Artykuł metodologiczny

Kompletny protokół uszkodzenia rdzenia kręgowego i rozwarstwienia mózgu w celu późniejszej hybrydyzacji in situ u larw minoga morskiego

DOI:

10.3791/51494

⸱

14 października 2014

 ,  ,  , 
1Centre for Neuroregeneration, School of Biomedical Sciences, University of Edinburgh, 2Shriners Hospitals Pediatric Research Center (Center for Neural Repair and Rehabilitation), Temple University School of Medicine, 3Department of Neurology, Temple University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Minogi odzyskują lokomocję po całkowitym urazie rdzenia kręgowego. Jednak niektóre neurony projekcji rdzeniowej są dobrymi regeneratorami, a inne nie. W artykule przedstawiono techniki przetrzymywania larw minoga morskiego (i niedawno przekształconych osobników dorosłych), wytwarzania kompletnych przekrojów rdzenia kręgowego oraz przygotowania całych mózgów i rdzeni kręgowych do hybrydyzacji in situ.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po całkowitym uszkodzeniu rdzenia kręgowego, minogi morskie na początku są sparaliżowane poniżej poziomu przecięcia. Jednak po kilku tygodniach odzyskują lokomocję, a towarzyszy temu regeneracja na krótkim dystansie (kilka mm) aksonów propriordzeniowych i aksonów wystających rdzeniowo z pnia mózgu. Spośród 36 dużych, możliwych do zidentyfikowania neuronów wystających z rdzenia kręgowego, niektóre są dobrymi regeneratorami, a inne złymi. Neurony te najłatwiej można zidentyfikować w preparatach OUN w całości. Aby zrozumieć wewnętrzne mechanizmy neuronów, które sprzyjają lub hamują regenerację aksonów po urazie w OUN kręgowców, określamy różnice w ekspresji genów między dobrymi i złymi regeneratorami oraz jak na ekspresję wpływa transsekcja rdzenia kręgowego. W artykule przedstawiono techniki przetrzymywania larw i niedawno przekształconych dorosłych minogów morskich w zbiornikach słodkowodnych, wytwarzania kompletnych przekrojów rdzenia kręgowego pod mikroskopem oraz przygotowania całych komórek mózgu i rdzenia kręgowego do hybrydyzacji in situ. Krótko mówiąc, zwierzęta są trzymane w temperaturze 16 °C i znieczulane 1% benzokainą u minoga Ringera. Rdzeń kręgowy jest przecięty nożyczkami do irydektomii przez dostęp grzbietowy, a zwierzę może dojść do siebie w zbiornikach ze słodką wodą w temperaturze 23 °C. W przypadku hybrydyzacji in situ zwierzęta są ponownie znieczulane, a mózg i rdzeń usuwany za pomocą dostępu grzbietowego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

U ssaków uraz rdzenia kręgowego (SCI) jest wyniszczającym stanem, który prowadzi do trwałej utraty funkcji poniżej miejsca urazu, ponieważ uszkodzone aksony nie regenerują się przez strefę urazu i nie łączą się ponownie z odpowiednimi celami. W przeciwieństwie do ssaków, minogi odzyskują lokomocję po całkowitym urazie rdzenia kręgowego. 1 Co ciekawe, minogi mają zestaw 36 neuronów wystających z rdzenia kręgowego, które są indywidualnie identyfikowalne w preparatach mózgowych z całego montażu ze względu na ich duży rozmiar2,3 (ryc. 1). Wszystkie te neurony wystające z rdzenia kręgowego są aksotomizowane przez pełną transsekcję rdzenia kręgowego na wysokim poziomie. Wcześniejsze badania naszej grupy i innych wykazały, że nawet w przypadku funkcjonalnego powrotu do zdrowia po SCI niektóre z tych neuronów wykazują bardzo niską zdolność regeneracyjną (są uważane za "złe regeneratory"), podczas gdy inne zwykle regenerują swój akson przez miejsce urazu (są uważane za "dobre regeneratory"). Ta cecha sprawia, że minogi są interesującym modelem kręgowców do badania różnic w ekspresji genów między dobrymi i złymi neuronami regeneratorowymi projekcji rdzeniowych, co z kolei doprowadzi do różnic w wewnętrznej zdolności regeneracyjnej neuronów, które próbują zregenerować swoje aksony w tym samym środowisku zewnętrznym. 1

Korzystając z tego modelu, wcześniej wykazaliśmy, że neurony rzutujące rdzeniowo o niskiej zdolności regeneracyjnej wykazują ekspresję receptorów cząsteczki przewodnictwa aksonalnego, takich jak UNC54,5 i neogenina,6, które pośredniczą w hamującym działaniu odpowiednio netryny i RGM. Ponadto, stosując tę metodę, nasza grupa wykazała również, że tylko dobre regeneratory wykazują odzyskanie ekspresji neurofilamentów po urazie i w trakcie procesu regeneracji. Ostatnio Busch i Morgan7 wykazali za pomocą immunofluorescencji, że złe regeneratory wykazują zwiększoną ekspresję synukleiny po urazie, co zostało powiązane przez autorów z faktem, że neurony wystające rdzeniowo "złego regeneratora" powoli umierają po całkowitym przecięciu rdzenia kręgowego5,7,8. Tak więc model minoga całkowitego uszkodzenia rdzenia kręgowego okazał się bardzo użytecznym modelem do zrozumienia, co sprawia, że neuron wystający z rdzenia kręgowego jest "złym regeneratorem" po aksotomii.

Aby przeprowadzić nasze badania, przeprowadzamy kompletny protokół operacji przecięcia rdzenia kręgowego i tylnej sekcji mózgu w pożądanych punktach czasowych po urazie, aby przeprowadzić pełną hybrydyzację in situ. W niniejszym artykule metodologicznym przedstawiono szczegółowy protokół prawidłowego przeprowadzenia pełnej operacji uszkodzenia rdzenia kręgowego u larw minogów, późniejszej konserwacji zwierząt oraz ostatecznej sekcji mózgu i przygotowania mózgu do całkowitej hybrydyzacji in situ. Wcześniej opisano szczegółowy protokół przeprowadzania pełnej hybrydyzacji in situ w mózgu larw minogów. 9 Ponadto ten protokół dotyczący uszkodzenia rdzenia kręgowego i sekcji mózgu może być również wykorzystany do przetworzenia mózgu do celów immunohistochemicznych lub innych metod histologicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zobacz Tabelę 1 dla wszystkich materiałów użytych w tym protokole.

Eksperymenty zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Temple.

1. Zwierzęta

  1. Pozyskać larwy minoga morskiego typu dzikiego (Petromyzon marinus L.), o długości 10 – 14 cm (4 – 7 lat) ze strumieni zasilających jezioro Michigan, z dopływów rzeki Delaware (Pensylwania) lub strumieni w stanie Maine.
  2. W laboratorium utrzymuj larwy w grupach po 50 - 100 zwierząt w zbiornikach słodkowodnych o pojemności 50 galonów w temperaturze 16 °C. Wyłóż zbiorniki calem żwiru, w którym larwy mogą się zakopać, a woda jest filtrowana węglem drzewnym i kondycjonowana kamieniami napowietrzającymi przez co najmniej 48 godzin w celu usunięcia chloru i innych zanieczyszczeń przed umieszczeniem w nich minogów. Nie ma potrzeby karmienia zwierząt, które poddają recyklingowi własne odpady, aż do dnia użycia.

2. Całkowite przecięcie rdzenia kręgowego

  1. Przed operacją rdzenia kręgowego należy przygotować roztwór Ringera dla minoga o następującym składzie: 110 mM NaCl, 2,1 mM KCl, 2,6 mM CaCl2, 1,8 mM MgCl2 i 10 mM bufor Tris; pH 7,4.
  2. Aby przeprowadzić przecięcie rdzenia kręgowego, umieść larwy w małym pojemniku, który ma być znieczulony 1% metanosulfonianem trikainy w lodowatym roztworze Ringera.
  3. Po znieczuleniu umieść zwierzęta na szalce Petriego wypełnionej do połowy Sylgardem (silikonem) i użyj 4 szpilek do owadów (średnica 0,15 mm), aby utrzymać zwierzęta w pozycji do operacji (jedna jest umieszczona na pysku zwierzęcia, jedna na ogonie i dwie na poziomie 5 skrzeli). Napełnij szalkę Petriego prawie do samej góry roztworem Ringera. Umieść naczynie z larwą na lodzie podczas wykonywania operacji pod mikroskopem stereoskopowym.
  4. Aby wykonać przecięcie rdzenia kręgowego w linii grzbietowej, środkowej, wykonaj podłużne nacięcie skalpelem (#11) na poziomie 5 skrzeli, aby uwidocznić rdzeń kręgowy. Początkowo skóra jest otwierana poprzez włożenie końcówki ostrza skalpela skierowaną do góry, a następnie tkanka mięśniowa jest bardzo delikatnie cięta, aż rdzeń kręgowy będzie widoczny z góry. Ułóż dwa haczyki ze szpilek owadów i użyj ich do przytrzymania ścian ciała w pozycji otwartej podczas wykonywania przecięcia rdzenia kręgowego.
  5. Całkowicie przeciąć rdzeń kręgowy na poziomie 5 skrzeli za pomocą nożyczek (Castroviejo #8), włóż nożyczki prostopadle do rdzenia kręgowego. Rdzeń kręgowy musi być całkowicie przecięty jednym czystym cięciem. Wizualizuj przecięte końce rdzenia kręgowego pod mikroskopem stereoskopowym, aby potwierdzić, że rdzeń kręgowy został całkowicie przecięty. Następnie wyrównaj odcięte końce rdzenia kręgowego po przecięciu za pomocą pary kleszczy (#4).
  6. Po wykonaniu przecięcia rdzenia kręgowego zamknij ranę w ścianie grzbietowej trzonu parą cienkich kleszczy i umieść larwy na lodzie na 1 godzinę, aby rana wyschła. Umieść kawałek bibuły filtracyjnej między lodem a larwami i namocz go roztworem Ringera minoga. Niska temperatura utrzymuje zwierzęta przy życiu, a jednocześnie pozwala na wyschnięcie rany na powietrzu, a tym samym pomaga zapobiegać infekcjom.
  7. Następnie przenieś larwy do małych zbiorników (1 larwa na zbiornik) z lodowatą wodą przez 24 godziny.
  8. Zbadaj uszkodzone larwy 1 dzień po przecięciu kręgosłupa, aby behawioralnie potwierdzić, że nie ma ruchu ogonowego do miejsca urazu. Przecięcie rdzenia kręgowego uważa się za zakończone, jeśli larwa może poruszać tylko głową rostralnie do miejsca urazu (na poziomie5 skrzeli). W takim przypadku larwy można teraz przenieść do zbiorników (1 larwa na zbiornik) ze słodką wodą o temperaturze pokojowej (23 °C), aby umożliwić im regenerację w wybranych punktach czasowych.
  9. W okresie rekonwalescencji zmieniaj wodę co 2 do 3 dni.

3. Preparacja mózgu i przygotowanie mózgu do hybrydyzacji in situ

  1. W pożądanych punktach czasowych po urazie należy ponownie znieczulić larwy minogów morskich i umieścić je i przypiąć do szalki Petriego roztworem Ringera, aby przeprowadzić sekcję mózgu, jak powyżej.
  2. Aby wypreparować mózg, najpierw wykonaj poprzeczne nacięcie skalpelem między nozdrzem a szyszynką. Stąd zacznij przecinać tkankę otaczającą mózg za pomocą nożyczek Castroviejo, trzymając ją kleszczami.
  3. Po odsłonięciu mózgu usuń splot naczyniówkowy za pomocą kleszczy i użyj haczyków, aby rozłożyć głowę zwierzęcia i odsłonić nerwy czaszkowe. Następnie przetnij rdzeń kręgowy poprzecznie nożyczkami Castroviejo. Przytrzymaj rdzeń kręgowy parą kleszczy, używając innej pary kleszczy do przecięcia nerwów czaszkowych w celu wypreparowania mózgu.
  4. Po sekcji umieść mózg na małym kawałku silikonu i przytrzymaj go na miejscu, wkładając 2 szpilki do owadów w opuszkach węchowych i 1 w rdzeń kręgowy. Następnie przetnij nożyczkami spoidła tylne i mózgowo-odbytnicze mózgu wzdłuż grzbietowej linii środkowej i odchyl płytki alar na boki i przypnij je płasko do silikonu za pomocą 4 szpilek na owady (ryc. 2).
  5. Przenieś kawałek silikonu z mózgiem do probówki zawierającej 4% paraformaldehydu w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (pH 7,4), aby utrwalić w temperaturze pokojowej przez 3 godziny na rotatorze.
  6. Po fiksacji użyj mózgu do pełnej hybrydyzacji in situ, jak opisano wcześniej (Swain i wsp., 1994). Mózgi zwierząt kontrolnych lub pozorowanych powinny być uruchamiane zawsze równolegle z mózgami zwierząt rannych. Cały mózg larwalny może być badany przez hybrydyzację in situ ze względu na jego płaski i cienki kształt, a także ze względu na brak mieliny10, co sprawia, że mózg jest dość przezroczysty.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jako przykład wyników, które można uzyskać przy użyciu tej metody, na rysunku 2 pokazane są reprezentatywne obrazy całych mózgów pokazujące ekspresję transkryptów neogeniny w identyfikowalnych neuronach kontrolnych wystających z rdzenia kręgowego i 2 tygodnie po uszkodzeniu larwalnego minoga morskiego. Czytelnicy są odsyłani do poprzedniego badania6 opisującego związek między ekspresją neogeniny po całkowitym przecięciu rdzenia kręgowego a zdolnością regeneracyjną możliwych do zidentyfikowania...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół wykonania pełnej transkrypcji rdzenia kręgowego i tylnej sekcji mózgu u larw minogów morskich. Procedura ta pozwala na analizę różnic w ekspresji genów między możliwymi do zidentyfikowania neuronami wystającymi z rdzenia kręgowego po urazie rdzenia kręgowego za pomocą hybrydyzacji in situ całego mózgu. Krytycznym krokiem w procedurze jest prawidłowe wykonanie pełnego przecięcia rdzenia kręgowego, które można kontrolować, obserwując odcięte końce rdzenia kręgowego pod stereomikrosk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wspierane przez NIH Grants NS14837, R01 NS38537, R24 HD050838 dla Dr. Michaela E. Selzera; Grant badawczy Shriners SHC-85220 dla dr Michaela E. Selzera; oraz Shriners Research Grant SHC-85310 dla dr Michaela I. Shifmana. Dr Antón Barreiro-Iglesias był wspierany przez Fundación Barrié (Hiszpania) i Xunta de Galicia (Galicja, Hiszpania).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sulfonian metanu trikainyWidmoTR108Nasycony benzokainą roztwór w PBS na ofiarę
Skalpel #3Narzędzia do nauki o sztuce (FST)10003-12
Ostrza do skalpela: #11Narzędzia do nauki pięknej 10011-00
Nożyczki Castroviejo #8Narzędzia do nauki pięknej 15002-08
Kleszcze #4 & #5Dumont, SzwajcariaRoboz RS4955#4 do rozwarstwienia rdzenia kręgowego; #5 do zdejmowania izolacji
z mikroskopu preparacyjnegoOlympusSZ51
SylgardDow Corning Co.184
Szpilki do owadów 0,15, 0,20 mmAusterlitzBrak katalogu #0,15 mm do przypinania mózgu i rdzenia kręgowego; 0,20 mm do ciała
7 ml Probówki scyntylacyjne HDPE z nasadkamiFisher Scientific03-337-1
Paraformaldehyd 16%Mikroskopia elektronowa Science (EMS)19210Rozcieńczyć do 4% w PBS

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rodicio, M. C., Barreiro-Iglesias, A. Lampreys as an animal model in regeneration studies after spinal cord injury. Rev Neurol. 55, 157-166 (2012).
  2. Davis, G. R. Jr, McClellan, A. D. Extent and time course of restoration of descending brainstem projections in spinalcord-transected lamprey. J Comp Neurol. 344, 65-82 (1994).
  3. Jacobs, A. J., Swain, G. P., Snedeker, J. A., Pijak, D. S., Gladstone, L. J., Selzer, M. E. Recovery of neurofilament expression selectively in regenerating reticulospinal neurons. J Neurosci. 17, 5206-5220 (1997).
  4. Shifman, M. I., Selzer, M. E. Expression of the netrin receptor UNC-5 in lamprey brain modulation by spinal cord transection. Neurorehabil Neural Repair. 14, 49-58 (2000).
  5. Barreiro-Iglesias, A., Laramore, C., Shifman, M. I. The sea lamprey UNC5 receptors cDNA cloning, phylogenetic analysis and expression in reticulospinal neurons at larval and adult stages of development. J Comp Neurol. 520, 4141-4156 (2012).
  6. Shifman, M. I., Yumu, lR. E., Laramore, C., Selzer, M. E. Expression of the repulsive guidance molecule RGM and its receptor neogenin after spinal cord injury in sea lamprey. Exp Neurol. 217, 242-251 (2009).
  7. Busch, D. J., Morgan, J. R. Synuclein accumulation is associated with cell-specific neuronal death after spinal cord injury. J Comp Neurol. 520, 1751-1771 (2012).
  8. Shifman, M. I., Zhang, G., Selzer, M. E. Delayed death of identified reticulospinal neurons after spinal cord injury in lampreys. J Comp Neurol. 510, 269-282 (2008).
  9. Swain, G. P., Jacobs, A. J., Frei, E., Selzer, M. E. A method for in situ hybridization in wholemounted lamprey brain neurofilament expression in larvae and adults. Exp. Neurol. 126, 256-269 (1994).
  10. Bullock, T. H., Moore, J. K., Fields, R. D. Evolution of myelin sheaths: both lamprey and hagfish lack myelin. Neurosci Lett. 48, 145-148 (1984).
  11. Cohen, A. H., Kiemel, T., Pate, V., Blinder, J., Guan, L. Temperature can alter the function outcome of spinal cord regeneration in larval lampreys. Neuroscience. 90, 957-965 (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przeci cie rdzenia kr gowegolarwy minoga morskiegobadanie regeneracji akson wekspresja receptora neogentechnika z u yciem no yczek do irydektomiimonta na silikonowym ko kuutrwalanie paraformaldehydempodej cie przez lini rodkow grzbietow

Powiązane artykuły