W manuskrypcie opisano kroki wymagane do przeprowadzenia heterotopowego przeszczepu serca u myszy.
Artykuł metodologiczny
Mysia heterotopowa technika przeszczepu serca
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Minęło już ponad czterdzieści lat od czasu, gdy ta technika została po raz pierwszy opisana przez Corry'ego, Wynna i Russella. Chociaż zajęło kilka lat, aby inne laboratoria stały się biegłe w tej technice i wykorzystywały ją, obecnie jest ona szeroko stosowana przez wiele laboratoriów na całym świecie. Znaczące udoskonalenie oryginalnej techniki zostało opracowane i zgłoszone w 2001 roku przez Niimi. Opisane są tutaj techniki, które ewoluowały przez ponad dekadę w rękach trzech chirurgów (Plenter, Grazia,) w naszym centrum. Techniki te są obecnie przekazywane młodszemu pokoleniu chirurgów i badaczy.
Opierając się głównie na doświadczeniach z Niimi, stosowane procedury ewoluowały w najdrobniejszych szczegółach - szczegółach, które postaramy się tutaj opisać w taki sposób, aby inni mogli korzystać z tego bardzo użytecznego modelu. Podobnie jak Niimi, odkryliśmy, że pomoc wideo do nauki jest bezcennym źródłem informacji dla początkujących.
Wprowadzenie
W erze, w której możliwe jest przeprowadzanie przeszczepów nerek, płuc, wątroby i trzustki u myszy, kamieniem węgielnym podstawowych badań nad przeszczepami narządów i immunologią od 1973 roku1-4 pozostaje heterotopowy model przeszczepu serca u myszy. W międzyczasie opublikowano kilka artykułów szczegółowo opisujących ulepszenia/udoskonalenia5,6 tej procedury.
Jako model przeszczepu narządów stałych, głównie unaczyniony, procedura ta nie ma sobie równych. Po opanowaniu procedura ta nadaje się do badań nad allogenicznymi reakcjami odrzucenia7, rozwojem przewlekłych waskulopatii8 i mechanizmami uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego9.
Kluczem do pomyślnego nauczenia się tej procedury są, tak jak w przypadku każdej innej operacji, cierpliwość ze strony instruktora i uczestnika oraz dbałość o szczegóły. Na początku procesu nowy chirurg przekona się, że będzie spędzał wiele godzin nad każdym przeszczepem. W miarę zdobywania doświadczenia czas operacji, a tym samym niedokrwienie, drastycznie się skróci. Zwracanie uwagi na szczegóły każdego kroku prędzej czy później doprowadzi do sukcesu.
Podczas gdy instruktor może zrobić wszystko, co w jego mocy, aby przekazać i przewidzieć wszystkie możliwe upadki, które mogą wystąpić podczas tych operacji, "kreatywny" stażysta prawdopodobnie znajdzie kilka własnych!
Podstawy procedury są następujące. Łuk aorty wstępującej dawcy jest zespoleny koniec do boku do aorty brzusznej biorcy, a tętnica płucna dawcy jest zespolena koniec z żyłą główną dolną biorcy (IVC). Krew przepływa z aorty biorczej w sposób wsteczny przez aortę dawczą do tętnic wieńcowych. Po przepłynięciu przez układ wieńcowy krew spływa do prawego przedsionka przez zatokę wieńcową, jest pompowana do prawej komory, a następnie przez tętnicę płucną do biorcy IVC. W ten sposób układ wieńcowy jest zaopatrywany w krew tętniczą, a rytm zatokowy wraca do przeszczepu w ciągu 1-2 minut od reperfuzji. Ponieważ lewe komory serca są zasadniczo obciążone ciśnieniem, wolna ściana lewej komory z czasem zaniknie.
Protokół
Wszystkie zwierzęta były trzymane w warunkach wolnych od patogenów w University of Colorado Barbara Davis Center Animal Facility za zgodą IACUC i były pod opieką zgodnie z wytycznymi NIH.
Głębokość znieczulenia jest początkowo oceniana na podstawie uszczypnięcia palca u nogi i obserwacji częstości oddechów po rozpoczęciu zabiegu.
1. Żniwa z serc dawcy
- Znieczulić mysz dawcę, wstrzykując pentobarbital (60 mg/kg IP).
- Unieruchamij mysz za pomocą 4-kierunkowych pasów i przypnij futro. Przetrzyj skórę alkoholem.
- Po wypreparowaniu skóry otwórz jamę brzuszną, wykonując poprzeczne nacięcie tuż poniżej przepony.
- Przetnij przeponę z tyłu do przyczepu żebrowego i unieś przednią ścianę klatki piersiowej do przodu i górnie, odsłaniając serce.
- Rozciągnij na całej grubości, przetnij tylną boczną jamę piersiową po lewej i prawej stronie klatki piersiowej.
- Wyizoluj żyłę główną dolną (IVC) i umieść luźny jedwabny szew 5-0 wokół IVC w pobliżu jego wprowadzenia do prawego przedsionka.
- Wstrzyknąć 1,0 ml heparynizowanej soli fizjologicznej o temperaturze 4 °C (200 u/cm3) do IVC, a następnie podwiązać naczynie jedwabnym szwem 5-0 i podzielić.
- W podobny sposób wyizoluj prawą żyłę główną górną (rSVC) i podwiązaj za pomocą jedwabnego szwu 5-0 i podziel.
- Delikatnie przetoczyć serce w kierunku prawej strony zwierzęcia i odizolować lewą żyłę główną górną (lSVC), podwiązać jedwabnym szwem 5-0 i podzielić, odsłaniając lewą tętnicę płucną.
- Zabezpiecz serce pod mokrą gazą, podczas gdy grasica jest tępo wycięta z dala od głównej tętnicy płucnej (PA) oraz lewej i prawej gałęzi PA oraz wstępującego łuku aorty.
- Tępo wypreparuj łuk aorty z otaczających tkanek. Mikronożyczki służą do podziału aorty proksymalnie do prawej tętnicy ramienno-głowowej; tj. nie powinno być żadnych rozgałęzień między sercem a punktem podziału aorty.
- Ten odcinek łuku aorty tworzy mankiet tętniczy dla procesu implantacji.
- Odbijaj mankiet aorty niżej, aby odsłonić pień PA oraz lewą i prawą gałąź PA.
- Tępo wypreparuj lewą i prawą gałąź PA z dala od otaczających tkanek tak daleko od serca, jak to możliwe. Pozwala to na łatwe wypreparowanie tułowia PA z otaczających tkanek.
- Podziel pień PA tak dystalnie, jak to możliwe, tuż obok jego rozwidlenia. Ten odcinek tętnicy płucnej tworzy mankiet żylny dla procesu implantacji.
- Umieść jedwabny szew 5-0 wokół podstawy serca i zawiąż. Serce jest następnie odcinane u podstawy i umieszczane w roztworze soli fizjologicznej o temperaturze 4 °C. Całkowity czas zbioru wynosi ok. 10-15 min.
2. Technika implantu serca
- Znieczulić myszy biorcę pentobarbitalem (dawka początkowa 60 mg/kg IP, w razie potrzeby dawka uzupełniająca 25 mg/kg IP).
- Przytnij futro i unieruchamij mysz za pomocą 4-kierunkowych pasów, a następnie przygotuj skórę jodonem powidonu i ułóż w sterylny sposób.
- Wykonaj pionowe nacięcie brzucha o długości 2 cm w linii środkowej i wejdź do jamy brzusznej.
- Cofnij jelito wyżej i uzewnętrznione na klatkę piersiową. Przechowywać zawinięte w sterylną wilgotną gazę (sterylną sól fizjologiczną) w całym etui.
- Odizoluj aortę brzuszną i żyłę główną dolną (IVC) poniżej naczyń nerkowych i umieść bawełniane opaski 4-0 wokół aorty i IVC górne, a następnie poniżej miejsca zespolenia.
- Zidentyfikuj wszelkie naczynia lędźwiowe w terenie i podwiązaj za pomocą nylonowego szwu 10-0.
- Zawiąż bawełniane krawaty, najpierw niższe, a następnie lepsze. W ten sposób część krwi zostaje zatrzymana w aorcie, co ułatwia aortomię.
- Uformuj aortomię za pomocą igły 30 G, aby wprowadzić się do światła aorty. Przedłuż nacięcie cienkimi mikronożyczkami na długość około 2 mm. Nacięcie to wykonuje się w linii prostej wzdłuż osi podłużnej naczynia.
- Wykonaj zespolenie końca do boku aorty dawcy z aortą biorcy w następujący sposób. Umieść nylonowy szew podtrzymujący 10-0 w aorcie dawczej i do dolnego kąta nacięcia w aorcie biorcy i zawiąż. Umieść drugi nylon 10-0 naprzeciwko pierwszego w aorcie dawczej i górnym rogu nacięcia w aorcie brzusznej i zawiąż.
- Wykonaj biegnącą linię szwu od górnej do dolnej w bocznej ścianie aorty i przywiąż do wcześniej umieszczonego ściegu podporowego. Pamiętaj, aby zbliżyć błony wewnętrzne (wewnętrzną powierzchnię naczynia) do siebie podczas zszywania. Następnie zszyj przyśrodkową stronę w sposób biegowy i zawiąż. Pierwszy i ostatni ścieg z każdej strony należy umieścić jak najbliżej ściegów podporowych. Następnie staraj się mieć 3 równomiernie rozmieszczone ściegi między tymi dwoma, co daje w sumie 5 ściegów.
- Wykonać zespolenie końcowo-boczne tętnicy płucnej dawcy do biorcy IVC w następujący sposób. Nakłuć IVC igłą 30 G i przedłużyć nacięcie na ok. 2 mm cienkimi mikronożyczkami. Nacięcie to wykonuje się w linii prostej wzdłuż osi podłużnej naczynia.
- Przywiąż tętnicę płucną dawcy do dolnego rogu nacięcia w IVC nylonem 10-0. Umieść drugi nylon 10-0 naprzeciwko pierwszego w tętnicy dawczej i górny róg nacięcia w IVC i zawiąż.
- Wykonaj biegnącą linię szwów między tętnicą płucną a IVC i zawiąż. Pierwszy i ostatni ścieg z każdej strony należy umieścić jak najbliżej ściegów podporowych. Następnie staraj się mieć 5 równomiernie rozmieszczonych ściegów między tymi dwoma, co daje w sumie 7 ściegów.
- Zwolnij dystalną bawełnianą opaskę 4-0, przywracając przepływ żylny.
- Po zaobserwowaniu hemostazy zespolenia żylnego proksymalny krawat bawełniany 4-0 jest stopniowo rozluźniany, a zespolenie tętnicze obserwowane jest pod kątem hemostazy. Gdy oba zespolenia zostaną uznane za bezpieczne, zdejmij bawełniane opaski z myszy.
- Wróć do jelita brzusznego. Ściana brzucha jest zamknięta w dwóch warstwach za pomocą szwu 5-0 Silk w sposób ciągły.
- Podaj 1,0 ml bolusa sterylnego, ciepłego soli fizjologicznej do jamy brzusznej jako resuscytację płynową po zamknięciu, a po operacji wstrzykuje się podskórnie 0,8 ml soli fizjologicznej. Podczas zabiegu nie są wymagane żadne inne środki wspomagające. Odzyskaj zwierzę na kocu rozgrzewającym. Całkowity czas implantacji wynosi ok. 90-120 min dla początkujących, 45-60 min z doświadczeniem. Podawać analgezję buprenorfiną, 0,05 mg/kg, SC, 0,1-0,2 ml na początku zabiegu i co 6-12 godzin przez 72 godziny po operacji.
3. Ocena przeszczepu
- Oceń funkcję przeszczepu codziennie za pomocą badania palpacyjnego przezbrzusznego.
- Trzymaj mysz tak, jakby miała otrzymać zastrzyk dootrzewnowy.
- Delikatnie dociśnij czubek palca wskazującego do ściany brzucha i upewnij się, jaka jest siła bicia i regularność przeszczepu.
- Przyznaj jakość badania palpacyjnego w skali od 4 (normalna amplituda i częstotliwość) do 0 (odrzucony przeszczep bez bicia).
WAŻNE UWAGI:
Wszystkie narzędzia są sterylizowane, sterylne rękawiczki są noszone przez cały czas trwania zabiegu i utrzymywane jest sterylne pole. Operacje dawcy i biorcy wykonywane są przy użyciu mikroskopu operacyjnego. Upewnij się, że zespolenia są "czyste". Oznacza to, że tylne ściany nie są zaczepiane podczas zakładania szwów. Spowoduje to znaczne zwężenie przepływu, co najprawdopodobniej doprowadzi do nieudanego przeszczepu, a w skrajnych przypadkach do paraliżu kończyn tylnych. Niezwykle ważne jest również, aby uzyskać przejścia pełnej grubości, w tym przydankę naczyniową i błonę wewnętrzną igły do szwu. Odcięcie krawędzi zapewnia również kontakt między błonami wewnętrznymi, co pomaga w uszczelnianiu i gojeniu zespoleń. Kolejnym niezwykle ważnym czynnikiem jest zapewnienie, że napięcie linii szwów zespolenia jest również optymalne. Zbyt luźny i dojdzie do nieodwracalnego wycieku, spowoduje to zbyt ciasne i zwężenie przepływu. Jeśli po stronie tętniczej spowoduje to słabą perfuzję przeszczepu, jeśli po stronie żylnej dojdzie do przekrwienia serca.
Wyniki
Wykorzystanie tej techniki chirurgicznej otwiera drogę do prowadzenia zarówno prostych badań nad przeżyciem lub odrzuceniem przeszczepu, jak i bardzo złożonych protokołów eksperymentalnych. W badaniu krótko opisanym na poniższej rycinie staraliśmy się określić udział, o ile występuje, Fas i/lub perforyny jako mechanizmów odrzucenia serca pośredniczonego przez limfocyty T CD4. Stało się to możliwe dzięki niezwykłemu zestawowi szczepów myszy dostępnych obecnie w badaniach. Wyniki wykazują, że bezpośrednie odrzucenie alloprzeszczepów serca przez efektorowe limfocyty T CD4 wymaga alternatywnego wkładu ekspresji Fas w przeszczepie oraz ekspresji perforyny w limfocytach T. Według naszej wiedzy jest to pierwsze wykazanie, że aktywność cytolityczna limfocytów T CD4 może odgrywać niezbędną rolę w pierwotnym ostrym odrzuceniu alloprzeszczepu in vivo.
Rycina 1. Perforyna i Fas stanowią obligatoryjne i równoległe ścieżki odrzucania serca pośredniczonego przez limfocyty T CD4 Limfocyty T CD4 od myszy B6, B6 PFPKO (knock-out perforyny) oraz B6gld (z niedoborem liganda Fas) zostały wykorzystane do rekonstytucji biorców B6rag-/- z allograftami serca C3H typu dzikiego lub C3Hlpr z niedoborem Fas. Usunięcie samego Fas (♦, p=NS w porównaniu z kontrolą Wt C3H + limfocyty T CD4 B6) z serc dawcy lub usunięcie samej perforyny z limfocytów T CD4 (■, p=NS w porównaniu z kontrolą Wt C3H + limfocyty T CD4 B6) nie zniosło odrzucania. Co ciekawe, usunięcie FasL z efektorowych limfocytów T CD4 znacząco opóźniło odrzucanie (●, p < 0,02 w porównaniu z Wt C3H + limfocyty T CD4 B6, p < 0,01 w porównaniu z Wt C3H + limfocyty T CD4 B6 PFPKO oraz p < 0,01 w porównaniu z C3Hlpr + limfocyty T CD4 B6). Jednak większość allograftów nadal została odrzucona (4 z 5). Co istotne, jednoczesne usunięcie zarówno Fas dawcy, jak i perforyny z limfocytów T CD4 całkowicie zniosło odrzucanie (○, p < 0,002 w porównaniu z kontrolą Wt C3H + limfocyty T CD4 B6, Wt C3H + limfocyty T CD4 B6 PFPKO oraz C3Hlpr + limfocyty T CD4 B6). Zniesienie to było znacznie silniejsze niż w przypadku indywidualnego usunięcia FasL z limfocytów T CD4 (○, p < 0,003 w porównaniu z kontrolą Wt C3H + limfocyty T CD4 B6gld). Z Grazia et al10. Przedrukowano za zgodą.
Dyskusja
Ta technika chirurgiczna nie jest łatwa do opanowania, ale po opanowaniu jest potężnym narzędziem badawczym. Badacz/chirurg jest nagradzany za konsekwencję w technice i dbałość o szczegóły. Cierpliwość w fazie uczenia się jest kluczowa. Jak opublikowano przez Niimi3, za pomocą narzędzia do nauki opartego na wideo potrzeba średnio 11 prób, aby osiągnąć pierwszą udaną procedurę i 78 prób, aby osiągnąć 90% wskaźnik sukcesu. Filmy stały się ważnym narzędziem dydaktycznym w chirurgii11,12.
Rozwiązywanie problemów
Może dojść do krwawienia z zespoleń, które jest prawdopodobnie spowodowane albo brakiem prawidłowego napięcia w szwach, albo zbyt małą liczbą szwów. Chociaż środek wywołujący krzepnięcie, taki jak Gelfoam, może być przydatny do zmniejszania przecieków, zalecamy, aby chirurg polegał na dobrej technice. Przekrwienie niebijącego serca jest najczęściej spowodowane zbyt ciasnymi zespoleniami, szczególnie po stronie żylnej. Niebijący, nieperfundowany przeszczep jest często spowodowany przez pęcherzyk powietrza, który przemieścił się do jednej z tętnic wieńcowych. Ważne jest, aby utrzymywać pole od wilgotnego do mokrego, aby uniknąć przedostawania się pęcherzyków do naczyń.
Ograniczenia techniki
Ta technika nie jest odpowiednia, jeśli badacz chce zbadać wpływ na w pełni funkcjonujące serce. Wymagałoby to zastosowania techniki przeszczepu ortotopowego, która do tej pory okazała się niemożliwa do wykonania.
Znaczenie w odniesieniu do istniejących metod
Jeśli ktoś chce zbadać wpływ na w pełni unaczyniony, lity przeszczep narządów u myszy, to model serca jest prawdopodobnie najłatwiejszy do opanowania. Mysie modele przeszczepu płuc, nerek i wątroby istnieją, ale są znacznie trudniejsze do nauczenia i udoskonalenia.
Kluczowe kroki w ramach protokołu
Niezwykle ważne jest, aby uzyskać przejścia pełnej grubości, w tym przydankę naczyniową i błonę wewnętrzną igły do szwu. Odcięcie krawędzi zapewnia również kontakt między błonami wewnętrznymi, co pomaga w uszczelnianiu i gojeniu zespoleń. Kolejnym niezwykle ważnym czynnikiem jest zapewnienie, że napięcie linii szwów zespolenia jest również optymalne. Zbyt luźny i dojdzie do nieodwracalnego wycieku, spowoduje to zbyt ciasne i zwężenie przepływu. Jeśli po stronie tętniczej spowoduje to słabą perfuzję przeszczepu, jeśli po stronie żylnej dojdzie do przekrwienia serca.
Przede wszystkim powtarzalność, spójność procedury i ciągła dbałość o szczegóły przyniosą wspaniałe wyniki oraz dane, które można finansować i publikować.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować Dr. Biagio za jego wcześniejszą pracę w naszym laboratorium.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Instrument | Roboz # | Fine Science Tools # | Arosurgical # |
| Prosty kleszcz do mikropreparacji #5 | RS-5015 | 11295-51 | |
| Zakrzywiony kleszcz do mikropreparacji #7 | RS-5047 | 11297-00 | |
| Zakrzywiony ząbkowany kleszcz | RS-5137 | 11052-10 | |
| Nożyczki do mikropreparacji Vannas, krótkie | RS-5610 | 09.140.08 | |
| Nożyczki do mikropreparacji, proste, ostre, długie | 11.602.11 | ||
| igły z mikrouchwytem sprężynowym | 11.549.15 | ||
| do komarów prosty | 91308-12 | ||
| Nożyczki do mikropreparacji, proste, | RS-5962 | 14078-10 | |
| Nożyczki do mikropreparacji, zakrzywione, | RS-5981 | 14079-10 | |
| Mikro zwijacz | RS-6540 | ||
| Taca na instrumenty, 10" x 6 i frac12; ” x & frac34; " | RT-1350S | ||
| Szew jedwabny, 5/0, szpula 22,5 m | 18020-50 | ||
| Aplikatory bawełniane | marki Fisher, #23-400-100 | ||
| Waciki powidonowo-jodowe | PDI, #B40600 | ||
Bibliografia
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Heart transplantation in congenic strains of mice. Transplant Proc. 5 (1), 733 (1973).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343 (1973).
- Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: experience of 3,000 operations by one surgeon. J Heart Lung Transplant. 20 (10), 1123 (2001).
- Plenter, R. J., Zamora, M. R., Grazia, T. J. Four decades of vascularized heterotopic cardiac transplantation in the mouse. J Invest Surg. 26 (4), 223 (2013).
- Su, S., et al. Modified suture technique in a mouse heart transplant model. Asian J Surg. 34 (2), 86 (2011).
- Mao, M., et al. A novel and knotless technique for heterotopic cardiac transplantation in mice. J Heart Lung Transplant. 28 (10), 1102 (2009).
- Csencsits, K. L., Bishop, D. K. Contrasting alloreactive CD4+ and CD8+ T cells: there's more to it than MHC restriction. Am J Transplant. 3 (2), 107 (2003).
- Hasegawa, T., Visovatti, S. H., Hyman, M. C., Hayasaki, T., Pinsky, D. J. Heterotopic vascularized murine cardiac transplantation to study graft arteriopathy. Nat Protoc. 2 (3), 471 (2007).
- Linfert, D., Chowdhry, T., Rabb, H. Lymphocytes and ischemia-reperfusion injury. Transplant Rev. 23 (1), (2009).
- Grazia, T. J., et al. Acute cardiac allograft rejection by directly cytotoxic CD4 T cells: parallel requirements for Fas and perforin. Transplantation. 89 (1), 33 (2010).
- Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic heart transplantation in mice. J Vis Exp. (6), (2007).
- Plenter, R. J. Heterotopic heart transplantation in mice. European Society for Surgical Research. 45th Annual Congress. , (2010).
Przedruki i uprawnienia
