Analiza ruchu naupliusa 'Artemia salina' za pomocą optycznego śledzenia nanocząstek plazmonicznych

Podsumowanie

Używamy optycznego śledzenia plazmonicznych nanocząstek do badania i charakteryzowania częstotliwości ruchów organizmów wodnych.

Streszczenie

Pokazujemy, jak pęseta optyczna może być czułym narzędziem do analizy drgań płynów generowanych przez ruch małych organizmów wodnych. Pojedyncza nanocząstka złota trzymana przez pęsetę optyczną jest używana jako czujnik do ilościowego określania rytmicznego ruchu larwy Nauplius (Artemia salina) w próbce wody. Osiąga się to poprzez monitorowanie zależnego od czasu przemieszczenia uwięzionej nanocząstki w wyniku aktywności Naupliusa. Analiza Fouriera położenia nanocząstki daje następnie widmo częstotliwości, które jest charakterystyczne dla ruchu obserwowanych gatunków. Eksperyment ten demonstruje zdolność tej metody do pomiaru i charakteryzowania aktywności małych larw wodnych bez konieczności ich bezpośredniej obserwacji i uzyskiwania informacji o położeniu larw w stosunku do uwięzionej cząstki. Ogólnie rzecz biorąc, podejście to może dać wgląd w żywotność niektórych gatunków występujących w ekosystemie wodnym i może rozszerzyć zakres konwencjonalnych metod analizy próbek wody.

Wprowadzenie

Ocena jakości wody na podstawie wskaźników chemicznych i biologicznych ma fundamentalne znaczenie dla uzyskania wglądu w stan i warunki środowiskowe ekosystemu wodnego^1-3. Klasyczne metody analizy chemicznej wody opierają się na właściwościach organoleptycznych lub określeniu parametrów fizykochemicznych. Z drugiej strony wskaźniki biologiczne to gatunki zwierząt, których obecność i żywotność zapewniają wgląd w warunki środowiskowe i wpływ zanieczyszczeń na ekosystem, w którym występują. Typowymi przykładami bioindykatorów są widłonogi, grupa małych skorupiaków wodnych, które można znaleźć w prawie każdym siedlisku wodnym^4,5. Obserwacja aktywności i żywotności tych gatunków na podstawie próbki wody może być zatem wykorzystana do uzyskania informacji na temat ogólnych warunków ekosystemu⁵. Larwy widłonogówów, które nazywane są Naupliami, używają rytmicznych ruchów czułków (każda larwa ma trzy pary wyrostków w okolicy głowy) do pływania w wodzie⁶. Częstotliwość i intensywność tych uderzeń jest zatem bezpośrednim wskaźnikiem wieku, sprawności i warunków środowiskowych zwierzęcia^7-10. Wszelkie badania na tych próbkach są zwykle wykonywane za pomocą mikroskopu, obserwując i licząc bezpośrednio uderzenia anteny Nauplii. Ze względu na ich rozmiar (~100-500 μm)¹¹, często wymaga to wykonywania pomiarów jeden po drugim lub przymocowania pojedynczego Naupliusa do podłoża.

Tutaj demonstrujemy nowe podejście do obserwacji aktywności larw widłonogów w próbkach wody, używając optycznie uwięzionej nanocząsteczki złota jako ultraczułego detektora. Pęseta optyczna jest zwykle używana przez wiele grup jako doskonałe narzędzie eksperymentalne do przykładania lub mierzenia sił między cząsteczkami do zakresu pikonewtonów^12-14. Ostatnio zakres zastosowań pęsety optycznej został rozszerzony o obserwację drgań akustycznych i wahań rozpuszczalnika w płynnych mediach poprzez monitorowanie ruchu nano- i mikrocząstek, które są zamknięte w pułapce optycznej¹⁵. Cząstki zanurzone w cieczy poddawane są ruchom Browna. Jednak wewnątrz pułapki optycznej ruch ten jest częściowo tłumiony przez silną, indukowaną laserem siłę gradientu. W związku z tym sztywność pułapki optycznej i lokalizacja cząstki w ognisku wiązki laserowej mogą być dostrojone przez moc lasera. Jednocześnie możliwe jest ujawnienie charakterystyki potencjału pułapkowania i analiza oddziaływań cząsteczek z cząstką poprzez monitorowanie zależnego od czasu ruchu cząstek w pułapce. Takie podejście umożliwia wychwycenie częstotliwości, intensywności i kierunku ruchu płynu, który jest generowany przez poruszający się obiekt w jego ciekłym środowisku. Pokazujemy, w jaki sposób ta ogólna idea może być zastosowana do uzyskania widma częstotliwości ruchu pojedynczego Naupliusa bez konieczności bezpośredniej ingerencji w próbkę. To eksperymentalne podejście wprowadza nową ogólną koncepcję obserwacji ruchliwego zachowania okazów wodnych w bardzo czuły sposób. W przypadku obserwacji gatunków bioindykatorowych mogłoby to rozszerzyć obecną metodologię analizy wody i mogłoby zostać zastosowane w celu uzyskania informacji na temat zdrowia i integralności ekosystemów wodnych.

Protokół

1. Układ eksperymentalny

1. Do oświetlenia w ciemnym polu należy użyć mikroskopu biologicznego z kondensorem olejowym do ciemnego pola o aperturze numerycznej (NA) = 1,2. Do obserwacji i pułapkowania cząsteczek należy użyć obiektywu imersyjnego wodnego o powiększeniu 100X i NA = 1,0. Do śledzenia ruchu naupliusa należy użyć obiektywu suchego o powiększeniu 10X i NA = 0,2.
2. Należy wykorzystać układ pęsety optycznej z laserem fali ciągłej o długości 1 064 nm sprzężonym z mikroskopem biologicznym. Moc lasera pułapki optycznej należy ustawić na 100 mW (pomiar wykonany miernikiem mocy za obiektywem).
3. Do detekcji i obrazowania ruchu cząsteczki złota w pułapce optycznej oraz ruchu naupliusa należy użyć szybkiej kamery CMOS lub cyfrowej lustrzanki z wymienną optyką (DSLR).
4. Należy zastosować filtr notch, aby zapobiec dostawaniu się wiązki lasera do kamery.
5. Do pomiaru mocy lasera za obiektywem należy użyć miernika mocy.

2. Przygotowanie próbek

1. Nanieś pipetą kroplę wody (180 µl) na szkiełko przedmiotowe i umieść próbkę w mikroskopie w ciemnym polu.
2. Przenieś pipetą naupliusa z małego zbiornika z wodą do kropli wody.
3. Użyj obiektywu powietrznego 10X, aby obserwować ruch naupliusa w roztworze i nagraj strumień wideo.
4. W celu obserwacji ruchu płynu generowanego przez naupliusa wykorzystaj nanocząsteczkę złota o średnicy 60 nm jako detektor. W tym celu dodaj 5 µl silnie rozcieńczonego roztworu cząsteczek do kropli wody, tak aby w polu widzenia obiektywu imersyjnego 100X widoczna była w przybliżeniu jedna cząsteczka.

3. Eksperyment śledzenia cząstek

1. Uchwyć jedną nanocząsteczkę złota za pomocą pęsety optycznej. W tym celu przesuń stolik mikroskopu, aby zbliżyć laser pułapkujący o długości fali 1 064 nm do nanocząsteczki złota dyfundującej w roztworze. Przyciągające siły optyczne wciągną nanocząsteczkę złota w punkt ogniskowania wiązki lasera. Uwięziona cząstka przestaje dyfundować i utrzymuje swoją pozycję. Nagraj strumień wideo uwięzionej nanocząsteczki za pomocą kamery DSLR z częstotliwością klatek 50 Hz przez 30 s.
2. Wyłącz laser pęsety optycznej i zwolnij nanocząsteczkę złota z pułapki.
3. Użyj programu do śledzenia cząstek, aby odczytać pozycję optycznie uwięzionej cząstki złota w każdej klatce strumienia wideo. Szybka transformata Fouriera (FFT) pozycji x-y cząstki w czasie ujawnia widmo częstotliwości.
   UWAGA: W tym przypadku do analizy pozycji centrum cząstki w płaszczyźnie x-y w czasie oraz do analizy FFT wykorzystano własny kod programu komputerowego „IGOR PRO”.
4. Jako alternatywę dla własnego kodu IGOR można użyć bezpłatnego programu „Video Spot Tracker” do śledzenia cząstki w wideo. Użyj komercyjnego oprogramowania „Origin”, aby wykonać transformatę Fouriera danych z procesu śledzenia:
   1. Przeciągnij plik wideo do otwartego programu „Video Spot Tracker”.
   2. Kliknij myszką cząstkę widoczną na pierwszym obrazie strumienia wideo; pojawi się okrągły obszar zainteresowania (ROI).
   3. W górnym oknie poleceń wybierz opcje „symmetric” oraz „optimize”, aby zoptymalizować śledzenie cząstki.
   4. Kliknij myszką „logging” w górnym oknie poleceń i wybierz folder do zapisania danych. Dane ze śledzenia zostaną zapisane w formie arkusza danych.
   5. Kliknij myszką „play video” w lewym oknie poleceń programu do śledzenia i poczekaj, aż wszystkie klatki wideo zostaną przeanalizowane.
   6. Zamknij program i otwórz zapisany arkusz danych w programie „Origin”. Ustaw wartości kolumn jako „y₁” i „y₂”.
   7. W arkuszu danych „Origin” ustaw kroki czasowe dla każdej klatki wideo jako „x”.
   8. Zaznacz kolumnę x-position i wykonaj FFT, wybierając „Data Analysis”, a następnie „FFT” w górnym oknie poleceń. Powtórz ten krok dla kolumny y-position.
   9. Wykreśl amplitudy obliczonego sygnału FFT w kierunku x i y w funkcji częstotliwości.

4. Symulacja numeryczna

1. Oblicz polaryzowalność α cząstki złota o rozmiarze 60 nm, korzystając z programu komputerowego „Mathematica”.
   1. Użyj równania (1), aby obliczyć polaryzowalność zgodnie z metodą Kuwata et al.¹⁶:
      (1)
   2. Zdefiniuj w kodzie programu następujące trzy parametry: zależną od długości fali zespoloną funkcję dielektryczną cząstki złota, promień nanocząstki oraz współczynnik załamania światła otaczającego ośrodka.
2. Wykorzystaj opis rozkładu pola elektrycznego skupionej wiązki Gaussa według Agayan et al.¹⁷, aby obliczyć siły optyczne działające na cząstkę złota o rozmiarze 60 nm:
   (2)
   1. Użyj równań (3)-(6) z pracy Agayan et al.¹⁷, aby obliczyć zarówno siły gradientowe, jak i siły rozproszone działające na cząstkę:
      (3)
      (4)
      (5)
      (6)
   2. W kodzie programu zdefiniuj parametry mocy lasera, apertury numerycznej obiektywu oraz zespolonej polaryzowalności nanocząstki.
   3. Zsumuj siłę gradientową i siłę rozproszoną, aby obliczyć całkowitą siłę optyczną działającą na cząstkę złota w pułapce optycznej.
3. Uruchom symulację, naciskając jednocześnie klawisze „Control” i „Enter”.

Wyniki

Schematyczny rysunek układu doświadczalnego przedstawiono na Rysunku 1A. Do optycznego wykrywania przemieszczenia 60 nm złotej cząsteczki w pułapce optycznej niezbędna jest konfiguracja ciemnego pola¹⁵. Długość fali lasera pułapkującego wynosząca 1 064 nm została wybrana w celu zapewnienia stabilnego uwięzienia złotej cząsteczki detektora^12,14. W mikroskopie zastosowano dzielnik wiązki do ogniskowania wiązki pułapkującej przez obiektyw, a filtr zaporowy zapobiega przedostawaniu się ...

Dyskusja

Mikroskopia ciemnego pola jest potężnym narzędziem do wizualizacji nanocząstek złota o wymiarach poniżej granicy dyfrakcji optycznej, ponieważ przekrój czynny rozpraszania nanocząstek metalu przekracza ich przekrój geometryczny (por. rysunek 2A)¹⁸. W konfiguracji pęsety takie podejście pozwala nawet rozróżnić, czy tylko jedna lub wiele nanocząstek złota jest uwięzionych przez wiązkę laserową, ponieważ plazmoniczne sprzężenie między cząstkami powoduje przesunięcie ku czerwieni częstotliwości re...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mikroskop Zeiss Axio Scope.A1	Carl Zeiss	490035-0012-000	oświetlenie ciemnego pola
Cel wodny Achroplan	Carl Zeiss	440087	powiększenie 100x, NA = 1,0
Obiektyw powietrzny Epiplan	Carl Zeiss	442934	powiększenie 10X, NA = 0,2
Skraplacz oleju w ciemnym polu	Carl Zeiss	445323	NA = 1,2
Cobolt Rumba CW 1,064 nm DPSSL	Cobolt	1064-05-01-2000-500	1,064 nm, CW, λ = 1,064 nm, 2 Watt, TEM00
Ekspander wiązki	Edmund Optics		Nr części 1064 2-8X 64414
Szybka kamera Dimax HD	PCO. Niemcy
Aparat kolorowy Canon EOS 500 D	Canon		FAQ-ID: 8201395700
Filtr wycinający StopLine 532/1064	Semrock	A11149-711265	Nr kat. NF01-532U
Woda
Nauplius Artemia salina
Złoty koloid	BBInternational	Batch 13741	Średnica 60 nm
MQMie Wersja 3.2	Dr. Michael Quinten
Mathematica 8.0	Wolfram
Comsol Multiphysics 4.0	COMSOL, Inc.