal memory mechanisms. Exp Neurol. 235 (1), 142-151 (2012).
  19. Wolpaw, J. R., Tennissen, A. M. Activity-dependent spinal cord plasticity in health and disease. Annu Rev Neurosci. 24, 807-843 (2001).
  20. Schafer, D. P., et al. The "quad-partite" synapse: Microglia-synapse interactions in the developing and mature CNS. Glia. 61 (1), 24-36 (2013).
  21. Mukhopadhyay, S., et al. Manganese-induced trafficking and turnover of the cis-Golgi glycoprotein GPP130. Mol Biol Cell. 21 (7), 1282-1292 (2010).
  22. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20, 4106-4114 (2000).
  23. Knobloch, M., Mansuy, I. M. Dendritic spine loss and synaptic alterations in Alzheimer's disease. Mol Neurobiol. 37 (1), 73-82 (2008).
  24. Masliah, E., et al. Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 9 (3 Suppl), 91-99 (2006).
  25. Yoshiyama, Y., et al. Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model. Neuron. 53 (3), 337-351 (1016).
  26. Milnerwood, A. J., Raymond, L. A. Early synaptic pathophysiology in neurodegeneration: insights from Huntington's disease. Trends Neurosci. 33 (11), 513-523 (2010).
  27. Noda, M., Suzumura, A. Sweepers in the CNS: Microglial Migration and Phagocytosis in the Alzheimer Disease Pathogenesis. Int J Alzheimers Dis. , (2012).
  28. Rotshenker, S. Microglia and macrophage activation and the regulation of complement-receptor-3 (CR3/MAC-1)-mediated myelin phagocytosis in injury and disease. J Mol Neurosci. 21 (1), 65-72 (2003).
  29. Smith, M. E. Phagocytosis of myelin in demyelinative disease: a review. Neurochem Res. 24 (2), 261-268 (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Fagocytoza mikroglejumikroskopia konfokalnaledzenie w kierunku przednimbeta toksyna cholerowakom rki zwojowe siatk wkipruning synaptycznysekcjonowanie m zguznakowanie fluorescencyjne

Powiązane artykuły